Summary
यह प्रोटोकॉल एक मध्यम आकार के इन्फ्रैक्ट और एक उत्कृष्ट जीवित रहने की दर के साथ एक अद्वितीय माउस स्ट्रोक मॉडल प्रदर्शित करता है। यह मॉडल प्रीक्लिनिकल स्ट्रोक शोधकर्ताओं को इस्किमिया अवधि का विस्तार करने, वृद्ध चूहों का उपयोग करने और दीर्घकालिक कार्यात्मक परिणामों का आकलन करने की अनुमति देता है।
Abstract
प्रायोगिक स्ट्रोक अनुसंधान में, इंट्राल्यूमिनल फिलामेंट के साथ मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (एमसीएओ) का व्यापक रूप से चूहों में इस्केमिक स्ट्रोक को मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाता है। फिलामेंट मकाओ मॉडल आमतौर पर सी 57बीएल / 6 चूहों में एक बड़े पैमाने पर मस्तिष्क रोधगलन प्रदर्शित करता है जिसमें कभी-कभी पीछे के सेरेब्रल धमनी द्वारा आपूर्ति किए गए क्षेत्र में मस्तिष्क के ऊतक शामिल होते हैं, जो काफी हद तक पश्चवर्ती संचार धमनी एट्रेसिया की उच्च घटनाओं के कारण होता है। फिलामेंट मकाओ के बाद दीर्घकालिक स्ट्रोक रिकवरी के दौरान सी 57बीएल /6 चूहों में देखी गई उच्च मृत्यु दर में इस घटना का एक प्रमुख योगदानकर्ता माना जाता है। इस प्रकार, कई क्रोनिक स्ट्रोक अध्ययन डिस्टल एमसीएओ मॉडल का फायदा उठाते हैं। हालांकि, ये मॉडल आमतौर पर केवल कॉर्टेक्स क्षेत्र में रोधगलन का उत्पादन करते हैं, और परिणामस्वरूप, पोस्ट-स्ट्रोक न्यूरोलॉजिकल घाटे का आकलन एक चुनौती हो सकती है। इस अध्ययन ने एक संशोधित ट्रांसक्रैनियल एमसीएओ मॉडल स्थापित किया है जिसमें ट्रंक पर एमसीए आंशिक रूप से या तो स्थायी रूप से या क्षणिक रूप से एक छोटी कपाल खिड़की के माध्यम से अवरुद्ध होता है। चूंकि रोड़ा स्थान एमसीए की उत्पत्ति के लिए अपेक्षाकृत समीपस्थ है, इसलिए यह मॉडल कॉर्टेक्स और स्ट्रेटम दोनों में मस्तिष्क क्षति उत्पन्न करता है। इस मॉडल के व्यापक लक्षण वर्णन ने वृद्ध चूहों में भी एक उत्कृष्ट दीर्घकालिक जीवित रहने की दर का प्रदर्शन किया है, साथ ही साथ आसानी से पता लगाने योग्य न्यूरोलॉजिकल घाटे का भी प्रदर्शन किया है। इसलिए, यहां वर्णित MCAO माउस मॉडल प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
Introduction
अमेरिका में हर साल लगभग 800,000 लोग स्ट्रोक से पीड़ित होते हैं, और इनमें से अधिकांशस्ट्रोक प्रकृति में इस्केमिक होते हैं। ऊतक प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर (टीपीए) और / या थ्रोम्बोक्टॉमी के साथ मस्तिष्क रक्त प्रवाह की समय पर बहाली वर्तमान में स्ट्रोक रोगियों के लिए सबसे प्रभावी उपचार है; हालांकि, लंबी अवधि में न्यूरोलॉजिक कार्यों की पूर्ण वसूली दुर्लभ 2,3 है। इस प्रकार, कार्यात्मक सुधार को लक्षित करने वाले उपन्यास स्ट्रोक थेरेपी की खोज अनुसंधान का एक गहन क्षेत्र है जिसके लिए स्ट्रोक के नैदानिक रूप से प्रासंगिक पशु मॉडल की आवश्यकता होती है।
कृन्तकों में सबसे आम इस्केमिक स्ट्रोक मॉडल स्ट्रोक को प्रेरित करने के लिए इंट्राल्यूमिनल मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (एमसीएओ) का उपयोग करता है। इस मॉडल में, शुरू में 1989 में ज़ेया लोंगा द्वारा विकसित, एक नायलॉन फिलामेंट को आंतरिक कैरोटिड धमनी (आईसीए) में पेश किया जाता है ताकि मध्य सेरेब्रल धमनी (एमसीए) 4 में रक्त प्रवाह को अवरुद्ध किया जा सके। हालांकि, इस मॉडल की सीमाएं हैं। सबसे पहले, जब फिलामेंट को आईसीए में डाला जाता है, तो पीछे के सेरेब्रल धमनी (पीसीए) में रक्त प्रवाह आंशिक रूप से अवरुद्ध हो सकता है, खासकर चूहों में। गंभीर रूप से, पश्चवर्ती संचार धमनी (पीसीओएमए), एक छोटी धमनी जो पूर्वकाल और पीछे के सेरेब्रल परिसंचरण को जोड़ती है, अक्सर कुछ माउस उपभेदों में अविकसित होती है, जैसे कि सी 57बीएल / 6, तनाव मुख्य रूप से प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। माना जाता है कि पीसीओएमए की यह पैटेंसी स्ट्रोक5 के बाद चूहों में घाव के आकार में परिवर्तनशीलता में योगदान करती है। दरअसल, जब एमसीएओ के दौरान पीसीए में रक्त का प्रवाह तेजी से गिरता है, और पीसीओए पर्याप्त संपार्श्विक रक्त प्रवाह प्रदान करने में असमर्थ होता है, तो स्ट्रोक इन्फ्रैक्ट पीसीए के क्षेत्र में फैल सकता है। इसके अलावा, इस मॉडल में, इस्किमिया की एक लंबी अवधि चूहों में मृत्यु दर की उच्च संभावना की ओर ले जाती है। नतीजतन, 30-60 मिनट की एक छोटी MCAO अवधि आमतौर पर चूहों में उपयोग की जाती है। हालांकि, अधिकांश स्ट्रोक रोगियों को उपचार से पहले इस्किमिया के कुछ घंटों का अनुभव होता है। इस प्रकार, इस्किमिया की विस्तारित अवधि के साथ एक माउस स्ट्रोक मॉडल उच्च नैदानिक प्रासंगिकता का है।
इस प्रक्रिया का समग्र लक्ष्य चूहों में इस्केमिक स्ट्रोक को मॉडल करना है जिनके पास मध्यम आकार का इन्फ्रैक्ट और एक उत्कृष्ट जीवित रहने की दर है। यह ट्रांसक्रैनियल एमसीएओ मॉडल नैदानिक स्ट्रोक की महत्वपूर्ण विशेषताओं को संबोधित करता है, क्योंकि लंबे समय तक इस्किमिया किया जा सकता है, और वृद्ध चूहे इस मॉडल को अच्छी तरह से सहन करते हैं, जिससे कार्यात्मक वसूली के दीर्घकालिक मूल्यांकन की अनुमति मिलती है।
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Protocol
इस काम में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को अनुसंधान में जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाता है, और प्रोटोकॉल को ड्यूक इंस्टीट्यूट एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए युवा (8-10 सप्ताह के) और वृद्ध (22 महीने के) पुरुष सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में चित्रित किया गया है।
1. सर्जिकल तैयारी
- सकल असामान्यताओं और व्यवहार घाटे के लिए माउस की जांच करें।
नोट: सर्जरी से पहले, सर्जनों के लिए सर्जिकल मास्क, टोपी, दस्ताने और गाउन सहित उचित पीपीई (सुरक्षात्मक व्यक्तिगत उपकरण) पहनना महत्वपूर्ण है। - माउस का वजन करें; शरीर के वजन के आधार पर वेंटिलेटर ( सामग्री की तालिका देखें) को प्रोग्राम करें।
- माउस को एनेस्थीसिया इंडक्शन बॉक्स में x 7 में x 4 में 4 में रखें। ऑक्सीजन प्रवाह मीटर ( सामग्री की तालिका देखें), 30 पर सेट, और नाइट्रस ऑक्साइड प्रवाह मीटर, 70 पर सेट चालू करें। 5% आइसोफ्लुरेन के साथ वेपोराइज़र चालू करें।
- गाइड तार को 20 ग्राम अंतःशिरा (IV) कैथेटर में डालें।
- माउस को इंडक्शन बॉक्स से बाहर निकालें जब इसकी श्वसन दर 30-40 सांस प्रति मिनट तक कम हो जाए।
- माउस को लापरवाह स्थिति में सर्जिकल बेंच पर रखें। माउस की जीभ को बाहर खींचें और इसे बाएं हाथ की उंगलियों से पकड़ें। मुखर कॉर्ड की कल्पना करने के लिए जानवर के मुंह में एक लैरींगोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) डालें।
- दाईं मध्य उंगली का उपयोग करके लैरींगोस्कोप पर माउस ठोड़ी को स्थिर करें। 20 जी IV कैथेटर को पकड़ने के लिए बाएं हाथ को मुक्त करें।
- गाइड तार को मुखर कॉर्ड में थोड़ा डालें, और फिर धीरे-धीरे 20 जी IV कैथेटर को श्वासनली में धक्का दें जब तक कि कैथेटर का विंग हिस्सा नाक की नोक के साथ भी न हो जाए।
नोट: माउस चल रहा है, तो तार सम्मिलित न करें। इससे श्वासनली को आघात और रक्तस्राव हो सकता है। - वेंटिलेटर चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें), और इसे माउस में इंट्यूबेटेड 20 जी IV कैथेटर के साथ कनेक्ट करें। आइसोफ्लुरेन को 1.5% तक कम करें, और सुनिश्चित करें कि दोनों फेफड़े यांत्रिक रूप से हवादार हैं।
नोट: आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को कम करने के लिए मत भूलना। अन्यथा, माउस को संज्ञाहरण का ओवरडोज प्राप्त होगा। - दोनों आंखों पर आंखों का मरहम लगाएं और 5 मिलीग्राम / किग्रा कार्प्रोफेन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
- माउस को एक पार्श्व स्थिति में रखें जिसमें दाहिना अस्थायी क्षेत्र ऊपर की ओर हो। हीटिंग पैड (35 डिग्री सेल्सियस) और तापमान नियामक द्वारा नियंत्रित हीट लैंप का उपयोग करके रेक्टल तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- दाईं आंख और कान के बीच सतह क्षेत्र को शेव करें, और आयोडीन और अल्कोहल स्वैब के साथ कम से कम तीन बार सर्जिकल क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।
2. मकाओ सर्जरी
- मकाओ सर्जरी के लिए बाँझ उपकरण पैकेज खोलें। बाँझ दस्ताने पहनें और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके दाईं आंख और दाहिने कान के बीच 1 सेमी त्वचा चीरा लगाएं।
नोट: त्वचा के रंग, शरीर के तापमान और हर 15 मिनट में पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की निगरानी करें। - अस्थायी और मालिश करने वाली मांसपेशियों को उजागर करने के लिए अंतर्निहित प्रावरणी को बल के साथ विच्छेदित करें।
नोट: पैरोटिड ग्रंथि को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें। - अस्थायी मांसपेशी के निचले हिस्से को छूने और जाइगोमैटिक आर्क के स्थान का पता लगाने के लिए बल का उपयोग करें। चेहरे की तंत्रिका की शाखाओं को ध्यान से खींचें।
- अस्थायी मांसपेशी पर 5 मिमी अनुप्रस्थ चीरा काटने के लिए एक उच्च तापमान वाले कॉटरी लूप ( सामग्री की तालिका देखें) की नोक का उपयोग करें।
- अंतर्निहित जाइगोमैटिक आर्क को विच्छेदित करने और मैक्सिला और जाइगोमैटिक हड्डियों के बीच के जोड़ को उजागर करने के लिए दो बलों का उपयोग करें।
- जाइगोमैटिक आर्क के 3 मिमी हिस्से को काटने और इसे हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें। खोपड़ी के आधार से मालिश की मांसपेशियों को अलग करें।
नोट: रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस और सतही अस्थायी नस को फ्रैक्चर न करने के लिए सावधान रहें। - कपाल खोपड़ी के आधार को उजागर करने के लिए अलग-अलग दिशाओं में स्थित चार छोटे रिट्रैक्टर लागू करें, जिसमें ट्राइजेमिनल तंत्रिका शाखाओं को एक रिट्रैक्टर द्वारा पार्श्व रूप से खींचा जाता है।
नोट: कपाल आधार की बाहरी सतह पर एक सल्कस ललाट और लौकिक लोब के बीच पार्श्व विदर के स्थान को चिह्नित करता है। एमसीए यहां स्थित है (चित्रा 2 ए), और इसकी ट्रंक और शाखाएं पतली, पारदर्शी खोपड़ी (चित्रा 2 बी) के माध्यम से दिखाई देती हैं। अन्य प्रमुख सेरेब्रल धमनियों के साथ इस धमनी का संबंध चित्रा 2 ए में प्रदर्शित किया गया है। - एमसीए ट्रंक के ऊपर खोपड़ी पर 0.9% सामान्य खारा की बूंद और रिनल कॉर्टेक्स की शाखा के समीप लागू करें। खोपड़ी को पतला करने के लिए एक विद्युत ग्राइंडर का उपयोग करें जब तक कि एक छोटा फ्रैक्चर दिखाई न दे।
नोट: खोपड़ी के खिलाफ ग्राइंडर को धक्का न दें, क्योंकि यह खोपड़ी में प्रवेश कर सकता है और अंतर्निहित धमनी को घायल कर सकता है। - पतली खोपड़ी को उठाने और इसे हटाने के लिए बल की नोक का उपयोग करें। शाम चूहों के लिए, यहां रुकें, और धमनी को बंद न करें।
नोट: एमसीए ट्रंक के पार एक छोटी आयताकार खिड़की बनाई गई है। - एमसीए (चित्रा 2 सी) के शीर्ष पर काले चोटी वाले रेशम का एक एकल-स्ट्रैंड लूप रखें। 8-0 डालें एमसीए ट्रंक को उठाने के लिए माइक्रोसर्जिकल सुई, और सुई के नीचे सीवन (सामग्री की तालिका देखें) को बांधें, सुई के दोनों सिरों को रेशम धागा लूप गाँठ के शीर्ष पर छोड़ दें (चित्रा 2 डी)।
- क्षणिक MCAO के लिए, धमनी रक्त प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए रेशम के धागे की गाँठ को सुई के नीचे थोड़ा कस लें (चित्रा 2E), जो MCAO की शुरुआत का प्रतिनिधित्व करता है।
- सीवन को पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें, और धीरे-धीरे इस्किमिया के अंत में सुई को हटा दें (उदाहरण के लिए, 60 मिनट या उससे अधिक)।
नोट: जब सुई को हटा दिया जाता है, तो रेशम के धागे की गाँठ एमसीए से फिसल जाती है, और मस्तिष्क को फिर से जोड़ा जाता है (चित्रा 2 एफ)। - स्थायी MCAO के लिए, धमनी के चारों ओर रेशम धागे के लूप को मजबूती से कसें, और सुई को हटा दें। अतिरिक्त सीवन सामग्री को काटें और हटा दें।
- त्वचा के चीरे पर 0.25% बुपिवैकेन की एक बूंद लागू करें, और रुक-रुक कर 6-0 नायलॉन सीवन का उपयोग करके मांसपेशियों और त्वचा को अलग से सिकोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। त्वचा चीरा की सतह पर एंटीबायोटिक मरहम लगाएं।
नोट: त्वचा चीरा को बाँझ स्टेपल या गोंद के साथ भी बंद किया जा सकता है।
3. पोस्ट-सर्जिकल देखभाल
- माउस को जगाने के लिए आइसोफ्लुरेन को बंद कर दें। सहज श्वसन बहाल होने पर वेंटिलेटर को डिस्कनेक्ट करें।
- माउस को एक नियंत्रित तापमान के साथ एक पुनर्प्राप्ति कक्ष ( सामग्री की तालिका देखें) में स्थानांतरित करें।
- माउस को तब बाहर निकालें जब उसका दाहिना रिफ्लेक्स बहाल हो जाए, या यह हिलना शुरू कर दे।
- तापमान- और आर्द्रता-नियंत्रित कक्ष में माउस की बारीकी से निगरानी करें। पूर्ण चेतना प्राप्त करने के बाद माउस को घर के पिंजरे में वापस करें (वसूली अवधि ~ 2 घंटे)। 3 दिनों के लिए रोजाना 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन का सेवन करें।
4. लेजर स्पॉट कंट्रास्ट इमेजिंग (एलएससीआई)
- छह और 24 घंटे बाद मकाओ, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर एनेस्थेटाइज्ड माउस माउंट करें। सिर के शीर्ष को शेव करें, और आयोडीन और अल्कोहल के तीन वैकल्पिक स्वैब के साथ इसे साफ करें।
नोट: एनेस्थेटाइजेशन चरण 1.3 में उल्लिखित के रूप में किया गया था। एलएससीआई भी MCAO से पहले किया जाता है। - 3 सेमी मध्य रेखा त्वचा चीरा बनाएं और खोपड़ी से त्वचा को विच्छेदित करें। खोपड़ी के शीर्ष को उजागर करने के लिए चार छोटे सुई रिट्रैक्टर लागू करें।
- लेजर स्पॉट कैमरा ( सामग्री की तालिका देखें) को सिर के ऊपर ले जाएं, और कैमरे के फोकस को समायोजित करें। सेरेब्रल रक्त प्रवाह की छवि।
5. 2,3,5-ट्राइफेनिलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला
- प्रयोग के अंत में 5% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज करें, आमतौर पर स्ट्रोक के बाद 1, 3, या 28 वें दिन। यह सुनिश्चित करने के लिए पूंछ को पिंच करें कि कोई दर्द प्रतिक्रिया नहीं है।
- सर्जिकल कैंची का उपयोग करके माउस को हटा दें और मस्तिष्क की कटाई करें। 20 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे खारे में मस्तिष्क को इनक्यूबेट करें।
- मस्तिष्क को बर्फ पर मस्तिष्क स्लाइसर मैट्रिक्स में रखें और मस्तिष्क पर ठंडा खारा गिराएं। पतले रेजर ब्लेड का उपयोग करके मस्तिष्क को 1 मिमी स्लाइस में काटें।
- मस्तिष्क के स्लाइस को एक ही अभिविन्यास में 2% टीटीसी समाधान के पकवान में डुबोएं ( सामग्री की तालिका देखें)। पकवान को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में रखें।
नोट: सामान्य मस्तिष्क ऊतक लाल हो जाता है और इस्केमिक ऊतक सफेद रहता है। - 24 घंटे के निर्धारण के लिए मस्तिष्क स्लाइस को 10% फॉर्मेलिन में स्थानांतरित करें। मस्तिष्क स्लाइस की छवि बनाएं और इन्फ्रैक्ट क्षेत्र को मापें।
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Representative Results
एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्यक्ष दृश्य के साथ, यह नेत्रहीन रूप से पुष्टि की जा सकती है कि इस्किमिया के दौरान एमसीए रक्त प्रवाह अवरुद्ध है। हमारे पिछले अध्ययन ने लेजर डॉपलर मॉनिटर6 का उपयोग करके इस्केमिक क्षेत्र में >80% रक्त प्रवाह में कमी दिखाई। पोस्ट-एमसीएओ रक्त प्रवाह परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए, एलएससीआई का उपयोग इस्केमिक अपमान और रीपरफ्यूजन की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 1)। दरअसल, चित्रा 3 ए में, यह देखा गया है कि सही एमसीए के क्षेत्र में रक्त की आपूर्ति कम हो गई थी। क्षणिक MCAO के लिए, सीवन को हटाने के बाद, सेरेब्रल रक्त प्रवाह का पुनरावृत्ति स्पष्ट था (चित्रा 3 बी), और 24 घंटे बाद इसमें और सुधार हुआ (चित्रा 3 सी)। स्ट्रोक मस्तिष्क को 24 घंटे के बाद विभाजित किया जा सकता है और टीटीसी के साथ दाग दिया जा सकता है। मृत ऊतक ने टीटीसी के साथ प्रतिक्रिया नहीं की, और सफेद रहा (चित्रा 1)। टीटीसी स्टेनिंग ने प्रदर्शित किया कि यह मॉडल कॉर्टिकल और लेटरल स्ट्रेटम दोनों क्षेत्रों में इन्फ्रैक्टेड ऊतक उत्पन्न करता है, और यह कि फिलामेंट एमसीएओ (चित्रा 4) की तुलना में इन्फ्रैक्ट आकार मध्यम है। इस मॉडल को युवा और वृद्ध जानवरों पर लागू किया गया है, और अवलोकन7 के 28 दिनों में एक नगण्य मृत्यु दर (<5%) पाई गई थी।
यह मॉडल मोटर और संवेदी घाटे का कारण बनता है, मुख्य रूप से बाएं सामने के पंजे में। हमारे पिछले अध्ययन स्ट्रोक चूहों में न्यूरोलॉजिकल घाटे दिखाते हैं, जैसा कि सिलेंडर परीक्षण, ओपन फील्ड टेस्ट, टेप रिमूवल टेस्ट, पोल टेस्ट और वॉन फ्रे फिलामेंट टेस्ट 6,8,9,10 जैसे विभिन्न व्यवहार परीक्षणों से पता चलता है। ट्रांसक्रैनियल एमसीएओ के 90 मिनट के अधीन चूहों ने शाम-संचालितचूहों की तुलना में संज्ञानात्मक घाटे का भी प्रदर्शन किया। यद्यपि ट्रांसक्रैनियल एमसीएओ के बाद दीर्घकालिक कार्यात्मक परिणाम वृद्ध चूहों में व्यवस्थित रूप से जांच नहीं की गई है, वृद्ध चूहों में एक समान मॉडल ने स्पष्ट रूप से स्ट्रोक7 के बाद 28 दिनों में न्यूरोलॉजिकल घाटे को दिखाया।
चित्र 1: प्रोटोकॉल का अवलोकन। सही एमसीए चूहों में एक छोटी खोपड़ी की खिड़की के माध्यम से क्षणिक या स्थायी रूप से अवरुद्ध होता है। टीटीसी स्टेनिंग और एलएससीआई का उपयोग क्रमशः इन्फ्रैक्ट आकार निर्धारित करने और पोस्ट-इस्किमिया सेरेब्रल रक्त प्रवाह का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: ट्रांसक्रैनियल एमसीएओ सर्जरी के चरण । (ए) लिगेटेड एमसीए का स्थान। (बी) एमसीए ट्रंक और इसकी शाखाओं का प्रदर्शन। (ग) रेशम सीवन का एक एकल किनारा एमसीए के ऊपर रखा जाता है। (D) 8-0 एमसीए ट्रंक को उठाने के लिए सुई का उपयोग किया जाता है, और सीवन को सुई के नीचे बांधा जाता है। (ई) रक्त प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए सीवन को थोड़ा कड़ा किया जाता है। (एफ) सुई और सीवन को हटा दिया जाता है ताकि रीपरफ्यूजन की अनुमति मिल सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: विलंबित रीपरफ्यूजन के साथ एमसीएओ में लेजर स्पॉट कंट्रास्ट छवियां । (ए) दाहिने गोलार्ध में कम छिड़काव क्षेत्र (लाल तीर) था, जो इस्किमिया का संकेत देता है। (बी) इस्किमिया के 6 घंटे के बाद, सीवन को हटा दिया गया ताकि रीपरफ्यूजन की अनुमति मिल सके, और धमनी शाखाएं दिखाई देने लगीं। (सी) 24 घंटे के बाद, इन धमनी शाखाओं में रक्त प्रवाह छिड़काव में सुधार हुआ था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: फिलामेंट एमसीएओ से अंतर (ए) स्याही-संक्रमित मस्तिष्क मस्तिष्क की सतह पर रक्त वाहिकाओं को दर्शाता है। लाल तीर एमसीए ट्रंक को इंगित करता है, जिसे इस ट्रांसक्रैनियल एमसीएओ मॉडल में दर्शाया गया है। हरा तीर एमसीए मूल को इंगित करता है, जो फिलामेंट एमसीएओ मॉडल में एमसीए रोड़ा की साइट है। टीटीसी से सना हुआ ब्रेन स्लाइड्स पर स्ट्रोक के 24 घंटे बाद ब्रेन इन्फ्रैक्ट दिखाई देता है। यहां नमूने (बी) एक युवा माउस में फिलामेंट एमसीएओ के 60 मिनट से हैं, और (सी) युवा (8-10 सप्ताह की उम्र) में स्थायी ट्रांसक्रैनियल एमसीएओ, और (डी) सी 57बीएल / 6 चूहों (22 महीने पुराने) से हैं। सामान्य ऊतक लाल होता है, और रोधगलित ऊतक सफेद होता है। इस मॉडल में इन्फ्रैक्ट आकार मध्यम है, और इन्फ्रैक्टेड क्षेत्र में कॉर्टेक्स और स्ट्रेटम दोनों शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
पहला ट्रांसक्रैनियल एमसीए रोड़ा मॉडल 1981 11,12 में चूहों में स्थापित किया गया था, और 1989 4 में नो-क्रैनेक्टोमी एमसीएओ मॉडल द्वारा प्रतिस्थापित किया गयाथा। प्रारंभिक ट्रांसक्रैनियल एमसीए रोड़ा में एक विस्तृत शल्य चिकित्सा क्षेत्र था, जैसे कि पूरे जाइगोमैटिक आर्क को हटा दिया गया था और मांसपेशियों को पार्श्व रूप से खींचा गया था। सर्जरी के बाद स्थानीय ऊतकों में सूजन आ गई थी, जिससे तनाव पैदा हुआ और जानवरों के लिए भोजन का सेवन कम हो गया। हमारे संशोधित ट्रांसक्रैनियल मकाओ मॉडल में, चीरा कम आक्रामक है, और जाइगोमैटिक आर्क का केवल एक छोटा सा खंड हटा दिया जाता है। सर्जिकल क्षेत्र को चार छोटे सुई रिट्रैक्टर्स का उपयोग करके उजागर किया जाता है, और कोई रक्त वाहिका या तंत्रिकाएं नष्ट नहीं होती हैं। एक छोटी खोपड़ी की खिड़की पर्याप्त है क्योंकि एमसीए ट्रंक को 8-0 का उपयोग करके उठाया जाता है। सर्जिकल सीवन सुई, और पूरी सुई को एमसीए के तहत जाने की आवश्यकता नहीं है। सर्जरीके बाद कोई स्थानीय ऊतक सूजन नहीं पाई गई।
इस मॉडल के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह एक इन्फ्रैक्ट क्षेत्र का उत्पादन करता है जिसमें कॉर्टेक्स और सब-कॉर्टेक्स दोनों क्षेत्र शामिल हैं, और इस प्रकार, न्यूरोलॉजिकल घाटे का आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है। दूसरा, इस मॉडल में क्षणिक और स्थायी इस्केमिक स्ट्रोक दोनों को प्रेरित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, एक विस्तारित इस्केमिक अवधि को देर से रीपरफ्यूजन की नकल करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमारे पिछले स्ट्रोक अध्ययन में, 6 घंटे का एमसीएओसफलतापूर्वक 9 किया गया था। तीसरा, संपार्श्विक रक्त की आपूर्ति और रीपरफ्यूजन के लिए पीसीओएमए पर निर्भरता न्यूनतम है, जो स्ट्रोक की गंभीरता की परिवर्तनशीलता को कम करती है। अंत में, लगभग सभी चूहे, यहां तक कि वृद्ध चूहे, दीर्घकालिक कार्यात्मक अध्ययन से बच सकते हैं। एक साथ लिया गया, यह मॉडल उत्कृष्ट नैदानिक प्रासंगिकता प्रदर्शित करता है।
ध्यान दें, इस स्ट्रोक मॉडल की सीमाएं हैं। सबसे पहले, माइक्रोसर्जिकल कौशल के एक उच्च स्तर की आवश्यकता होती है। एक नौसिखिया पशु सर्जन को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत क्रैनियोटॉमी और एमसीए बंधाव को पूरा करने के लिए कुछ समय की आवश्यकता हो सकती है। पीसने, खोपड़ी हटाने और सीवन प्लेसमेंट का सावधानीपूर्वक निष्पादन इस मॉडल को सफलतापूर्वक लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, प्रत्येक जानवर के लिए एक ही स्थान पर एमसीए को स्थापित करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, इस मॉडल में सुई से मेनिंगेस थोड़ा क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, जिन्हें मेनिंगेस पर केंद्रित अध्ययनों के लिए विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। अंत में, हालांकि एक इस्केमिक अवधि >6 घंटे का प्रदर्शन किया जा सकता है, लेजर डॉपलर या लेजर स्पॉट इमेजिंग के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह को मापकर रीपरफ्यूजन की पुष्टि की जानी चाहिए।
सारांश में, यह संशोधित माउस स्ट्रोक मॉडल मध्यम मस्तिष्क क्षति को प्रेरित करता है, वृद्ध और स्ट्रोक कोमोर्बिडिटी जानवरों में दीर्घकालिक अस्तित्व प्रयोगों को करने में सक्षम बनाता है, और स्ट्रोक के परिणामों में सुधार के लिए प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान और नई दवा के विकास को आगे बढ़ाने की उम्मीद है।
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Disclosures
सभी लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक अपने संपादकीय समर्थन के लिए कैथी गेज को धन्यवाद देते हैं। योजना के आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे। इस अध्ययन को एनेस्थिसियोलॉजी विभाग (ड्यूक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर) और एनआईएच अनुदान (NS099590, HL157354, NS117973 और NS127163) से धन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% sodium chloride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) | Sigma or any available vendor | ||
| 20 G IV catheter | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| 4-0 silk suture | Look | SP116 | Black braided silk |
| 8-0 suture with needle | Ethilon | 2822G | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia induction box | Any suitable vendor | Pexiglass make | |
| Electrical grinder | JSDA | JD 700 | |
| High temperature cautery loop tip | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser doppler perfusion monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Lubricant eye ointment | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Mouse rectal probe | Physitemp | RET-3 | |
| Nitrous Oxide | Airgas | UN1070 | |
| Otoscope | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum Otoscope served as a laryngoscope to visualize vocal cords in mice |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| Recovery box | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injectable 50 mg/mL |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Temperature controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibioric & pain relief | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizer | RWD | R583S |
References
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741 (2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646 (2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391 (2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
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