Summary
Denne protokol beskriver forskellige metoder, der kan hjælpe i studiet af ATG9A-biologi, herunder immunofluorescens efterfulgt af billedanalyse, forbigående overekspressionsovervejelser og undersøgelse af ATG9A-glykosyleringsstatus ved hjælp af western blot.
Abstract
Autofagi er en meget bevaret vej, som cellen bruger til at opretholde homeostase, nedbryde beskadigede organeller, bekæmpe invaderende patogener og overleve patologiske tilstande. Et sæt proteiner, kaldet ATG-proteiner, udgør kerneautofagimaskineriet og arbejder sammen i et defineret hierarki. Undersøgelser i de senere år har forbedret vores viden om autofagivejen. Senest er det blevet foreslået, at ATG9A vesikler er kernen i autofagi, da de styrer den hurtige de novo-syntese af en organel kaldet fagophoren. Undersøgelsen af ATG9A har vist sig udfordrende, da ATG9A er et transmembranprotein, og det er til stede i forskellige membranrum. Som sådan er forståelse af dens menneskehandel et vigtigt element for at forstå autofagi. Her præsenteres detaljerede metoder, der kan bruges til at studere ATG9A og især dens lokalisering ved hjælp af immunofluorescensteknikker, som kan vurderes og kvantificeres. Faldgruberne ved forbigående overekspression behandles også. Den korrekte karakterisering af ATG9A-funktionen og standardiseringen af teknikker til analyse af dens handel er afgørende for yderligere at karakterisere begivenhederne for autofagiinitiering.
Introduction
ATG9A er det eneste transmembranprotein i kerneautofagimaskineriet og handles mellem Golgi og et cytosolisk ATG9A vesikelrum, der passerer gennem det endosomale rum1. Efter længe at have været gådefuld er ATG9A for nylig blevet beskrevet som en lipidscramblase, da den ligevægter lipider på tværs af membrandobbeltlag 2,3. Det er nu klart, at ATG9A befinder sig øverst i hierarkiet i autofagosomdannelse, og dets undersøgelse er derfor afgørende for forståelsen af autofagi 4,5. Som sådan er ATG9A vesikler for nylig blevet foreslået som "frøet" af autofagosomet 6,7. Tidligere undersøgelser har imidlertid vist, at ATG9A kun forbigående interagerer med det dannende autofagosomet på forskellige trin i dets modning og ikke integreres i den autofagiske membran 6,8,9,10,11. Således er der behov for yderligere undersøgelser for fuldstændigt at opklare ATG9A's rolle og potentielle flere funktioner i autofagosomdannelse. Uoverensstemmelsen mellem de nuværende modeller og de tidligere data kan imidlertid kun løses gennem målrettede eksperimenter til bekæmpelse af ulovlig handel med ATG9A ved hjælp af validerede kvantitative tilgange og intracellulære markører.
Der er forskellige værktøjer i brug til at studere ATG9A, hver med fordele og ulemper, og brugen af disse værktøjer kompliceres af strukturen af ATG9A, dens molekylære funktion og cellulær handel 2,8,12. ATG9A danner en homotrimer, glykosyleres og handles gennem cellen til rum som Golgi, endosomerne og plasmamembranen13,14. På grund af sin komplekse rejseplan er der flere udfordringer med at fortolke aflæsninger såsom ATG9A-spredning fra Golgi ved specifikke behandlinger eller stimuli (såsom næringsstof og serumsult). ATG9A er ekstremt dynamisk med hensyn til vesikulær handel; ATG9A-holdige vesikler er faktisk blevet defineret som ATG9A-rummet i forbindelse med sultinduceret autofagi. ATG9A-rummet, dannet af disse dynamiske vesikler, interagerer forbigående med flere intracellulære organeller 8,15,16,17. De teknikker, der er beskrevet her, herunder immunofluorescens, levende billeddannelse og glykosyleringsassays, bør hjælpe med påvisning og forståelse af ATG9A-biologi. Især vil de tilgange, der er beskrevet i denne artikel, hjælpe med at løse spørgsmål om lokalisering til specifikke cellulære rum og interaktioner med specifikke proteinpartnere og / eller membranrum. Da ATG9A hydrofob konserveret kernedomæne (PFAM-domæne PF04109) har en unik topologi og ATG9A-cyklusser mellem flere membranrum, bør forskere være opmærksomme på visse faldgruber og artefakter, når de forbigående overudtrykker ATG9A, herunder, men ikke begrænset til, endoplasmatisk retikulum (ER) tilbageholdelse. Andre mulige problemer kan opstå på grund af forkert foldning af proteinet, kunstig aggregering under normale vækstbetingelser eller utilstrækkelig påvisning af vesikulært rum på grund af suboptimale permeabiliseringsprotokoller for immunofluorescens.
Ved billeddannelse af endogen ATG9A skal der tages hensyn til prøveforberedelse og billedoptagelse for at sikre kvaliteten af den efterfølgende kvantitative analyse og den korrekte fortolkning af dataene. Kombination af de teknikker, der er beskrevet i denne artikel, med standard biokemiske tilgange (såsom immunudfældning eller pull-down eksperimenter, der ikke er beskrevet her) bør forbedre vores forståelse af ATG9A-funktionen. Dette eksperimentelle værktøjssæt er beregnet til at hjælpe nye forskere med at navigere i nogle af de analyser, der kræves for at bestemme funktionen af ATG9A i deres biologiske system.
Protocol
Alle de reagenser, der anvendes i denne undersøgelse, er kommercielt tilgængelige, bortset fra ATG9A DNA-konstruktioner og hjemmelavet STO-215-antistof (se materialetabel), som er tilgængelige efter anmodning. De analyseværktøjer, der beskrives her, er baseret på open source-software (FIJI/ImageJ)18.
1. Cellekultur
- Oprethold HEK293A celler i en T150-vævskulturbehandlet kolbe til 80% -90% sammenløb i DMEM med højt glukoseindhold (Dulbeccos modificerede ørnemedium) suppleret med 10% FBS (føtalt bovint serum) og 4 mM L-glutamin (se materialetabel). Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet vævskulturkuvøse ved 10 % CO2.
BEMÆRK: HEK293A celler anvendes i denne undersøgelse, da de har et robust kanonisk autofagirespons på aminosyresult, som især påvises ved en stigning i lipideret, membranassocieret LC3 1,9,19 og er egnede til billeddannelse. - Cellerne ledes gennem aspiratering af substratet fra kolben ved hjælp af en serologisk pipette. Cellerne vaskes en gang med 15 ml 1x PBS (fosfatbufret saltvand) eller en lignende opløsning, før der tilsættes 2 ml Trypsin-EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) opløsning for at løsne cellerne. Saml de løsrevne celler med 8 ml DMEM, og frø et antal celler tilbage, så 80% -90% sammenløb nås efter 2 dage til de her beskrevne eksperimenter.
2. Endogen farvning af ATG9A
- Frø HEK293A celler (eller celler efter eget valg) på sterile nr. 1.5 glasdæksler anbragt i en 24-brøndplade, så de er ~ 80% sammenflydende den næste dag. Dette giver typisk 7 x 104 celler/hul i 500 μL DMEM.
BEMÆRK: For HEK293A celler eller andre løst klæbende cellelinjer skal dæksedlerne overtrækkes med poly-D-lysin ved 0,1 mg / ml i deioniseret vand. Tilsæt 500 μL poly-D-lysin (se materialetabel) på toppen af dæksedlerne, der er anbragt i hullerne i 10 minutter ved stuetemperatur (RT), efterfulgt af tre vaske med deioniseret vand og en sidste vask i DMEM. Fortsæt med såning af cellerne efter belægningen, og pas på, at de er jævnt fordelt i kulturskålen. - Behandl cellerne i henhold til de specifikke eksperimentelle betingelser (dvs. sult i 2 timer i EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]).
BEMÆRK: EBSS-sammensætningen er 1 g/l D-glucose, 6,8 g/L NaCl, 0,4 g/L KCl, 0,151 g/L CaCl 2,2H 2 O, 0,2 g/L mM MgSO 4,7H 2 O, 0,124 g/LNaH2HPO4,2H 2 O og 2,2 g/L NaHCO 3 (se tabel over materialer) opløst i destilleret vand. - Opsug mediet, og udskift det forsigtigt med 500 μL 4% formaldehydopløsning i PBS suppleret med 0,1 mM CaCl2 og 0,1 mMMgCl2 i 20 minutter ved RT for at fiksere cellerne.
- Opsug 4% formaldehydopløsningen fra hvert hul, erstat den med 500 μL PBS. Gentag dette vasketrin tre gange. Lad ikke dækslerne tørre ud eller forblive uden væske.
- De frie aldehydgrupper slukkes ved hjælp af 500 μL 50 mMNH4Cl-opløsningi PBS i 10 minutter ved RT.
- Opsug PBS, og erstat det med 500 μL af en 50 μg/ml digitoninopløsning i PBS (stamopløsning 1 mg/ml i deioniseret vand, se materialetabel) i 5 minutter ved RT for at permeabilisere cellerne.
- Digitoninopløsningen suges ud af hvert hul, og erstattes med 500 μL PBS. Gentag dette vasketrin tre gange.
- PBS suges ud af hvert hul, og erstattes med 500 μL blokerende opløsning (5 % BSA [bovin serumalbumin] fortyndet i PBS) i 30 minutter ved RT.
- Opsug blokeringsopløsningen, og erstat den med 500 μL PBS.
- Brug en pincet til at samle dæksedlerne fra brønden, fjern forsigtigt den overskydende PBS-opløsning ved hjælp af tynde vævsservietter eller cellulosefilterpapir, og læg forsigtigt hver dækseddel med cellesiden nedad på en 50 μL dråbe primær antistofopløsning (f.eks. armensk hamster 14F2 fortyndet til 0,9 μg/ml i 1% BSA/PBS-opløsning, se materialetabel). Der inkuberes i et befugtet kammer i 1 time ved RT.
BEMÆRK: For nem håndtering kan dråberne af antistofopløsning placeres på et ark selvforseglende termoplastisk film (se materialetabel) i en anden beholder i stedet for direkte på en fast overflade. - Dæksedlerne samles med pincet, og efter forsigtigt at have drænet den overskydende primære antistofopløsning ved hjælp af tynde vævsservietter, skal dækslerne (cellesiden opad) udskiftes i 24-brøndpladen og vaskes tre gange med PBS.
- Gentag trin 2.10. Brug en pincet til at samle dæksedlerne fra hvert hul, dræn forsigtigt overskydende PBS af med tynde vævsservietter, og læg forsigtigt hver dæksel (cellesiden nedad) på en 50 μL dråbe sekundær antistofopløsning fortyndet 1:1.000 i 1% BSA/PBS-opløsning (f.eks. Cy3 Goat Anti-Armenian Hamster IgG, som har minimal krydsreaktivitet med kvæg, mennesker, serumproteiner fra mus, kaniner og rotter, se Materialetabel). Der inkuberes i et befugtet kammer i 1 time ved RT.
BEMÆRK: Valgfrit: En cytoskeletmarkør kan bruges ud over det sekundære antistof til den efterfølgende billedanalyse (dvs. Alexa Fluor 647 Phalloidin fortyndet 1: 1.000, se materialetabel). For nem håndtering kan dråberne af antistofopløsning placeres på et ark tætningsfilm i en anden beholder i stedet for direkte på en fast overflade. - Dæksedlerne opsamles med en pincet, og efter at overskydende sekundær antistofopløsning er drænet, anbringes dækslerne i 24-brøndpladen (cellesiden opad) og vaskes tre gange med 500 μL PBS.
- Med en pincet opsamles dæksedlerne, overskydende PBS tømmes forsigtigt af med tynde servietter, og hver dæksel (med cellesiden nedad) lægges forsigtigt ned på en 50 μL dråbe 1:4.000 Hoechst-opløsning (Hoechst 33342) i PBS. Inkuber i et fugtighedskammer i 5 minutter ved RT.
BEMÆRK: For nem håndtering kan dråberne af antistofopløsning placeres på et ark tætningsfilm i en anden beholder i stedet for direkte på en fast overflade. - Dæksedlerne opsamles med en pincet, og efter forsigtigt at have tømt den overskydende Hoechst-opløsning af med tynde servietter sættes dæksedlerne på igen i pladen med 24 huller, og der vaskes tre gange med PBS og én gang med deioniseret vand (500 μL pr. vask).
- Tøm forsigtigt det overskydende deioniserede vand ved hjælp af tynde vævsservietter, og læg forsigtigt hver dæksel (cellesiden nedad) på en 10-20 μL dråbe monteringsopløsning (se materialetabel), der er spottet på et mikroskopglas for immunfluorescens, undgå dannelse af luftbobler.
BEMÆRK: Det monteringsmedium, der anvendes her, har samme brydningsindeks som nedsænkningsolie og hærder efter et par timer ved RT eller natten over ved 4 °C. Ikke-hærdende monteringsløsninger kan bruges, men man skal sørge for at forsegle dækslet med neglelak. - Fjern den overskydende monteringsopløsning ved aspiration, og lad prøverne tørre, mens de ligger fladt på RT natten over i mørket, enten i en glideholder eller dækket med aluminiumsfolie.
3. Optagelse af billeder
- Tænd for det konfokale mikroskop. Åbn billedbehandlingssoftwaren (se Materialetabel) for at starte opsætningen af billedoptagelsen.
- På fanen Funktion skal du vælge objektivobjektivet Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 for at tage billederne til analyse.
- På fanen Anskaffelsesfunktion skal du tænde de relevante lasere i laserzonen på kontrolpanelet (Argon, Diode-405-30, DPSS 561-10 og HeNe633).
- I zonen Billedopsætning i Kontrolpanel skal du oprette fire spor, hvor hvert spor svarer til en kanal, for at udføre sekventiel hentning.
- Indstil den passende opløsning af billederne i vinduet Anskaffelsestilstand . Indstil opløsningen til 1.024 x 1.024 (Billedstørrelse), og vælg en bitdybde på 16-bit.
- For hver kanal skal du justere lasereffekten og forstærkningen for at opnå et godt signal uden mættede pixels, hvilket ville hæmme billedintensitetsanalysen. Brug Live-knappen til at indstille laserudgangsniveauet og forstærkning (master).
BEMÆRK: Det anbefales at bruge områdeindikatorindstillingen til registrering af mættede pixel. Hold lasereffekten mellem 1 % og 10 % og forstærkningen (master) under 850 for at undgå baggrundsstøj. - I zonen Kanaler i Kontrolpanel skal du indstille den samme pinhole-blænde for hver kanal under hensyntagen til 1 Airy Unit (AU) for kanalen med den højeste bølgelængde.
- Hent 10 tilfældige felter, der indeholder lignende mængder celler (20-30 celler pr. Felt). Erhvervelsen af 100-200 celler pr. tilstand vil give god effekt til den senere billedanalyse.
4. Billedanalyse af ATG9A-spredning
- Download FIJI-software fra internettet (se materialefortegnelsen). Åbn billedet med FIJI ved at klikke på Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer.
- Klik på Analysér > Indstil målinger, og vælg den gennemsnitlige grå værdi i målevinduet for intensitetsanalysen.
- Klik på Image > Color > Split Channels, og adskil kanalerne i tre billeder (Golgi-markør, cytoskelet, ATG9A-signal).
- Gå til Billede > Juster > tærskel, og definer en tærskel i kanalen, der svarer til Golgi-markøren.
- Klik på Rediger > markering > Opret markering, og opret en markering fra det binære billede.
- Gå til Rediger > valg > Føj til Manager > Omdøb (Golgi), gem markeringen i ROI-styringen, og omdøb den til Golgi.
- Klik på Billede > Juster > tærskel, og definer en tærskel i kanalen, der svarer til cytoskeletmarkøren, for at definere cellekonturen.
- Gå til Rediger > markering > Opret markering, og opret en markering ud fra det binære billede.
- Klik på Rediger > valg > Føj til Manager > Omdøb (Total), gem markeringen i ROI-manageren, og omdøb den til Total.
- Vælg det billede, der svarer til ATG9A-farvningen.
- I Analyse > måling skal du anvende ROI Golgi ved at klikke på den og måle intensiteten af Golgi-regionen.
- Klik på Analysér > mål, anvend ROI-totalen ved at klikke på den, og mål intensiteten af den samlede region.
- Gentag proceduren i alle billederne, gem resultaterne som .csv filer, og behandl dataene ved hjælp af følgende formel:
ATG9A spredningshastighed = Golgi-intensitet/samlet intensitet
5. Levende cellebilleddannelse af ATG9A-konstruktioner
- Frø HEK293A celler (eller celler efter eget valg) i 2 ml medium i en 60 mm vævskulturskål, så de når ~ 65% -70% sammenløb den næste dag; Dette giver typisk 1 x 10 6-2 x 106 celler.
- Den følgende dag skal du forberede lipofektamin: DNA-blandinger (eller et passende alternativt DNA-transfektionsreagens, se materialetabel) som følger:
- Afhængigt af konstruktionsekspressionseffektiviteten fortyndes 0,5-2 μg plasmid-DNA i 100 μL af et egnet serumfrit medium, og opløsningen blandes forsigtigt ved pipettering op og ned. Inkuber blandingen i 5 minutter ved RT.
BEMÆRK: Plasmid-DNA-konstruktionen er eksperimentspecifik. Forskere kan enten klone alene eller få fra forfatterne efter anmodning. - Fortynd lipofectamin 2000 transfektionsreagens i et forhold på 3: 1 lipofectamin: DNA i 100 μL af et passende serumfrit medium og bland forsigtigt opløsningen ved pipettering op og ned. Inkuber denne blanding i 5 minutter ved RT.
- Bland begge opløsninger sammen ved forsigtigt pipettering op og ned og inkubation i 20 minutter ved RT.
- Afhængigt af konstruktionsekspressionseffektiviteten fortyndes 0,5-2 μg plasmid-DNA i 100 μL af et egnet serumfrit medium, og opløsningen blandes forsigtigt ved pipettering op og ned. Inkuber blandingen i 5 minutter ved RT.
- Tilsæt lipofectamin: DNA-blandingen til hver cellekulturplade, der indeholder 4 ml vækstmedium, og vugge forsigtigt pladen frem og tilbage for at fordele blandingen jævnt. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet cellekulturkuvøse ved 10 % CO2.
- Substratet erstattes med frisk vækstmedium 4 timer efter transfektion, og cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet cellekulturinkubator ved 10% CO2 natten over.
- Den næste dag trypsiniseres, tælles og gensås cellerne på dyrkningsskåle, der er egnede til levende cellemikroskopi (kulturskåle med en nr. 1.5 glasdæksel, se materialetabel). Frø 0,4 x 10 6-0,7 x 106 celler på skålene for at nå ~ 60% -75% sammenløb på dæksedlen på billeddannelsestidspunktet.
BEMÆRK: Belægning med poly-D-lysin, som forklaret i trin 2.1, anbefales til HEK293A celler. - Den næste dag (48 timer efter transfektion) skal du afbilde cellerne.
6. Undersøgelse af glykosyleringstilstanden for ATG9A
- Frø HEK293A celler (eller celler efter eget valg) i en 10 cm vævskulturskål, så de når ~ 80% sammenløb den næste dag, hvis man planlægger at undersøge endogen ATG9A, hvilket typisk giver 1,5 x 10 6-2,5 x 106 celler i 10 ml. Alternativt kan du så cellerne, så de når ~65%-70% sammenløb, hvis ATG9A transfekteres, hvilket typisk giver 1 x 10 6-1,5 x 106 celler i 10 ml.
- Cellerne behandles med 100 μg/ml cyclohexamid (CHX, se materialetabel) eller vehikel næste dag. Inkuber i 24 timer (eller indtil et ønsket tidspunkt).
- Fjern cellerne fra inkubatoren, aspirer mediet og læg det på is. Udskift den med 5 ml iskold 1x PBS. Afmonter cellerne fysisk fra skålen ved hjælp af en celleskraber, og pipette PBS-celleopløsningen i et 15 ml konisk bundrør. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere cellerne.
- Opsug supernatanten, og resuspender cellerne i ~100 μL (afhængigt af cellepillens størrelse) af iskold TNTE-lysebuffer (1% Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA) suppleret med proteasehæmmercocktailtabletter (se materialetabel) og overfør til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Inkuber lysatet på is i 15 min. Derefter centrifugeres lysatet ved 20.000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at sedimentere kernerne og det uopløselige affald, og supernatanten overføres til et frisk mikrocentrifugeglas.
- Kvantificer proteinkoncentrationen af lysatet ved hjælp af Bradford-metoden20 og et spektrofotometer, der kan måle ved en bølgelængde på 595 nm.
- Normaliser proteinmængderne, og kombiner 16 μL lysat (indeholdende højst 100 μg protein i alt) med 5x PNGase F (peptid: N-glycosidase F) buffer i henhold til producentens anvisninger, før der tilsættes 1 μL PNGase F-enzym (se materialetabel). Inkuber som anvist af PNGase F-producenten.
- Der tilsættes et volumen på 3x Laemmli prøvebuffer for at opnå en koncentration på 1x, og inkuberes ved 65 °C i 5 minutter før påfyldning til elektroforese ved hjælp af en Tris-acetatgel for at maksimere udskillelsen af proteiner. Overfør proteinerne fra gelen til en passende membran (dvs. PVDF [polyvinylidendifluorid]) ved hjælp af standard western blot-protokoller21 (se materialetabel).
BEMÆRK: Kogning af prøverne ved 95 °C vil medføre, at ATG9A aggregeres, hvilket reducerer detektionen af ATG9A. - Udfør den vestlige blotvægt ved hjælp af specifikke antistoffer mod ATG9A (STO-215-antistof, produceret internt1) (se materialetabel). Lad membranens sektion med højere molekylvægt være uskåret for at visualisere de højere ATG9A-molekylvægtarter.
Representative Results
ATG9A er et transmembranprotein forbundet med flere intracellulære membranrum 8,17,22,23,24. Under basale forhold er ATG9A hovedsageligt lokaliseret ved trans-Golgi-netværket (TGN), som indikeret ved immunofluorescensen af det endogene protein og overlapningerne med GM130, en cis-Golgi-markør (figur 1A) såvel som i små vesikler, der delvist overlapper det endocytiske genbrugsrum (ERC)23. ATG9A-lokalisering ved Golgi kan detekteres ved hjælp af forskellige immunfluorescensprotokoller. Imidlertid kan den vesikulære fraktion af ATG9A såvel som dens ændring af lokalisering, især stigningen i vesikulær pool, som reaktion på specifikke stimuli såsom næringsstof og serumsult, være ret variabel i intensitet og vanskelig at visualisere med konventionelle billeddannelsesmetoder. Forholdet mellem ATG9A lokaliseret ved Golgi og ATG9A lokaliseret til en vesikulær fraktion kaldes ATG9A spredningshastigheden. For at detektere ændringer i ATG9A-spredningshastigheden, for eksempel ved EBSS-behandling, som bruges til at nedbryde både serum og aminosyrer, er en Golgi-markør såsom GM130 eller TGN46 og en cytoskeletmarkør såsom Phalloidin, der pletter cellekonturen25, nyttige til let at kvantificere ATG9A-spredningen (figur 1B). Det er vigtigt, at analysen af det gennemsnitlige fluorescensforhold kun kan fortolkes som et komparativt mål mellem betingelser snarere end som en fast spredningshastighed. Forholdet mellem rum afhænger i høj grad af biologiske og ikke-biologiske faktorer såsom den anvendte cellelinje, farvningskvaliteten eller de anvendte tærskelværdier (figur 1B). Af denne grund skal forskeren oprette en rørledning, der er i stand til at detektere ATG9A Golgi-berigelse under deres specifikke eksperimentelle forhold og derefter udvide analysen med de samme parametre til alle billederne i det sæt, der skal analyseres. Repræsentative binære billeder og områder udvalgt til analyse af ATG9A gennemsnitlig fluorescens er vist som vejledning i figur 1B.
ATG9A har flere transmembrandomæner flankeret af to relativt fleksible og ustrukturerede N- og C-terminale domæner, hvoraf C-terminalsekvensen omfatter næsten halvdelen af proteinet12. Det er vigtigt, at lokaliseringsmønsteret for overudtrykt ATG9A kan påvirkes af, hvilken proteinende der er mærket (figur 2A). Især når man bruger forbigående ekspressionssystemer og mærker ATG9A direkte på sin N-terminal med et fluorescerende mærke (f.eks. eGFP, mRFP eller derivater), kan dets Golgi-lokalisering delvist kompromitteres med mindre berigelse set under basale (dvs. fodrede) forhold, mens ATG9A-vesiklerne stadig er let synlige (figur 2A). Mærkning af ATG9A på sin C-terminal synes at fremkalde større GFP-positive klynger lidt, der kunne aggregeres. Endelig viser en monomere version af mRFP-ATG9A også lignende fluorescerende klynger af vesikler og lidt Golgi-farvning i overekspressive celler (figur 2A).
ATG9A foldes i ER-membranen, før den bliver handlet til Golgi- og ATG9A-vesiklerne. Under sit ophold på skadestuen bliver ATG9A modificeret af N-bundne glycaner på Asparagine 99, og når den når Golgi, erhverver den komplekse, modne N-bundne glycaner 1,14. Denne modifikation ved glykosylering kan detekteres gennem western blot ved udseendet af et dobbeltbånd14. I overensstemmelse med dets intracellulære lokalisering har de fleste endogene ATG9A komplekse N-bundne glycaner, og derfor er båndet med højere molekylvægt dominerende, med et svagt bånd med lavere molekylvægt også synligt (figur 2B). Tilstedeværelsen af et dobbeltbånd ses lettest ved anvendelse af Tris-acetatgeler til at forbedre opløsningen af proteiner med højere molekylvægt (figur 2B, kontrol, t = 0). Når det endogene protein udsættes for PNGase F (Peptide: N-glycosidase F) behandling, som fjerner de fleste af de komplekse N-bundne glycaner, kører proteinet som et enkelt bånd (figur 2B, PNGase F, t = 0). Derfor kan den N-bundne glykosyleringsstatus for ATG9A bruges som en proxy til at overvåge udgangen af ATG9A fra ER til Golgi, hvilket afspejles af det relative forhold mellem de to bånd.
Når transfektering af mRFP-ATG9A konstruerer forbigående, akkumuleres det overudtrykte protein oprindeligt i ER, muligvis fordi smuglermaskineriet ikke er i stand til at folde og trafikere hele ATG9A, og det lavere molekylvægtbånd er fremherskende (figur 2C, kontrol t = 0). Især efter 24 timers ekspression af mRFP-ATG9A er der omtrent en lige fordeling mellem de øvre og nedre bånd, hvilket tyder på, at mRFP-ATG9A-puljen bevæger sig ind i Golgi (figur 2C, kontrol, t = 24). Hvis cellerne behandles med cycloheximid (CHX), som blokerer de novo proteinsyntese26, kan foldning og udgang af ATG9A fra ER afklares. Da det endogene protein er foldet, glykosyleret og bosiddende i Golgi, ændrer behandling med CHX ikke signifikant forholdet mellem båndene med lavere og højere molekylvægt (figur 2B, kontrol). Ved anvendelse af den forbigående ekspression af mRFP-ATG9A fremmer CHX-behandlingen imidlertid akkumuleringen af det højere molekylvægtbånd (figur 2C, kontrol, CHX t = 24). Den højere molekylvægt, der er overudtrykt mRFP-ATG9A-båndet, kollapser i det nedre bånd efter behandling med PNGase F (figur 2C, PNGase F, t = 24). Disse data viser, at det endogene protein hurtigt erhverver modne glycaner, hvilket afspejles af overvejelsen af det højere molekylvægtbånd, og CHX-jagten påvirker ikke forholdet mellem dobbeltbåndene (figur 2B). I tilfælde af forbigående overudtrykt mRFP-ATG9A inducerer CHX-behandling akkumulering af det øvre bånd, hvilket indikerer, at mere modne glycaner erhverves, når ER-puljen foldes og forlader ER til Golgi (figur 2C).
Tilføjelsen af en linker mellem ATG9A-sekvensen og fluorescerende tags kan være nyttig til at fremme en mere fysiologisk lokalisering og handel med proteinet. Sammensmeltning af en 3x-FLAG-sekvens (24 aminosyrer) mellem en N-terminal fluorofor og ATG9A hjælper det overudtrykte protein med at opføre sig på samme måde som det endogene (figur 3). Faktisk er overudtrykt mCherry-3xFLAG-ATG9A colokaliseret med Golgi-markøren GM130 under fodrede forhold (figur 3A). Det er vigtigt, at denne lokalisering og ATG9A vesikulære rum bevares over tid, hvilket muliggør den rumlige tidsmæssige undersøgelse af handel med ATG9A (figur 3B).
Figur 1: Billedanalyse af endogen ATG9A-lokalisering. (A) Repræsentativt immunfluorescensbillede af endogent ATG9A (rødt), GM130 som en Golgi-markør (grøn) og Phalloidin til visualisering af actincytoskelettet (cyan). Skalabjælke = 10 μm. (B) Workflow af billedanalysen for at bestemme den brøkdel af endogen ATG9A, der lokaliserer i Golgi-området. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af fluorescerende mærkede ATG9A-konstruktioner ved lokalisering og glykosylering . (A) eGFP N-terminalt mærket ATG9A er mindre lokaliseret ved Golgi og befinder sig primært i vesiklerne. eGFP C-terminalt mærket ATG9A udviser aggregater i cellen (nogle eksempler er markeret med hvide pilespidser; eGFP-ATG9A og ATG9A-eGFP er i grønt). mRFP N-terminalt mærket ATG9A er mindre lokaliseret ved Golgi og befinder sig primært i vesiklerne. N angiver den omtrentlige placering af cellekernen, og mRFP-ATG9A er i rødt. Skalabjælke = 5 μm. (B) Endogene ATG9A fremstår som to bånd, når de analyseres af western blot (pilespidser): et øvre bånd (komplekse N-bundne glycaner) og et nedre bånd (ingen modne N-bundne glycaner). Behandling med cyclohexamid (CHX) påvirker ikke forholdet mellem de øvre og nedre bånd. Behandling med PNGase F forårsager forsvinden af det øvre bånd. (C) Efter forbigående transfektion af mRFP-mærket ATG9A i HEK293A celler er to fremtrædende bånd synlige på western blot (pilespidser). Behandling med PNGase F forårsager forsvinden af det øvre bånd. Behandling med CHX efter transfektion fører til øget glykosylering, da puljen af transfekteret ATG9A handles fra skadestuen til Golgi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Analyse af mCherry-3xFLAG-ATG9A-lokalisering ved immunofluorescens og levende billeddannelse. (A) Immunofluorescensforsøg med HEK293A celler, der forbigående overudtrykker mCherry-3xFLAG-ATG9A og farves med Golgi-markøren GM130. Skalabjælke = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A er i rødt, og GM130 Golgi-markøren er i grønt. (B) Montage fra live-imaging eksperimenter i HEK293A celler, der forbigående overudtrykker mCherry-3xFLAG-ATG9A. N angiver kernens omtrentlige placering. Tidsramme = 1 fps. Skalabjælke = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A er i rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne undersøgelse illustrerer de forskellige værktøjer, der kan bruges til at undersøge ATG9A-lokalisering. For det første beskriver denne undersøgelse, hvordan ATG9A kan visualiseres ved immunofluorescens, og hvordan dette kan kvantificeres. For det andet sammenlignes strategier, der kan bruges til at mærke ATG9A med en fluorescerende markør til visualisering i enten faste eller levende celler. Endelig beskriver dette arbejde, hvordan man undersøger og bruger glykosyleringstilstanden for ATG9A til at afgøre, om ATG9A har forladt skadestuen og handlet gennem Golgi.
Med hensyn til karakterisering af endogen ATG9A-lokalisering ved immunofluorescens skal der udvises forsigtighed med de fikserings- og permeabiliseringsmetoder, der anvendes til forsøget. Ifølge de her beskrevne standardprocedurer er paraformaldehydfiksering kombineret med digitoninpermeabilisering gode betingelser for at visualisere både Golgi-associerede ATG9A- og ATG9A-positive vesikler7. Sammen med fiksering og permeabilisering er tidspunktet for inkubation med den primære antistofopløsning også kritisk. Vi har observeret, men ikke dokumenteret, at højere koncentrationer af primær antistofopløsning og længere inkubationstider kan føre til en misvisende stigning i Golgi-farvningen af ATG9A, hvilket i sidste ende kompromitterer påvisningen af ATG9A-omfordeling til andre membranrum. Da ATG9A desuden er til stede i mange intracellulære rum 1,13,17,22,23,24,27,28, er det vigtigt at bruge specifikke membranmarkører sammen med ATG9A til at identificere, hvor ATG9A er placeret. Flere tilgange er tidligere blevet brugt til at kvantificere ATG9A-lokalisering, herunder Pearsons korrelationskoefficient for colokalisering29. Den delvise overlapning af ATG9A med Golgi og det særskilte vesikulære rum fører imidlertid til et stort antal pixeloutliers, hvilket kan skævvride fortolkningen af korrelationskoefficienten. Af denne grund foretrækkes en mere forenklet tilgang baseret på forholdet mellem den gennemsnitlige fluorescens i de to rum, der skal analyseres, og denne tilgang er mindre følsom over for celle-for-celle-variabilitet. For yderligere information om billedanalyse gennem mikroskopi henvises læserne til denne bog kapitel30.
Når man undersøger glykosyleringsstatus for ATG9A, er valget af geler til kørsel af de vestlige blots vigtigt. Til denne protokol foretrækkes 3% -8% Tris-acetatgeler, fordi de tilbyder den højeste opløsning til større proteiner, men alternative gelsammensætninger eller løbende buffere, der tilbyder en god adskillelse af proteiner med høj molekylvægt, kan også anvendes. Eksperimentatoren kan sikre maksimal adskillelse af proteiner ved at øge elektroforesetiden.
Ved tilberedning af prøverne til visualisering af ATG9A på western blot, skal man passe på ikke at koge prøverne efter tilsætning af Laemmli bufferen; kogning ved 95 °C inducerer dannelsen af ATG9A-aggregater, og efterfølgende migrerer ATG9A ikke effektivt ind i gel1. Det anbefales at opvarme prøverne til 65 °C i 5 minutter27.
Høje niveauer af transfektion fører normalt til højere akkumulering af ATG9A i ER, mens moderate ekspressionsniveauer hjælper den fysiologiske lokalisering af proteinet. Anekdotisk hjælper inkubationstider på 72 timer i stedet for 48 timer ofte med at reducere ER-lokaliseringsartefakter. Især kan mRFP-ATG9A nøjagtigt rapportere om ATG9A-handel og funktion, hvis niveauerne kontrolleres gennem ekspressionsniveauer eller ved hjælp af stabile cellelinjer 8,9,22,27.
Manglende evne hos en population af overudtrykt ATG9A til at erhverve modne N-bundne glycaner kan bruges som en aflæsning for forstyrret ATG9A-handel. Ved mutering eller sletning af visse regioner af ATG9A er der risiko for øget ER-tilbageholdelse, hvilket kan føre til manglende erhvervelse af modne N-bundne glycaner og dermed et hurtigere migrerende ATG9A-bånd på western blot. Forskere, der arbejder med afkortede ATG9A-konstruktioner, bør kontrollere for ER-tilbageholdelse, glykosyleringstilstande og Golgi-lokalisering.
Til levende cellebilleddannelse af ATG9A giver et Airyscan-mikroskop, der er afhængig af den hurtige Airyscan-funktion, optimal opløsning på typisk ca. 120 nm. For lokaliseringsnøjagtighed er billedhastigheder på omkring 1-2 billeder pr. sekund (fps) i superopløsningstilstand optimale, afhængigt af hvor mange kanaler der afbildes. Lignende konfokale mikroskoper, der kan afbilde med høj hastighed, kan også bruges til billeddannelse af ATG9A-vesikler; Det skal dog bemærkes, at billedhastigheden direkte kan påvirke påvisning af hændelser og derfor påvirke fortolkningen af dataene.
Sammenfattende beskriver de præsenterede protokoller måder at kvantificere og karakterisere ATG9A-lokalisering ved immunofluorescens, levende cellemikroskopi og dens glykosyleringsstatus. Disse protokoller kan hjælpe forskere, der arbejder med ATG9A og hjælpe med at undgå nogle faldgruber.
Disclosures
S.A.T. sidder i det videnskabelige rådgivende udvalg for Casma Therapeutics.
Acknowledgments
Forfatterne takker Rocco D'Antuono for korrekturlæsning af aspekter af manuskriptet samt alle nuværende og tidligere medlemmer af MCBA-laboratoriet (Molecular Cell Biology of Autophagy) for de diskussioner, der førte til forfining af disse protokoller. A. v.V., SDT, EA, SAT, blev støttet af The Francis Crick Institute, som modtager sin kernefinansiering fra Cancer Research UK (CC2134), UK Medical Research Council (CC2134). Denne forskning blev finansieret helt eller delvist af Wellcome Trust (CC2134). Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig ophavsretslicens på enhver forfatteraccepteret manuskriptversion, der opstår som følge af denne indsendelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 60 mm tissue culture dish | Thermofisher Scientific | 10099170 | For tissue culture |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofisher Scientific | A22287 | Actin stain |
| anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
| anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
| anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
| ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
| ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Bemis Parafilm | Thermofisher Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
| CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
| D-Glucose | / | For EBSS | |
| Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
| DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
| eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
| FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
| Hoechst | Thermofisher Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
| KCl | / | For EBSS | |
| L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
| LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
| MgCl2 | / | For PBS | |
| MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
| Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
| NaCl | / | For EBSS | |
| NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
| NaHCO3 | / | For EBSS | |
| NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofisher Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermofisher Scientific | 31985062 | For Cell Transfection |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
| pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
| PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
| Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
| Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
| RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Triton X-100 | Thermofisher Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
| Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
| Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |
References
- Young, A. R., et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).
- Maeda, S., et al. lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).
- Matoba, K., et al. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).
- Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).
- Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. Autophagy genes in biology and disease. Nature Reviews: Genetics. , (2023).
- Sawa-Makarska, J., et al. Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation. Science. 369 (6508), (2020).
- Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure. Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085 (2020).
- Orsi, A., et al. Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).
- Judith, D., et al. ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).
- Karanasios, E., et al. Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nature Communications. 7, 12420 (2016).
- Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).
- Guardia, C. M., et al. Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery. Cell Reports. 31 (13), 107837 (2020).
- Soreng, K., et al. SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2. EMBO Reports. 19 (4), e44837 (2018).
- Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).
- Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis. Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).
- Takahashi, Y., et al. The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs. Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).
- Imai, K., et al. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation. Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- van Vliet, A. R., et al. ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation. Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269 (2020).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting. Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).
- Lamb, C. A., et al. TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic. EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).
- Longatti, A., et al. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).
- Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy. Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).
- DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities. BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Webber, J. L., Tooze, S. A. Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP. EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).
- Claude-Taupin, A., et al. ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization. Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).
- Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization - Co-occurrence versus correlation. Journal of Cell Science. 131 (3), 211847 (2018).
- D'Antuono, R. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).
