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Biology

इमेजिंग एटीजी 9 ए, एक बहु-फैलाव झिल्ली प्रोटीन

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65349
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, 1
1Molecular Cell Biology of Autophagy, The Francis Crick Institute, 2MRC Laboratory of Molecular Biology
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल विभिन्न तरीकों का वर्णन करता है जो एटीजी 9 ए जीव विज्ञान के अध्ययन में मदद कर सकते हैं, जिसमें इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद छवि विश्लेषण, क्षणिक ओवरएक्प्रेशन विचार और पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके एटीजी 9 ए ग्लाइकोसिलेशन स्थिति की जांच शामिल है।

Abstract

ऑटोफैगी एक अत्यधिक संरक्षित मार्ग है जिसका उपयोग कोशिका होमियोस्टैसिस को बनाए रखने, क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल को नीचा दिखाने, हमलावर रोगजनकों का मुकाबला करने और रोग स्थितियों से बचने के लिए करती है। प्रोटीन का एक सेट, जिसे एटीजी प्रोटीन कहा जाता है, में कोर ऑटोफैगी मशीनरी शामिल होती है और एक परिभाषित पदानुक्रम में एक साथ काम करती है। हाल के वर्षों में अध्ययनों ने ऑटोफैगी मार्ग के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार किया है। हाल ही में, यह प्रस्तावित किया गया है कि एटीजी 9 ए पुटिकाएं ऑटोफैगी के केंद्र में हैं, क्योंकि वे फागोफोर नामक एक ऑर्गेनेल के तेजी से डी नोवो संश्लेषण को नियंत्रित करते हैं। एटीजी 9 ए का अध्ययन चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है, क्योंकि एटीजी 9 ए एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है, और यह विभिन्न झिल्ली डिब्बों में मौजूद है। जैसे, ऑटोफैगी को समझने के लिए इसकी तस्करी को समझना एक महत्वपूर्ण तत्व है। यहां, विस्तृत तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं जिनका उपयोग एटीजी 9 ए का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और विशेष रूप से, इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों का उपयोग करके इसका स्थानीयकरण, जिसका मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित की जा सकती है। क्षणिक ओवरएक्प्रेशन के नुकसान को भी संबोधित किया जाता है। एटीजी 9 ए फ़ंक्शन का सही लक्षण वर्णन और इसकी तस्करी का विश्लेषण करने के लिए तकनीकों का मानकीकरण ऑटोफैगी दीक्षा को नियंत्रित करने वाली घटनाओं को और अधिक चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

Introduction

एटीजी 9 ए कोर ऑटोफैगी मशीनरी का एकमात्र ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है और गोल्गी और एक साइटोसोलिक एटीजी 9 ए पुटिका डिब्बे के बीच तस्करी की जाती है, जो एंडोसोमल कम्पार्टमेंट1 के माध्यम से पारगमन करती है। लंबे समय से गूढ़ होने के बाद, एटीजी 9 ए को हाल ही में लिपिड स्क्रैम्बलेस के रूप में कार्य करने के लिए वर्णित किया गया है, क्योंकि यह झिल्ली बाइलेयर 2,3 में लिपिड को बराबर करता है। अब यह स्पष्ट है कि एटीजी 9 ए ऑटोफैगोसोम गठन में पदानुक्रम के शीर्ष पर रहता है, और इसका अध्ययन, इस प्रकार, ऑटोफैगी 4,5 को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। जैसे, एटीजी 9 ए पुटिकाओं को हाल ही में ऑटोफैगोसोम 6,7 के "बीज" के रूप में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एटीजी 9 ए केवल अपनी परिपक्वता के विभिन्न चरणों में ऑटोफैगोसोम बनाने वाले के साथ क्षणिक रूप से बातचीत करता है और ऑटोफैजिक झिल्ली 6,8,9,10,11 में एकीकृत नहीं होता है। इस प्रकार, ऑटोफैगोसोम गठन में एटीजी 9 ए की भूमिका और संभावित कई कार्यों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है। हालांकि, वर्तमान मॉडल और पिछले डेटा के बीच विसंगति को केवल मान्य मात्रात्मक दृष्टिकोण और इंट्रासेल्युलर मार्करों का उपयोग करके एटीजी 9 ए की तस्करी को संबोधित करने वाले लक्षित प्रयोगों के माध्यम से हल किया जा सकता है।

एटीजी 9 ए का अध्ययन करने के लिए उपयोग में विभिन्न उपकरण हैं, जिनमें से प्रत्येक फायदे और नुकसान के साथ है, और इन उपकरणों का उपयोग एटीजी 9 ए की संरचना, इसके आणविक कार्य और सेलुलर तस्करी 2,8,12 से जटिल है। एटीजी 9 ए एक होमोट्रीमर बनाता है, ग्लाइकोसिलेटेड होता है, और पूरे सेल में गोल्गी, एंडोसोम और प्लाज्मा झिल्ली13,14 जैसे डिब्बों में तस्करी की जाती है। इसके जटिल यात्रा कार्यक्रम को देखते हुए, विशिष्ट उपचार या उत्तेजनाओं (जैसे पोषक तत्व और सीरम भुखमरी) पर गोल्गी से एटीजी 9 ए फैलाव जैसे रीडआउट की व्याख्या करने में कई चुनौतियां हैं। एटीजी 9 ए वेसिकुलर तस्करी के मामले में बेहद गतिशील है; दरअसल, एटीजी 9 ए युक्त पुटिकाओं को भुखमरी से प्रेरित ऑटोफैगी के संदर्भ में एटीजी 9 ए डिब्बे के रूप में परिभाषित किया गया है। इन गतिशील पुटिकाओं द्वारा गठित एटीजी 9 ए कम्पार्टमेंट, क्षणिक रूप से कई इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 8,15,16,17 के साथ बातचीत करता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस, लाइव इमेजिंग और ग्लाइकोसिलेशन परख सहित यहां वर्णित तकनीकों को एटीजी 9 ए जीव विज्ञान का पता लगाने और समझने में सहायता करनी चाहिए। विशेष रूप से, इस लेख में वर्णित दृष्टिकोण विशिष्ट सेलुलर डिब्बों के स्थानीयकरण और विशिष्ट प्रोटीन भागीदारों और / या झिल्ली डिब्बों के साथ बातचीत के बारे में सवालों को संबोधित करने में मदद करेंगे। चूंकि एटीजी 9 ए हाइड्रोफोबिक संरक्षित कोर डोमेन (पीएफएएम डोमेन PF04109) में कई झिल्ली डिब्बों के बीच एक अद्वितीय टोपोलॉजी और एटीजी 9 ए चक्र हैं, इसलिए शोधकर्ताओं को कुछ नुकसान और कलाकृतियों के बारे में पता होना चाहिए जब क्षणिक रूप से एटीजी 9 ए को अतिरंजित किया जाता है, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) प्रतिधारण शामिल है, लेकिन प्रतिबंधित नहीं है। अन्य संभावित मुद्दे प्रोटीन के गलत होने, सामान्य बढ़ती परिस्थितियों में कृत्रिम एकत्रीकरण, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उप-मानक परमेबिलाइजेशन प्रोटोकॉल के कारण वेसिकुलर डिब्बे की अपर्याप्त पहचान के कारण उत्पन्न हो सकते हैं।

अंतर्जात एटीजी 9 ए इमेजिंग करते समय, बाद के मात्रात्मक विश्लेषण की गुणवत्ता और डेटा की सही व्याख्या सुनिश्चित करने के लिए नमूना तैयारी और छवि अधिग्रहण में सावधानी बरतनी चाहिए। मानक जैव रासायनिक दृष्टिकोण (जैसे इम्यूनोप्रेसिपेशन या पुल-डाउन प्रयोगों को यहां वर्णित नहीं किया गया है) के साथ इस लेख में वर्णित तकनीकों के संयोजन से एटीजी 9 ए फ़ंक्शन की हमारी समझ में सुधार होना चाहिए। इस प्रयोगात्मक टूलकिट का उद्देश्य नए शोधकर्ताओं को अपने जैविक प्रणाली में एटीजी 9 ए के कार्य को निर्धारित करने के लिए आवश्यक कुछ परखों को नेविगेट करने में मदद करना है।

Protocol

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, एटीजी 9 ए डीएनए संरचनाओं और होममेड एसटीओ -215 एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) को छोड़कर, जो अनुरोध पर उपलब्ध हैं। यहां वर्णित विश्लेषण उपकरण ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर (फिजी / इमेजजे) 18 पर आधारित हैं।

1. सेल संस्कृति

  1. टी 150 ऊतक संस्कृति में HEK293A कोशिकाओं को बनाए रखें जो फ्लास्क को उच्च-ग्लूकोज डीएमईएम (डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम) में 80% -90% संगम तक बनाए रखें, जो 10% एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम) और 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक है। 10% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में HEK293A कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, क्योंकि उनके पास अमीनो एसिड भुखमरी पर एक मजबूत कैननिकल ऑटोफैगी प्रतिक्रिया होती है, जो विशेष रूप से, लिपिडेटेड, झिल्ली से जुड़े एलसी 3 1,9,19 में वृद्धि से पता लगाया जाता है, और इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं।
  2. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क से माध्यम को हटाकर कोशिकाओं को पारित करें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए (एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड) समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ने से पहले 1 x पीबीएस (फॉस्फेट-बफर्ड खारा) के 15 मिलीलीटर या इसी तरह के समाधान के साथ कोशिकाओं को एक बार धोएं। डीएमईएम के 8 एमएल के साथ अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और कई कोशिकाओं को वापस बीज दें ताकि यहां वर्णित प्रयोगों के लिए 2 दिनों के बाद 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाए।

2. एटीजी 9 ए का अंतर्जात धुंधलापन

  1. बाँझ नंबर 1.5 ग्लास कवरलिप्स पर बीज HEK293A कोशिकाओं (या पसंद की कोशिकाओं) को 24-वेल प्लेट में रखा जाता है ताकि वे अगले दिन ~ 80% कंफ्लुएंट हों। यह आमतौर पर डीएमईएम के 500 μL में 7 x 104 सेल / अच्छी तरह से देता है।
    नोट: HEK293A कोशिकाओं या अन्य शिथिल रूप से अनुयायी सेल लाइनों के लिए, कवरलिप्स को विआयनीकृत पानी में 0.1 मिलीग्राम / एमएल पर पॉली-डी-लाइसिन के साथ लेपित करने की आवश्यकता होती है। कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए कुओं में रखे गए कवरलिप्स के शीर्ष पर पॉली-डी-लाइसिन ( सामग्री की तालिका देखें) के 500 μL जोड़ें, इसके बाद विआयनीकृत पानी के साथ तीन धोएं और डीएमईएम में अंतिम धोएं। कोटिंग के बाद कोशिकाओं को बोने के लिए आगे बढ़ें, और ध्यान रखें कि वे संस्कृति पकवान में समान रूप से फैले हुए हैं।
  2. विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुसार कोशिकाओं का इलाज करें (यानी, ईबीएसएस [अर्ल के संतुलित नमक समाधान] में 2 घंटे के लिए भुखमरी)।
    नोट: ईबीएसएस संरचना 1 ग्राम /एल डी-ग्लूकोज, 6.8 ग्राम / एल एनएसीएल, 0.4 ग्राम / एल केसीएल, 0.151 ग्राम / एल सीएसीएल 2.2 एच 2 ओ, 0.2 ग्राम / एल एमएम एमजीएसओ 4.7 एच 2 ओ, 0.124 ग्राम / एल एनएएच 2 एचपीओ4.2 एच 2 ओ, और 2.2 ग्राम /एल एनएएचसीओ 3 (सामग्री की तालिका देखें) आसुत जल में घुल गई है।
  3. माध्यम को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए आरटी पर 20 मिनट के लिए 0.1 एमएम सीएसीएल 2 और 0.1 एमएम एमजीसीएल2 के साथ पूरक पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड घोल के 500 μL के साथ सावधानीपूर्वक इसे बदलें।
  4. प्रत्येक कुएं से 4% फॉर्मलाडेहाइड समाधान को एस्पिरेट करें, इसे पीबीएस के 500 μL के साथ प्रतिस्थापित करें। इस धोने के चरण को तीन बार दोहराएं। कवरलिप्स को सूखने न दें या तरल के बिना न रहें।
  5. आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 50 एमएम एनएच4सीएल समाधान के 500 μL का उपयोग करके मुक्त एल्डिहाइड समूहों को बुझाएं।
  6. पीबीएस को एस्पिरेट करें, और इसे पीबीएस में 50 μg / mL डिजिटोनिन समाधान के 500 μL के साथ प्रतिस्थापित करें (विआयनीकृत पानी में स्टॉक समाधान 1 मिलीग्राम / एमएल, सामग्री की तालिका देखें) आरटी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए।
  7. प्रत्येक कुएं से डिजिटोनिन समाधान को एस्पिरेट करें, और इसे पीबीएस के 500 μL के साथ बदलें। इस धोने के चरण को तीन बार दोहराएं।
  8. प्रत्येक कुएं से पीबीएस को अलग करें, और इसे आरटी पर 30 मिनट के लिए 500 μL ब्लॉकिंग समाधान (5% बीएसए [गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन] पीबीएस में पतला) के साथ बदलें।
  9. ब्लॉकिंग समाधान को एस्पिरेट करें, और इसे पीबीएस के 500 μL के साथ बदलें।
  10. चिमटी का उपयोग करके, कुएं से कवरलिप्स एकत्र करें, पतले टिशू वाइप्स या सेल्यूलोज फिल्टर पेपर का उपयोग करके अतिरिक्त पीबीएस समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें, और धीरे-धीरे प्रत्येक कवरस्लिप, सेल साइड को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की 50 μL बूंद पर रखें (उदाहरण के लिए, अर्मेनियाई हैम्स्टर 14F2 1% बीएसए / पीबीएस समाधान में 0.9 μg / mL तक पतला है, सामग्री की तालिका देखें)। आरटी में 1 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर चैंबर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: आसान हैंडलिंग के लिए, एंटीबॉडी समाधान की बूंदों को सीधे ठोस सतह पर रखने के बजाय किसी अन्य कंटेनर के भीतर स्व-सीलिंग थर्मोप्लास्टिक फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) की शीट पर रखा जा सकता है।
  11. चिमटी का उपयोग करके कवरलिप्स एकत्र करें, और, पतले ऊतक पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को धीरे से निकालने के बाद, 24-वेल प्लेट में कवरलिप्स (सेल साइड अप) को बदलें, और उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  12. चरण 2.10 दोहराएँ। चिमटी का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं से कवरलिप्स एकत्र करें, पतले टिशू वाइप्स का उपयोग करके अतिरिक्त पीबीएस को सावधानीपूर्वक बाहर निकालें, और धीरे-धीरे प्रत्येक कवरस्लिप (सेल साइड डाउन) को 1% बीएसए / पीबीएस समाधान में 1: 1,000 पतला द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान की 50 μL बूंद पर रखें (उदाहरण के लिए, Cy3 बकरी एंटी-अर्मेनियाई हैम्स्टर आईजीजी, जिसमें गोजातीय, मानव के साथ न्यूनतम क्रॉसएक्टिविटी है। माउस, खरगोश और चूहे सीरम प्रोटीन, सामग्री की तालिका देखें)। आरटी में 1 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर चैंबर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: वैकल्पिक: बाद के छवि विश्लेषण के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के अलावा एक साइटोस्केलेटन मार्कर का उपयोग किया जा सकता है (यानी, एलेक्सा फ्लुर 647 फेलोइडिन पतला 1: 1,000, सामग्री की तालिका देखें)। आसान हैंडलिंग के लिए, एंटीबॉडी समाधान की बूंदों को सीधे ठोस सतह पर रखने के बजाय दूसरे कंटेनर के भीतर सीलिंग फिल्म की शीट पर रखा जा सकता है।
  13. चिमटी का उपयोग करके कवरलिप्स एकत्र करें और, अतिरिक्त द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को निकालने के बाद, कवरलिप्स को 24-वेल प्लेट (सेल साइड अप) में रखें और उन्हें 500 μL PBS के साथ तीन बार धोएं।
  14. चिमटी का उपयोग करके, कवरलिप्स को इकट्ठा करें, पतले ऊतक पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त पीबीएस को सावधानीपूर्वक बाहर निकालें, और पीबीएस में 1: 4,000 होचस्ट समाधान (होचस्ट 33342) की 50 μL बूंद पर प्रत्येक कवरस्लिप (सेल साइड डाउन) को धीरे से बिछाएं। आरटी पर 5 मिनट के लिए आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट करें।
    नोट: आसान हैंडलिंग के लिए, एंटीबॉडी समाधान की बूंदों को सीधे ठोस सतह पर रखने के बजाय दूसरे कंटेनर के भीतर सीलिंग फिल्म की शीट पर रखा जा सकता है।
  15. चिमटी का उपयोग करके कवरलिप्स एकत्र करें, और, पतले ऊतक पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त होचस्ट घोल को धीरे से निकालने के बाद, 24-वेल प्लेट में कवरलिप्स को बदलें, और पीबीएस के साथ तीन बार और एक बार डी-आयनीकृत पानी (500 μL प्रति धोने) से धोएं।
  16. पतले ऊतक पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त विआयनीकृत पानी को सावधानीपूर्वक सूखा लें, और धीरे-धीरे प्रत्येक कवरस्लिप (सेल साइड डाउन) को माउंटिंग समाधान की 10-20 μL बूंद पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें) जो हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर देखा गया है।
    नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले माउंटिंग माध्यम में विसर्जन तेल के समान अपवर्तक सूचकांक होता है और आरटी पर कुछ घंटों के बाद या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कठोर हो जाता है। गैर-कठोर माउंटिंग समाधान का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए।
  17. एस्पिरेशन द्वारा अतिरिक्त माउंटिंग घोल को हटा दें, और अंधेरे में रात भर आरटी पर सपाट रहने के दौरान नमूने को सूखने दें, या तो स्लाइड होल्डर में या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।

3. छवि अधिग्रहण

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चालू करें। छवि अधिग्रहण सेटअप शुरू करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. फ़ंक्शन टैब में, विश्लेषण के लिए छवियों को कैप्चर करने के लिए प्लान-एपोक्रोमैट 63x/1.4 ऑयल डीआईसी एम 27 उद्देश्य लेंस का चयन करें।
  3. अधिग्रहण फ़ंक्शन टैब में, नियंत्रण कक्ष के लेजर ज़ोन (आर्गन, डायोड-405-30, DPSS 561-10, और HeNe633) में उपयुक्त लेजर चालू करें।
  4. नियंत्रण कक्ष के इमेजिंग सेटअप ज़ोन में, अनुक्रमिक अधिग्रहण करने के लिए एक चैनल के अनुरूप प्रत्येक ट्रैक के साथ चार ट्रैक बनाएं।
  5. अधिग्रहण मोड विंडो में छवियों का उपयुक्त रिज़ॉल्यूशन सेट करें। रिज़ॉल्यूशन को 1,024 x 1,024 (फ़्रेम आकार) पर सेट करें, और 16-बिट की बिट गहराई का चयन करें।
  6. प्रत्येक चैनल के लिए, लेजर शक्ति को समायोजित करें और संतृप्त पिक्सेल के बिना एक अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए लाभ प्राप्त करें, जो छवि तीव्रता विश्लेषण में बाधा उत्पन्न करेगा। लाइव बटन का उपयोग करके, लेजर आउटपुट स्तर और लाभ (मास्टर) सेट करें।
    नोट: संतृप्त पिक्सेल का पता लगाने के लिए रेंज संकेतक विकल्प का उपयोग अनुशंसित है। पृष्ठभूमि शोर से बचने के लिए लेजर पावर को 1% और 10% के बीच और गेन (मास्टर) को 850 से नीचे रखें।
  7. नियंत्रण कक्ष के चैनल क्षेत्र में, प्रत्येक चैनल के लिए एक ही पिनहोल एपर्चर सेट करें, उच्चतम तरंग दैर्ध्य वाले चैनल के लिए 1 एयरी यूनिट (एयू) पर विचार करें।
  8. समान मात्रा में कोशिकाओं (प्रति क्षेत्र 20-30 कोशिकाओं) वाले 10 यादृच्छिक क्षेत्रों का अधिग्रहण करें। प्रति शर्त 100-200 कोशिकाओं का अधिग्रहण बाद की छवि विश्लेषण के लिए अच्छी शक्ति प्रदान करेगा।

4. एटीजी 9 ए फैलाव का छवि विश्लेषण

  1. इंटरनेट से फिजी सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें (सामग्री की तालिका देखें)। बायोफॉर्मेट आयातक के प्लगइन्स > बायो-फॉर्मेट्स > पर क्लिक करके फिजी के साथ छवि खोलें।
  2. माप का विश्लेषण > सेट करें पर क्लिक करें, और तीव्रता विश्लेषण के लिए माप विंडो में माध्य ग्रे मान का चयन करें।
  3. छवि > रंग > स्प्लिट चैनल पर क्लिक करें, और चैनलों को तीन छवियों (गोल्गी मार्कर, साइटोस्केलेटन, एटीजी 9 ए सिग्नल) में अलग करें।
  4. छवि पर जाएं > थ्रेशोल्ड > समायोजित करें, और गोल्गी मार्कर के अनुरूप चैनल में एक सीमा परिभाषित करें।
  5. चयन बनाएं > चयन > संपादित करें पर क्लिक करें, और द्विआधारी छवि से चयन बनाएं।
  6. प्रबंधक > नाम बदलें (गोल्गी) में जोड़ें > चयन संपादित करें >पर जाएं, चयन को ROI प्रबंधक में सहेजें और इसे गोल्गी में नाम दें।
  7. इमेज > एडजस्ट > थ्रेशोल्ड पर क्लिक करें, और सेल कंटूर को परिभाषित करने के लिए साइटोस्केलेटन मार्कर के अनुरूप चैनल में एक सीमा परिभाषित करें।
  8. चयन बनाएँ > चयन > संपादित करें पर जाएँ, और द्विआधारी छवि से चयन बनाएँ.
  9. प्रबंधक में जोड़ें > नाम बदलें (कुल) > चयन संपादित करें > जोड़ें पर क्लिक करें, ROI प्रबंधक में चयन सहेजें, और इसका कुल नाम बदलें।
  10. ATG9A धुंधला होने के अनुरूप छवि का चयन करें।
  11. माप का विश्लेषण > में, उस पर क्लिक करके आरओआई गोल्गी लागू करें, और गोल्गी क्षेत्र की तीव्रता को मापें।
  12. माप का विश्लेषण करें पर क्लिक >, उस पर क्लिक करके ROI कुल लागू करें, और कुल क्षेत्र की तीव्रता को मापें।
  13. सभी छवियों में प्रक्रिया दोहराएँ, परिणामों को .csv फ़ाइलों के रूप में सहेजें, और निम्न सूत्र का उपयोग करके डेटा संसाधित करें:
    एटीजी 9 ए फैलाव दर = गोल्गी तीव्रता /

5. एटीजी 9 ए संरचनाओं की लाइव सेल इमेजिंग

  1. बीज HEK293A कोशिकाएं (या पसंद की कोशिकाएं) 2 एमएल माध्यम में 60 मिमी ऊतक संवर्धन डिश में डालती हैं ताकि वे अगले दिन ~ 65% -70% कंफ्लुएंसी तक पहुंच सकें; यह आमतौर पर 1 x 10 6-2x 106 कोशिकाएं देता है।
  2. अगले दिन, लिपोफेक्टामाइन: डीएनए मिश्रण (या एक उपयुक्त वैकल्पिक डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक, सामग्री की तालिका देखें) निम्नानुसार तैयार करें:
    1. निर्माण अभिव्यक्ति दक्षता के आधार पर, प्लास्मिड डीएनए के 0.5-2 μg को एक उपयुक्त सीरम-मुक्त माध्यम के 100 μL में पतला करें, और धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके समाधान को मिलाएं। आरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्लास्मिड डीएनए निर्माण प्रयोग-विशिष्ट है। शोधकर्ता या तो स्वयं क्लोन कर सकते हैं या अनुरोध पर लेखकों से प्राप्त कर सकते हैं।
    2. लिपोफेक्टामाइन 2000 अभिकर्मक को 3: 1 लिपोफेक्टामाइन: डीएनए के अनुपात में एक उपयुक्त सीरम-मुक्त माध्यम के 100 μL में पतला करें और धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके समाधान को मिलाएं। आरटी पर 5 मिनट के लिए इस मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    3. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके और आरटी पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके दोनों समाधानों को एक साथ मिलाएं।
  3. प्रत्येक सेल कल्चर प्लेट में लिपोफेक्टामाइन: डीएनए मिश्रण जोड़ें जिसमें 4 एमएल विकास माध्यम होता है, और मिश्रण को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे से आगे और पीछे हिलाएं। 10% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. अभिकर्मक के 4 घंटे बाद माध्यम को ताजा विकास माध्यम से बदलें, और रात भर 10% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. अगले दिन, लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त कल्चर व्यंजनों पर कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज, गिनना और पुन: बीज देना (नंबर 1.5 ग्लास कवरस्लिप के साथ कल्चर व्यंजन, सामग्री की तालिका देखें)। इमेजिंग के समय कवरस्लिप पर ~ 60% -75% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के लिए व्यंजनों पर बीज 0.4 x 106-0.7 x 10 6 सेल।
    नोट: पॉली-डी-लाइसिन के साथ कोटिंग, जैसा कि चरण 2.1 में समझाया गया है, HEK293A कोशिकाओं के लिए अनुशंसित है।
  6. अगले दिन (अभिकर्मक के 48 घंटे बाद), कोशिकाओं की छवि बनाएं।

6. एटीजी 9 ए की ग्लाइकोसिलेशन स्थिति की जांच

  1. 10 सेमी ऊतक संवर्धन डिश में बीज HEK293A कोशिकाएं (या पसंद की कोशिकाएं) ताकि वे अगले दिन ~ 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाएं यदि अंतर्जात एटीजी 9 ए की जांच करने की योजना बना रहे हैं, जो आमतौर पर 10 एमएल में 1.5 x 10 6-2.5 x 106 कोशिकाएं देता है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को बीज दें ताकि वे एटीजी 9 ए संरचनाओं को स्थानांतरित करने पर ~ 65% -70% कंफ्लुएंसी तक पहुंच सकें, जो आमतौर पर 10 एमएल में 1 x 10 6-1.5 x 106 कोशिकाएं देता है।
  2. कोशिकाओं को 100 μg / mL cyclohexamide (CHX, सामग्री की तालिका देखें) या अगले दिन वाहन के साथ इलाज करें। 24 घंटे (या वांछित समय बिंदु तक) के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें, माध्यम को एस्पिरेट करें, और बर्फ पर रखें। इसे 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस के साथ बदलें। सेल स्क्रैपर का उपयोग करके डिश से कोशिकाओं को शारीरिक रूप से अलग करें, और पीबीएस-सेल समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार-तल ट्यूब में पिपेट करें। कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और बर्फ-ठंडे टीएनटीई लाइसिस बफर (1% ट्राइटन, 150 एमएम एनएसीएल, 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 0.5 एमएम ईडीटीए) के ~ 100 μL (सेल गोली के आकार के आधार पर) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल गोलियों (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक करें, और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    1. लाइसेट को 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेकें। इसके बाद, नाभिक और अघुलनशील मलबे को तलछट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x g पर लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. ब्रैडफोर्ड विधि20 और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें जो 595 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर माप सकता है।
  6. प्रोटीन की मात्रा को सामान्य करें, और 16 μL लाइसेट (जिसमें कुल मिलाकर 100 μg से अधिक प्रोटीन नहीं होता है) को 5x PNGase F (पेप्टाइड: एन-ग्लाइकोसिडेज़ एफ) बफर के साथ मिलाते हैं, जो 1 μL PNGase F एंजाइम जोड़ने से पहले निर्माता के निर्देशों के अनुसार होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। PNGase F निर्माता द्वारा दिए गए निर्देश के अनुसार इनक्यूबेट करें।
  7. 1x सांद्रता प्राप्त करने के लिए 3x Laemmli नमूना बफर की मात्रा जोड़ें, और प्रोटीन के पृथक्करण को अधिकतम करने के लिए ट्रिस-एसीटेट जेल का उपयोग करके वैद्युतकणसंचलन के लिए लोड करने से पहले 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। मानक पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल21 (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके जेल से प्रोटीन को एक उपयुक्त झिल्ली (यानी, पीवीडीएफ [पॉलीविनाइलिडेन डिफ्लोराइड]) में स्थानांतरित करें।
    नोट: 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को उबालने से एटीजी 9 ए एकत्रित हो जाएगा, इस प्रकार एटीजी 9 ए का पता लगाना कम हो जाएगा।
  8. एटीजी 9 ए (एसटीओ -215 एंटीबॉडी, इन-हाउस1 में उत्पादित) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा करें ( सामग्री की तालिका देखें)। उच्च एटीजी 9 ए आणविक भार प्रजातियों की कल्पना करने के लिए झिल्ली के उच्च-आणविक भार खंड को छोड़ दें।

Representative Results

एटीजी 9 ए एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है जो कई इंट्रासेल्युलर झिल्ली डिब्बों 8,17,22,23,24 से जुड़ा हुआ है। बेसल स्थितियों में, एटीजी 9 ए मुख्य रूप से ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क (टीजीएन) में स्थानीयकृत होता है, जैसा कि अंतर्जात प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस और जीएम 130, एक सीआईएस-गोल्गी मार्कर (चित्रा 1 ए) के साथ ओवरलैप द्वारा इंगित किया जाता है, साथ ही साथ छोटे पुटिकाओं में जो आंशिक रूप से एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग कम्पार्टमेंट (ईआरसी) 23 के साथ ओवरलैप होते हैं। गोल्गी में एटीजी 9 ए स्थानीयकरण विभिन्न इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। हालांकि, एटीजी 9 ए का वेसिकुलर अंश, साथ ही इसके स्थानीयकरण का परिवर्तन, विशेष रूप से पोषक तत्व और सीरम भुखमरी जैसे विशिष्ट उत्तेजनाओं के जवाब में वेसिकुलर पूल में वृद्धि, तीव्रता में काफी परिवर्तनशील हो सकती है और पारंपरिक इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ कल्पना करना मुश्किल हो सकता है। गोल्गी में स्थानीयकृत एटीजी 9 ए और एक वेसिकुलर अंश के लिए स्थानीयकृत एटीजी 9 ए के बीच के अनुपात को एटीजी 9 ए फैलाव दर कहा जाता है। एटीजी 9 ए फैलाव दर में परिवर्तन का पता लगाने के लिए, उदाहरण के लिए ईबीएसएस उपचार पर, जिसका उपयोग सीरम और अमीनो एसिड दोनों को कम करने के लिए किया जाता है, जीएम 130 या टीजीएन 46 जैसे गोल्गी मार्कर और फेलोइडिन जैसे साइटोस्केलेटन मार्कर, जो सेल कंटूर25 को दाग देता है, एटीजी 9 ए फैलाव को आसानी से निर्धारित करने के लिए उपयोगी होते हैं (चित्रा 1 बी)। महत्वपूर्ण रूप से, औसत प्रतिदीप्ति अनुपात विश्लेषण को केवल फैलाव की एक निश्चित दर के बजाय स्थितियों के बीच तुलनात्मक माप के रूप में व्याख्या किया जा सकता है। डिब्बों के बीच का अनुपात जैविक और गैर-जैविक कारकों पर अत्यधिक निर्भर है जैसे कि उपयोग की जाने वाली सेल लाइन, धुंधला गुणवत्ता, या लागू थ्रेशोल्डिंग विधियां (चित्रा 1 बी)। इस कारण से, शोधकर्ता को एक पाइपलाइन स्थापित करने की आवश्यकता होती है जो अपनी विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों में एटीजी 9 ए गोल्गी संवर्धन का पता लगाने में सक्षम है और फिर विश्लेषण किए जाने वाले सेट में सभी छवियों के लिए समान मापदंडों के साथ विश्लेषण का विस्तार करती है। प्रतिनिधि द्विआधारी छवियों और एटीजी 9 ए माध्य प्रतिदीप्ति के विश्लेषण के लिए चुने गए क्षेत्रों को चित्रा 1 बी में एक गाइड के रूप में दिखाया गया है।

एटीजी 9 ए दो अपेक्षाकृत लचीले और असंरचित एन- और सी-टर्मिनल डोमेन से घिरे कई ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन को आश्रय देता है, जिनमें से सी-टर्मिनल अनुक्रम में लगभग आधा प्रोटीन12 शामिल है। महत्वपूर्ण रूप से, अतिरंजित एटीजी 9 ए के स्थानीयकरण पैटर्न को प्रभावित किया जा सकता है कि प्रोटीन अंत को किस से टैग किया गया है (चित्रा 2 ए)। विशेष रूप से, क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग करते समय और एटीजी 9 ए को सीधे अपने एन-टर्मिनस पर फ्लोरोसेंट टैग (जैसे, ईजीएफपी, एमआरएफपी, या डेरिवेटिव) के साथ टैग करते समय, इसके गोल्गी स्थानीयकरण को आंशिक रूप से समझौता किया जा सकता है, जिसमें बेसल (यानी, खिलाया गया) स्थितियों में कम संवर्धन देखा जाता है, जबकि एटीजी 9 ए पुटिकाएं अभी भी आसानी से दिखाई देती हैं (चित्रा 2 ए)। अपने सी-टर्मिनस पर एटीजी 9 ए को टैग करना बड़े जीएफपी पॉजिटिव क्लस्टर को थोड़ा प्रेरित करता है जिसे एकत्रित किया जा सकता है। अंत में, एमआरएफपी-एटीजी 9 ए का एक मोनोमेरिक संस्करण भी पुटिकाओं के समान फ्लोरोसेंट क्लस्टर और अतिरंजित कोशिकाओं में थोड़ा गोल्गी धुंधला दिखाता है (चित्रा 2 ए)।

गोल्गी और एटीजी 9 ए पुटिकाओं में तस्करी होने से पहले एटीजी 9 ए ईआर झिल्ली में फोल्ड हो जाता है। ईआर में अपने निवास के दौरान, एटीजी 9 ए शतावरी 99 पर एन-लिंक्ड ग्लाइकेन द्वारा संशोधित हो जाता है, और फिर गोल्गी तक पहुंचने पर, यह जटिल, परिपक्व एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स 1,14 प्राप्त करता है। ग्लाइकोसिलेशन द्वारा इस संशोधन को डबल बैंड14 की उपस्थिति से पश्चिमी धब्बा के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। इसके इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण के अनुरूप, अधिकांश अंतर्जात एटीजी 9 ए जटिल एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स को परेशान करता है, और इसलिए, उच्च-आणविक भार बैंड प्रमुख है, जिसमें एक हल्का कम-आणविक भार बैंड भी दिखाई देता है (चित्रा 2 बी)। उच्च-आणविक भार प्रोटीन (चित्रा 2 बी, नियंत्रण, टी = 0) के संकल्प में सुधार के लिए ट्रिस-एसीटेट जैल का उपयोग करते समय एक डबल बैंड की उपस्थिति सबसे आसानी से देखी जाती है। जब अंतर्जात प्रोटीन को पीएनगास एफ (पेप्टाइड: एन-ग्लाइकोसिडेज़ एफ) उपचार के अधीन किया जाता है, जो अधिकांश जटिल एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स को हटा देता है, तो प्रोटीन एक एकल बैंड (चित्रा 2 बी, पीएनगास एफ, टी = 0) के रूप में चलता है। इसलिए, एटीजी 9 ए की एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन स्थिति का उपयोग ईआर से गोल्गी तक एटीजी 9 ए के बाहर निकलने की निगरानी के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है, जो दो बैंडों के बीच सापेक्ष अनुपात द्वारा परिलक्षित होता है।

एमआरएफपी-एटीजी 9 ए को स्थानांतरित करते समय, अतिरंजित प्रोटीन शुरू में ईआर में जमा होता है, संभवतः क्योंकि तस्करी मशीनरी सभी एटीजी 9 ए को मोड़ने और यातायात करने में असमर्थ है, और कम आणविक भार बैंड प्रमुख है (चित्रा 2 सी, नियंत्रण टी = 0)। विशेष रूप से, एमआरएफपी-एटीजी 9 ए की अभिव्यक्ति के 24 घंटे के बाद, ऊपरी और निचले बैंड के बीच लगभग समान वितरण होता है, जिससे पता चलता है कि एमआरएफपी-एटीजी 9 ए पूल गोल्गी में जा रहा है (चित्रा 2 सी, नियंत्रण, टी = 24)। यदि कोशिकाओं को साइक्लोहेक्सिमाइड (सीएचएक्स) के साथ इलाज किया जाता है, जो डे नोवो प्रोटीन संश्लेषण26 को अवरुद्ध करता है, तो ईआर से एटीजी 9 ए की तह और निकास को स्पष्ट किया जा सकता है। चूंकि अंतर्जात प्रोटीन मुड़ा हुआ है, ग्लाइकोसिलेटेड है, और गोल्गी में निवासी है, सीएचएक्स के साथ उपचार निचले और उच्च-आणविक भार बैंड (चित्रा 2 बी, नियंत्रण) के अनुपात में काफी बदलाव नहीं करता है। हालांकि, एमआरएफपी-एटीजी 9 ए की क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए, सीएचएक्स उपचार उच्च-आणविक भार बैंड (चित्रा 2 सी, नियंत्रण, सीएचएक्स टी = 24) के संचय को बढ़ावा देता है। उच्च-आणविक भार एमआरएफपी-एटीजी 9 ए बैंड पीएनगैस एफ (चित्रा 2 सी, पीएनगैस एफ, टी = 24) के साथ उपचार के बाद निचले बैंड में गिर जाता है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि अंतर्जात प्रोटीन तेजी से परिपक्व ग्लाइकेन्स प्राप्त करता है, जैसा कि उच्च-आणविक भार बैंड की प्रबलता से परिलक्षित होता है, और सीएचएक्स चेज़ डबल बैंड (चित्रा 2 बी) के अनुपात को प्रभावित नहीं करता है। क्षणिक रूप से अतिरंजित एमआरएफपी-एटीजी 9 ए के मामले में, सीएचएक्स उपचार ऊपरी बैंड के संचय को प्रेरित करता है, यह दर्शाता है कि ईआर पूल फोल्ड होने के साथ अधिक परिपक्व ग्लाइकेन प्राप्त होते हैं और ईआर को गोल्गी से बाहर निकलते हैं (चित्रा 2 सी)।

एटीजी 9 ए अनुक्रम और फ्लोरोसेंट टैग के बीच एक लिंकर के अलावा प्रोटीन के अधिक शारीरिक स्थानीयकरण और तस्करी को बढ़ावा देने में सहायक हो सकता है। एन-टर्मिनल फ्लोरोफोरे और एटीजी 9 ए के बीच 3एक्स-फ्लैग अनुक्रम (24 अमीनो एसिड) को फ्यूज करने से अतिव्यक्त प्रोटीन को अंतर्जात के समान व्यवहार करने में मदद मिलती है (चित्रा 3)। दरअसल, एमचेरी -3एक्सफ्लैग-एटीजी 9 ए खिलाए गए स्थितियों में गोल्गी मार्कर जीएम 130 के साथ कोलोकलाइज करता है (चित्रा 3 ए)। महत्वपूर्ण रूप से, यह स्थानीयकरण और एटीजी 9 ए वेसिकुलर कम्पार्टमेंट समय के साथ संरक्षित हैं, जिससे एटीजी 9 ए (चित्रा 3 बी) की तस्करी के स्थानिक अध्ययन की अनुमति मिलती है।

Figure 1
चित्रा 1: अंतर्जात एटीजी 9 ए स्थानीयकरण का छवि विश्लेषण। (ए) अंतर्जात एटीजी 9 ए (लाल), जीएम 130 को गोल्गी मार्कर (हरा), और एक्टिन साइटोस्केलेटन (सियान) की कल्पना करने के लिए फैलोइडिन की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि। स्केल बार = 10 μm। (बी) गोल्गी क्षेत्र में स्थानीयकृत अंतर्जात एटीजी 9 ए के अंश को निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण का वर्कफ़्लो। स्केल बार = 10 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्थानीयकरण और ग्लाइकोसिलेशन द्वारा फ्लोरोसेंटली टैग-एटीजी 9 ए संरचनाओं का विश्लेषण । (ए) ईजीएफपी एन-टर्मिनल रूप से टैग किए गए एटीजी 9 ए गोल्गी में कम स्थानीयकृत है और मुख्य रूप से पुटिकाओं में रहता है। ईजीएफपी सी-टर्मिनल रूप से टैग किए गए एटीजी 9 ए सेल के भीतर समुच्चय प्रदर्शित करता है (कुछ उदाहरण सफेद तीर के निशान से चिह्नित होते हैं; ईजीएफपी-एटीजी 9 ए और एटीजी 9 ए-ईजीएफपी हरे रंग में हैं)। एमआरएफपी एन-टर्मिनल रूप से टैग किए गए एटीजी 9 ए गोल्गी में कम स्थानीयकृत है और मुख्य रूप से पुटिकाओं में रहता है। एन सेल नाभिक के अनुमानित स्थान को दर्शाता है, और एमआरएफपी-एटीजी 9 ए लाल रंग में है। स्केल बार = 5 μm। (बी) पश्चिमी ब्लॉट (एरोहेड) द्वारा विश्लेषण किए जाने पर अंतर्जात एटीजी 9 ए दो बैंड के रूप में दिखाई देता है: एक ऊपरी बैंड (जटिल एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स) और एक निचला बैंड (कोई परिपक्व एन-लिंक्ड ग्लाइकेन नहीं)। साइक्लोहेक्ज़ामाइड (सीएचएक्स) के साथ उपचार ऊपरी और निचले बैंड के बीच के अनुपात को प्रभावित नहीं करता है। PNGase F के साथ उपचार ऊपरी बैंड के गायब होने का कारण बनता है। (ग) HEK293A कोशिकाओं में एमआरएफपी-टैग किए गए एटीजी9ए के क्षणिक अभिकर्मक के बाद, पश्चिमी धब्बा (तीर) पर दो प्रमुख बैंड दिखाई देते हैं। PNGase F के साथ उपचार ऊपरी बैंड के गायब होने का कारण बनता है। अभिकर्मक के बाद सीएचएक्स के साथ उपचार से ग्लाइकोसिलेशन में वृद्धि होती है क्योंकि संक्रमित एटीजी 9 ए के पूल को ईआर से गोल्गी में तस्करी किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इम्यूनोफ्लोरेसेंस और लाइव इमेजिंग द्वारा एमचेरी -3एक्सएफएलएजी-एटीजी 9 ए स्थानीयकरण का विश्लेषण। (ए) HEK293A कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग क्षणिक रूप से एमचेरी -3एक्सएफएलएजी-एटीजी 9 ए को अतिरंजित करते हैं और गोल्गी मार्कर जीएम 130 के साथ दाग देते हैं। स्केल बार = 10 μm। mCherry-3xFLAG-ATG9A लाल रंग में है, और GM130 गोल्गी मार्कर हरे रंग में है। (बी) HEK293A कोशिकाओं में लाइव-इमेजिंग प्रयोगों से मोंटेज क्षणिक रूप से एमचेरी-3एक्सफ्लैग-एटीजी 9 ए को अतिरंजित करता है। एन नाभिक के अनुमानित स्थान को दर्शाता है। समय सीमा = 1 एफपीएस। स्केल बार = 10 μm। mCherry-3xFLAG-ATG9A लाल रंग में है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह अध्ययन विभिन्न उपकरणों को दिखाता है जिनका उपयोग एटीजी 9 ए स्थानीयकरण की जांच के लिए किया जा सकता है। सबसे पहले, यह अध्ययन बताता है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एटीजी 9 ए की कल्पना कैसे की जा सकती है और इसे कैसे निर्धारित किया जा सकता है। दूसरे, जिन रणनीतियों का उपयोग एटीजी 9 ए को फिक्स्ड या लाइव कोशिकाओं में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग करने के लिए किया जा सकता है, उनकी तुलना की जाती है। अंत में, यह काम बताता है कि एटीजी 9 ए की ग्लाइकोसिलेशन स्थिति की जांच और उपयोग कैसे करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि एटीजी 9 ए ईआर से बाहर निकल गया है और गोल्गी के माध्यम से तस्करी की गई है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अंतर्जात एटीजी 9 ए स्थानीयकरण के लक्षण वर्णन के बारे में, प्रयोग के लिए नियोजित निर्धारण और परमेबिलाइजेशन विधियों के साथ देखभाल की जानी चाहिए। यहां वर्णित मानक प्रक्रियाओं के अनुसार, डिजिटोनिन परमेबिलाइजेशन के साथ युग्मित पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण गोल्गी-संबद्ध एटीजी 9 ए और एटीजी 9 ए-पॉजिटिव पुटिका7 दोनों की कल्पना करने के लिए अच्छी स्थितियां हैं। निर्धारण और परमेबिलाइजेशन के साथ, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ इनक्यूबेशन का समय भी महत्वपूर्ण है। हमने देखा है, लेकिन प्रलेखित नहीं है, कि प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की उच्च सांद्रता और लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय एटीजी 9 ए के गोल्गी धुंधलापन में गलत वृद्धि का कारण बन सकता है, जो अंततः अन्य झिल्ली डिब्बों में एटीजी 9 ए पुनर्वितरण का पता लगाने से समझौता करता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि एटीजी 9 ए कई इंट्रासेल्युलर डिब्बों 1,13,17,22,23,24,27,28 में मौजूद है, इसलिए एटीजी 9 ए के साथ विशिष्ट झिल्ली मार्करों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, यह पहचानने के लिए कि एटीजी 9 ए कहां स्थित है। एटीजी 9 ए स्थानीयकरण को मापने के लिए अतीत में कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है, जिसमें पीयरसन के सहसंबंध गुणांक भीशामिल हैं। हालांकि, गोल्गी और अलग-अलग वेसिकुलर डिब्बे के साथ एटीजी 9 ए का आंशिक ओवरलैप पिक्सेल आउटलायर्स की एक उच्च संख्या की ओर जाता है, जो सहसंबंध गुणांक की व्याख्या को पूर्वाग्रह कर सकता है। इस कारण से, विश्लेषण किए जाने वाले दो डिब्बों में औसत प्रतिदीप्ति के अनुपात के आधार पर एक अधिक सरल दृष्टिकोण पसंद किया जाता है, और यह दृष्टिकोण सेल-दर-सेल परिवर्तनशीलता के प्रति कम संवेदनशील है। माइक्रोस्कोपी के माध्यम से छवि विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठकों को इस पुस्तक अध्याय30 पर निर्देशित किया जाता है।

एटीजी 9 ए की ग्लाइकोसिलेशन स्थिति की जांच करते समय, पश्चिमी धब्बे चलाने के लिए जैल का चयन महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल के लिए, 3% -8% ट्रिस-एसीटेट जैल पसंद किए जाते हैं क्योंकि वे बड़े प्रोटीन के लिए उच्चतम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करते हैं, लेकिन वैकल्पिक जेल रचनाएं या रनिंग बफर जो उच्च-आणविक भार प्रोटीन का अच्छा पृथक्करण प्रदान करते हैं, का भी उपयोग किया जा सकता है। प्रयोगकर्ता वैद्युतकणसंचलन के समय को बढ़ाकर प्रोटीन के अधिकतम पृथक्करण को सुनिश्चित कर सकता है।

पश्चिमी धब्बा पर एटीजी 9 ए की कल्पना करने के लिए नमूने तैयार करते समय, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि लैम्ली बफर जोड़ने के बाद नमूने को उबाला न जाए; 95 डिग्री सेल्सियस पर उबलने से एटीजी 9 ए समुच्चय का निर्माण होता है, और बाद में, एटीजी 9 ए जेल1 में कुशलता से माइग्रेट नहीं होता है। 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को गर्म करनेकी सिफारिश की जाती है।

अभिकर्मक के उच्च स्तर आमतौर पर ईआर में एटीजी 9 ए के उच्च संचय का कारण बनते हैं, जबकि मध्यम अभिव्यक्ति स्तर प्रोटीन के शारीरिक स्थानीयकरण में मदद करते हैं। उपाख्यानात्मक रूप से, 48 घंटे के बजाय 72 घंटे के इनक्यूबेशन समय अक्सर ईआर स्थानीयकरण कलाकृतियों को कम करने में मदद करते हैं। विशेष रूप से, एमआरएफपी-एटीजी 9 ए एटीजी 9 ए तस्करी और कार्य पर सटीक रूप से रिपोर्ट कर सकता है यदि स्तर अभिव्यक्ति स्तरों के माध्यम से या स्थिर सेल लाइनों 8,9,22,27 का उपयोग करके नियंत्रित किए जाते हैं।

परिपक्व एन-लिंक्ड ग्लाइकेन प्राप्त करने के लिए अतिरंजित एटीजी 9 ए की आबादी की विफलता का उपयोग परेशान एटीजी 9 ए तस्करी के लिए रीड-आउट के रूप में किया जा सकता है। एटीजी 9 ए के कुछ क्षेत्रों को म्यूटेट या हटाने पर, ईआर प्रतिधारण में वृद्धि का खतरा होता है, जिससे परिपक्व एन-लिंक्ड ग्लाइकेन प्राप्त करने में विफलता हो सकती है और इस प्रकार, पश्चिमी धब्बा पर तेजी से पलायन करने वाला एटीजी 9 ए बैंड हो सकता है। कटे हुए एटीजी 9 ए संरचनाओं के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं को ईआर प्रतिधारण, ग्लाइकोसिलेशन राज्यों और गोल्गी स्थानीयकरण की जांच करनी चाहिए।

एटीजी 9 ए की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, एक एयरस्कैन माइक्रोस्कोप, फास्ट एयरस्कैन फ़ंक्शन पर निर्भर करता है, आमतौर पर लगभग 120 एनएम का इष्टतम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। स्थानीयकरण सटीकता के लिए, सुपर-रिज़ॉल्यूशन मोड में लगभग 1-2 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) की फ्रेम दरें इष्टतम हैं जो इस बात पर निर्भर करती हैं कि कितने चैनलों को चित्रित किया गया है। इसी तरह के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप जो उच्च गति पर छवि बना सकते हैं, उनका उपयोग एटीजी 9 ए पुटिकाओं की इमेजिंग के लिए भी किया जा सकता है; हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इमेजिंग गति सीधे घटनाओं का पता लगाने को प्रभावित कर सकती है और इसलिए, डेटा की व्याख्या को प्रभावित कर सकती है।

सारांश में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल इम्यूनोफ्लोरेसेंस, लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी और इसकी ग्लाइकोसिलेशन स्थिति द्वारा एटीजी 9 ए स्थानीयकरण को निर्धारित करने और चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। ये प्रोटोकॉल एटीजी 9 ए के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं की सहायता कर सकते हैं और कुछ नुकसान से बचने में मदद कर सकते हैं।

Disclosures

एसएटी कैस्मा थेरेप्यूटिक्स के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड पर कार्य करता है।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग पहलुओं के लिए रोक्को डी'एंटुओनो को धन्यवाद देते हैं, साथ ही साथ ऑटोफैगी (एमसीबीए) प्रयोगशाला के आणविक कोशिका जीव विज्ञान के सभी वर्तमान और पिछले सदस्यों को उन चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं जिनके कारण इन प्रोटोकॉल का शोधन हुआ। ए.वी.वी., एस.डी.टी., ई.ए., एस.ए.टी., फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित थे, जो कैंसर रिसर्च यूके (सीसी 2134), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (सीसी 2134) से अपना मुख्य वित्त पोषण प्राप्त करता है। इस शोध को वेलकम ट्रस्ट (CC2134) द्वारा पूरे या आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया था। खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए एक सीसी बीवाई सार्वजनिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 multiwell plates  Falcon 353047 For tissue culture
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated MATTEK P35G-1.5-14-C Cell culture dish for live-cell microscopy
4x Laemmli Sample Buffer  Bio-Rad 1610747
60 mm tissue culture dish  Thermofisher Scientific 10099170 For tissue culture
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermofisher Scientific A22287 Actin stain
anti-ATG9A antibody home made STO-215 Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked  Invitrogen 10794347/NA934-1ml Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215
anti-RFP antibody Evrogen AB233 for Western Blot
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen Invitrogen 15232826 Antibody for immunofluorescence
ATG9A-eGFP home made Construct which expresses tagged ATG9A
Bemis Parafilm Thermofisher Scientific 11747487 self-sealing thermoplastic film 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 For determining protein concentration
Bovine serum albumin (BSA)  Merck 10735086001 For blocking non-specific labelling
CaCl2.2H2O / For PBS and EBSS
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001 Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG Jackson ImmunoResearch 127-165-099 Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence
Cyclohexamide Sigma Aldrich 66-81-9 To stop protein translation
D-Glucose / For EBSS
Digitonin  Merck 300410 For permeabilizing cells
DMEM Merck D6546-6x500ml For tissue culture
eGFP-ATG9A home made Construct which expresses tagged ATG9A
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Supplement for DMEM for cell culture
FIJI (ImageJ) / https:/fiji.sc/ Open source image analysis software
Hoechst  Thermofisher Scientific H3570 Stains the nucleus
KCl / For EBSS
L-glutamine  Sigma 67513 For tissue culture
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11668-019 For Cell Transfection
LSM880 Airyscan microscope  Zeiss / Confocal microscopy
MgCl2 / For PBS
MgSO4.7H2O / For EBSS
Mowiol mounting solution Millipore 475904 for permanent mounting glass coverslips
NaCl / For EBSS
NaH2PO4.2H2O / For EBSS
NaHCO3 / For EBSS
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels Thermofisher Scientific EA0378BOX for Western Blotting
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Life Tech NP0002 for Western Blotting
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermofisher Scientific 31985062 For Cell Transfection
Paraformaldehyde  Agar Scientific R1026 For fixing cells
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A home made Construct which expresses tagged ATG9A
Phosphate Buffered Saline (PBS) / For tissue culture
PNGaseF NEB  P0710S To remove N-linked glycans
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 Merck P0899 For coating coverslips
Rapid PNGase F enzyme NEB P07105 To remove N-linked glycans
RFP-ATG9A home made Construct which expresses tagged ATG9A
Triton X-100 Thermofisher Scientific 13454259 Detergent for Cell lysis
Trypsin-EDTA solution  Sigma T4049 For tissue culture
Whatman Filter Paper Merck WHA1001325 For Western Blot and IF
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 For Western Blotting
Zen Black edition Zeiss / Used to operate the LSM 880

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जीव विज्ञान अंक 196
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van Vliet, A. R., De Tito, S., Almacellas, E., Tooze, S. A. Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein. J. Vis. Exp. (196), e65349, doi:10.3791/65349 (2023).

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