التصوير الكيميائي الطيفي غير الخطي متعدد الوسائط باستخدام مجهر توليد مجموع التردد الاهتزازي للمسح الخطي

Summary

تم تطوير إطار تصوير فائق الطيفية متعدد الوسائط وسريع للحصول على صور توليد مجموع التردد الاهتزازي عريض النطاق (VSFG) ، جنبا إلى جنب مع طرائق التصوير من الجيل التوافقي الثاني (SHG). نظرا لتردد الأشعة تحت الحمراء الذي يتردد صداه مع الاهتزازات الجزيئية ، يتم الكشف عن المعرفة المورفولوجية الهيكلية المجهرية والميزوسكوبية للعينات المسموح بها بالتناظر.

Abstract

تم استخدام توليد المجموع الاهتزازي للتردد (VSFG) ، وهو إشارة بصرية غير خطية من الدرجة الثانية ، تقليديا لدراسة الجزيئات في الواجهات كتقنية طيفية بدقة مكانية تبلغ ~ 100 ميكرومتر. ومع ذلك ، فإن التحليل الطيفي ليس حساسا لعدم تجانس العينة. لدراسة العينات غير المتجانسة من الناحية الميزوسكوبية ، قمنا ، مع آخرين ، بدفع حد دقة التحليل الطيفي VSFG إلى مستوى ~ 1 ميكرومتر وقمنا ببناء مجهر VSFG. لا يمكن لتقنية التصوير هذه حل أشكال العينات من خلال التصوير فحسب ، بل يمكنها أيضا تسجيل طيف VSFG واسع النطاق في كل بكسل من الصور. كونها تقنية بصرية غير خطية من الدرجة الثانية ، فإن قاعدة الاختيار الخاصة بها تمكن من تصور الهياكل غير المتماثلة أو المجمعة ذاتيا الموجودة عادة في علم الأحياء وعلوم المواد والهندسة الحيوية ، من بين أمور أخرى. في هذه المقالة ، سيتم توجيه الجمهور من خلال تصميم ناقل الحركة المقلوب الذي يسمح بتصوير عينات غير ثابتة. يوضح هذا العمل أيضا أن الفحص المجهري VSFG يمكنه حل المعلومات الهندسية الخاصة بالمواد الكيميائية للصفائح الفردية المجمعة ذاتيا من خلال دمجها مع حل وظائف الشبكة العصبية. أخيرا ، تناقش الصور التي تم الحصول عليها في ظل تكوينات brightfield و SHG و VSFG لعينات مختلفة بإيجاز المعلومات الفريدة التي كشف عنها تصوير VSFG.

Introduction

تم استخدام توليد المجموع الاهتزازي للتردد (VSFG) ، وهي تقنية بصرية غير خطية من الدرجة الثانية ^1,2 ، على نطاق واسع كأداة طيفية لتحديد العينات المسموح بها كيميائيا³،⁴،⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،^10،11،^{12،13 ،} 14,15,16,17,18,19,20,21,22. تقليديا ، تم تطبيق VSFG على الأنظمة البينية⁸،⁹،¹⁰،¹¹ (أي الغاز السائل ، السائل السائل ، الغاز الصلب ^، السائل الصلب) ^، والتي تفتقر إلى تناظر الانعكاس – وهو مطلب لنشاط VSFG. قدم هذا التطبيق ل VSFG ثروة من التفاصيل الجزيئية للواجهات المدفونة 12،13 ، وتكوينات جزيئات الماء في الواجهات¹⁴،15،16،17،18 ، والأنواع الكيميائية في الواجهات ¹⁹،²⁰،^21،22.

على الرغم من أن VSFG كان قويا في تحديد الأنواع الجزيئية والتكوينات في الواجهات ، إلا أن إمكاناته في قياس الهياكل الجزيئية للمواد التي تفتقر إلى مراكز الانعكاس لم تتحقق. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن المواد يمكن أن تكون غير متجانسة في بيئتها الكيميائية وتركيباتها وترتيبها الهندسي ، ويحتوي مطياف VSFG التقليدي على مساحة إضاءة كبيرة في حدود 100 ميكرومتر². وبالتالي ، فإن التحليل الطيفي التقليدي VSFG يقدم تقارير عن معلومات متوسط المجموعة للعينة على مساحة إضاءة نموذجية تبلغ 100 ميكرومتر². قد يؤدي متوسط المجموعة هذا إلى إلغاء الإشارة بين المجالات المرتبة جيدا ذات الاتجاهات المعاكسة وسوء توصيف عدم التجانس المحلي¹⁵،²⁰،^23،24.

مع التقدم في الفتحة العددية العالية (NA) ، وأهداف المجهر العاكسة (هندسة شوارزشيلد وكاسيجرين) ، والتي تكاد تكون خالية من الانحرافات اللونية ، يمكن تقليل حجم تركيز الحزمتين في تجارب VSFG من 100 ميكرومتر 2 إلى 1-2 ميكرومتر² وفي بعض الحالات تحت^{الميكرون 25}. بما في ذلك هذا التقدم التكنولوجي ، طورت مجموعتنا وغيرها VSFG إلى منصة مجهرية 20،23،26،27،^28،29،30،31،32،³³،34،^35،36. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتنفيذ تخطيط بصري مقلوب ونظام الكشف عن النطاق العريض³⁷ ، والذي يتيح مجموعة سلسة من الصور متعددة الوسائط (VSFG ، الجيل التوافقي الثاني (SHG) ، و brightfield optical). يسمح التصوير متعدد الوسائط بالفحص السريع للعينات باستخدام التصوير البصري ، وربط أنواع مختلفة من الصور معا ، وتحديد مواقع الإشارة على صور العينة. مع بصريات الإضاءة اللونية واختيار مصدر الإضاءة بالليزر النبضي ، تسمح هذه المنصة البصرية بالتكامل السلس في المستقبل لتقنيات إضافية مثل المجهر الفلوري³⁸ ومجهر رامان ، من بين أمور أخرى.

في هذا الترتيب الجديد ، تمت دراسة عينات مثل المنظمات الهرمية وفئة من التجميعات الذاتية الجزيئية (MSAs). تشمل هذه المواد الكولاجين والمحاكاة الحيوية ، حيث يكون كل من التركيب الكيميائي والتنظيم الهندسي مهمين للوظيفة النهائية للمادة. نظرا لأن VSFG هي إشارة بصرية غير خطية من الدرجة الثانية ، فهي حساسة بشكل خاص للترتيبات بين الجزيئات^39,40 ، مثل المسافة بين الجزيئات أو زوايا الالتواء ، مما يجعلها أداة مثالية للكشف عن كل من التركيبات الكيميائية والترتيبات الجزيئية. يصف هذا العمل طرائق VSFG و SHG و brightfield للأداة الأساسية التي تتكون من ليزر الحالة الصلبة المخدر بالإيتربيوم الذي يضخ مضخم حدودي ضوئي (OPA) ، وهو مجهر مقلوب متعدد الوسائط محلي الصنع ومحلل تردد أحادي اللون مقترن بكاشف جهاز مزدوج مشحون ثنائي الأبعاد (CCD)²⁷. يتم توفير إجراءات البناء والمحاذاة خطوة بخطوة ، وقائمة أجزاء كاملة من الإعداد. كما يتم تقديم تحليل متعمق ل MSA ، الذي تتكون وحدته الفرعية الجزيئية الأساسية من جزيء واحد من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، وهو خافض للتوتر السطحي شائع ، وجزيئين من β-cyclodextrin (β-CD) ، المعروف باسم SDS@2 β-CD هنا ، كمثال لإظهار كيف يمكن ل VSFG الكشف عن تفاصيل هندسية خاصة بالجزيء للمادة المنظمة. وقد ثبت أيضا أنه يمكن تحديد التفاصيل الهندسية الخاصة بالمواد الكيميائية ل MSA من خلال نهج حل وظائف الشبكة العصبية.

Protocol

1. مجهر VSFG لمسح الخط الطيفي نظام الليزراستخدم نظام ليزر نابض (انظر جدول المواد) متمركز عند 1025 نانومتر ± 5 نانومتر. يتم ضبط الليزر على 40 واط ، 200 كيلو هرتز (200 ميكروجول / نبضة) بعرض نبضة ~ 290 fs.ملاحظة: يمكن أن يختلف معدل التكرار الدقيق ، ويعمل الليزر بمعدل تكرار مرتفع بشكل أفضل …

Representative Results

الشكل 5: التركيب الجزيئي والتشكل واتجاه الجهد ل SDS@β-CD . (أ) المنظر العلوي و (ب) التركيب الكيميائي للمنظر الجانبي ل SDS@β-CD. ج: التوزيع التمثيلي غير المتجانس للعينات للصفائ…

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية هي من 1.42 إلى 1.44. من الأهمية بمكان محاذاة العدسة الموضوعية جيدا للحصول على دقة مكانية بصرية. من المهم أيضا جمع الإشارة المنبعثة والترحيل وإسقاط شعاع المسح كخط عند شقوق المدخل. ستضمن المحاذاة المناسبة أفضل دقة ونسبة إشارة إلى ضوضاء. بالنسبة لعينة نموذجية ، مثل أوراق SDS@2 ?…

Materials

1x Camera Por	Thorlabs	WFA4100	connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold	Thorlabs	MRA25-M01	reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack	Thorlabs	UPH3-P5	hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick	Thorlabs	LCP4S	convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm	Thorlabs	CEA1500	provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris	Thorlabs	LCP50S	control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket	Thorlabs	LCP01B	mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon	SLS Optics Ltd.	Customized	generate narrow-band 1030 nm light
Cage Plate Mounting Bracket	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD	Andor Technologies	Newton	2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier	Light Conversion	Orpheus-One-HP	Tunable MID light generator
Copper Chloride	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror	Newport	Customized	selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter	Thorlabs	SM1A34	provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective	Zeiss	420150-9900-000	Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective	Pike Technologies Inc.	891-0007	Reflective objective
Laser	Carbide, Light-Conversion	C18212	Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS	Thorlabs	M32RMSS	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving	Thorlabs	M32M27S	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
Manual Mid-Height Condenser Focus Module	Thorlabs	ZFM1030	adjust the focus of an optical element
Monochromator	Andor Technologies	Shamrock 500i	Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms	Thorlabs	ZFM2020	control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner	Mad City Labs Inc.	MMP3	3D sample stage
Resonant Scanner	EOPC	SC-25	325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera	Thorlabs	DCU224C	Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens	Thorlabs	ITL200	white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard	Thorlabs	OPX2400	incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm	Thorlabs	KCB1	hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage	Thorlabs	CSA2100	securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,	Thorlabs	C60L24	enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages	Thorlabs	MCM3001	control ZFM2020
Tube lens	Thorlabs	LA1380-AB – N-BK7	SFG signal collection
Visible LED Set	Thorlabs	WFA1010	provide illumination in imaging setup
Whitelight Source	Thorlabs	WFA1010	Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages	Optosigma	TSD-65122CUU	positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier	Thorlabs	XT95RC4	mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation	Thorlabs	XYR1	precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole	Thorlabs	XYT1	provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser	Light Conversion	CB3-40W	Seed laser
β-Cyclodextrin	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	Self-assembly component