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Chemistry

라인 스캐닝 진동 합계-주파수 생성 현미경을 사용한 다중 모드 비선형 초분광 화학 이미징

Published: December 01, 2023
doi:
10.3791/65388
, , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program,UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering,UC San Diego

Summary

명시야, 2차 고조파 생성(SHG) 이미징 방식과 함께 광대역 진동 합-주파수 생성(VSFG) 이미지를 얻기 위해 다중 모드의 빠른 초분광 이미징 프레임워크가 개발되었습니다. 적외선 주파수가 분자 진동과 공명하기 때문에 대칭 허용 샘플에 대한 미세한 구조 및 중경 형태 지식이 드러납니다.

Abstract

2차 비선형 광학 신호인 VSFG(Vibrational Sum-Frequency Generation)는 전통적으로 ~100μm의 공간 분해능을 가진 분광학 기술로 계면에서 분자를 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 분광법은 샘플의 이질성에 민감하지 않습니다. 메조스코프적으로 이질적인 샘플을 연구하기 위해 우리는 다른 사람들과 함께 VSFG 분광법의 해상도 한계를 ~1μm 수준으로 낮추고 VSFG 현미경을 구성했습니다. 이 이미징 기술은 이미징을 통해 샘플 형태를 분석할 수 있을 뿐만 아니라 이미지의 모든 픽셀에서 광대역 VSFG 스펙트럼을 기록할 수 있습니다. 2차 비선형 광학 기술인 이 선택 규칙은 생물학, 재료 과학 및 생명 공학 등에서 흔히 볼 수 있는 비중심대칭 또는 키랄 자체 조립 구조를 시각화할 수 있습니다. 이 기사에서 청중은 고정되지 않은 샘플을 이미징할 수 있는 반전된 투과 설계를 안내합니다. 이 연구는 또한 VSFG 현미경이 신경망 함수 솔버와 결합하여 개별 자체 조립 시트의 화학 물질별 기하학적 정보를 해결할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, 다양한 샘플의 명시야, SHG 및 VSFG 구성에서 얻은 이미지는 VSFG 이미징에서 드러나는 고유한 정보에 대해 간략하게 설명합니다.

Introduction

2차 비선형 광학 기법1,2인 VSFG(Vibrational Sum-Frequency Generation)는 대칭 허용 시료 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22입니다. 전통적으로 VSFG는 VSFG 활성의 요구 사항인 반전 대칭이 없는 계면 시스템 8,9,10,11(즉, 기체-액체, 액체-액체, 기체-고체, 고체-액체)에 적용되었습니다. VSFG의 이러한 응용은 매몰된 계면(12,13), 계면(14,15,16,17,18)에서의 물 분자의 구성, 및 계면(19,20,21,22)에서의 화학 종의 풍부한 분자 세부 정보를 제공하였다.

VSFG는 계면에서 분자 종과 구성을 결정하는 데 강력했지만 반전 중심이 없는 물질의 분자 구조를 측정하는 데 있어 그 잠재력은 충족되지 않았습니다. 이는 부분적으로 재료가 화학적 환경, 조성 및 기하학적 배열에서 이질적일 수 있고 기존 VSFG 분광기는 약 100μm2의 넓은 조명 영역을 갖기 때문입니다. 따라서 기존의 VSFG 분광법은 일반적인 100μm2 조명 영역에서 샘플의 앙상블 평균 정보를 보고합니다. 이러한 앙상블 평균화는 방향이 반대되는 잘 정렬된 영역 간의 신호 상쇄 및 국소 이질성의 오특성화(mischaracterization)를 유발할 수 있다 15,20,23,24.

높은 개구수(NA), 색수차가 거의 없는 반사 기반 현미경 대물렌즈(Schwarzschild 및 Cassegrain 형상)의 발전으로 VSFG 실험에서 두 빔의 초점 크기를 100μm2에서 1-2μm2로, 경우에 따라 서브미크론25로 줄일 수 있습니다. 이러한 기술 발전을 포함하여 당사 그룹 및 기타 업체는 VSFG를 현미경 플랫폼 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36으로 개발했습니다. 최근에는 반전된 광학 레이아웃 및 광대역 검출 방식(37)을 구현하여 멀티모달 이미지(VSFG, 2차 고조파 생성(SHG) 및 명시야 광학)을 원활하게 수집할 수 있습니다. 멀티 모달리티 이미징을 통해 광학 이미징을 사용하여 샘플을 빠르게 검사하고, 다양한 유형의 이미지를 상호 연관시키고, 샘플 이미지에서 신호 위치를 찾을 수 있습니다. 무채색 조명 광학 장치와 펄스 레이저 광원 선택을 통해 이 광학 플랫폼을 사용하면 형광 현미경38 및 라만 현미경과 같은 추가 기술을 향후 원활하게 통합할 수 있습니다.

이 새로운 배열에서는 계층적 조직 및 분자 자체 조립체(MSA) 클래스와 같은 샘플이 연구되었습니다. 이러한 재료에는 콜라겐과 생체 모방이 포함되며, 화학 조성과 기하학적 구성은 재료의 궁극적인 기능에 중요합니다. VSFG는 2차 비선형 광 신호이기 때문에 분자간 거리 또는 비틀림 각도와 같은 분자간 배열39,40에 특히 민감하여 화학 조성과 분자 배열을 모두 밝히는 데 이상적인 도구입니다. 이 연구는 광학 파라메트릭 증폭기(OPA)를 펌핑하는 이테르븀 도핑된 캐비티 고체 레이저, 2차원 하전 결합 장치(CCD) 검출기(27)에 결합된 자체 제작 멀티모달 도립 현미경 및 모노크로메이터 주파수 분석기로 구성된 핵심 기기의 VSFG, SHG 및 명시야 양식에 대해 설명합니다. 단계별 구성 및 정렬 절차와 설정의 전체 부품 목록이 제공됩니다. 기본 분자 소단위가 일반적인 계면활성제인 소듐-도데실 설페이트(SDS) 분자 1개와 본원에서 SDS@2 β-CD로 알려진 β-사이클로덱스트린(β-CD) 분자 2개로 구성된 MSA에 대한 심층 분석도 VSFG가 조직 물질의 분자 특이적 기하학적 세부 사항을 밝힐 수 있는 방법을 보여주는 예로 제공됩니다. 또한 MSA의 화학적 특이적 기하학적 세부 사항은 신경망 함수 솔버 접근 방식으로 결정할 수 있음이 입증되었습니다.

Protocol

1. 초분광 라인 스캐닝 VSFG 현미경 레이저 시스템1025nm ± 5nm를 중심으로 하는 펄스 레이저 시스템( 재료 표 참조)을 사용하십시오. 레이저는 ~290fs의 펄스 폭으로 40W, 200kHz(200μJ/펄스)로 설정됩니다.알림: 정확한 반복률은 다를 수 있으며 일반적으로 이 VSFG 현미경에는 반복률이 높은 레이저가 더 잘 작동합니다. 시드 레이저의 출력을 상용 OPA(Optical Parametric Amplifie…

Representative Results

그림 5: SDS@β-CD의 분자 구조, 형태 및 전위 방향. (A) 평면도 및 (B) SDS@β-CD의 측면도 화학 구조. (C) 샘플 평면에서 중간 규모 시트의 대표적인 이종 샘플 분포. 분자 소단위체는 기질에서 다른 방향과 정렬을 가질 수 있으며, 이는 ?…

Discussion

가장 중요한 단계는 1.42에서 1.44까지입니다. 광학 공간 해상도를 위해 대물 렌즈를 잘 정렬하는 것이 중요합니다. 방출된 신호를 수집하고, 릴레이하고, 스캐닝 빔을 입구 슬릿에 선으로 투사하는 것도 중요합니다. 적절한 정렬은 최상의 해상도와 신호 대 잡음비를 보장합니다. SDS@2 β-CD 100μm x 100μm 시트와 같은 일반적인 샘플의 경우 신호 대 노이즈 비율이 높은 양호한 해상도 이미지(~1μm 해상도)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

기기 개발은 Grant NSF CHE-1828666의 지원을 받습니다. ZW, JCW 및 WX는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립종합의학연구소(National Institute of General Medical Sciences), 보조금 1R35GM138092-01의 지원을 받습니다. BY는 중국과학원(CAS, 2021183)의 청년혁신추진협회의 지원을 받습니다.

Materials

1x Camera Por Thorlabs WFA4100 connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold Thorlabs MRA25-M01 reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack Thorlabs UPH3-P5 hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick Thorlabs LCP4S convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm Thorlabs CEA1500 provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris Thorlabs LCP50S control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket Thorlabs LCP01B mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon SLS Optics Ltd. Customized generate narrow-band 1030 nm light 
Cage Plate Mounting Bracket Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD Andor Technologies Newton  2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier Light Conversion Orpheus-One-HP Tunable MID light generator
Copper Chloride Thermo Fischer Scientific A16064.30 Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror Newport Customized selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter Thorlabs SM1A34 provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective Zeiss 420150-9900-000 Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective Pike Technologies Inc. 891-0007 Reflective objective
Laser Carbide, Light-Conversion C18212 Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS Thorlabs M32RMSS adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving Thorlabs M32M27S adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
Manual Mid-Height Condenser Focus Module Thorlabs ZFM1030 adjust the focus of an optical element
Monochromator Andor Technologies Shamrock 500i Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms Thorlabs ZFM2020 control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner Mad City Labs Inc. MMP3 3D sample stage
Resonant Scanner EOPC SC-25 325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera Thorlabs DCU224C Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens Thorlabs ITL200 white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard Thorlabs OPX2400 incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm Thorlabs KCB1 hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage Thorlabs CSA2100 securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, Thorlabs C60L24 enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fischer Scientific J63394.AK Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages Thorlabs MCM3001 control ZFM2020
Tube lens Thorlabs LA1380-AB – N-BK7 SFG signal collection
Visible LED Set Thorlabs WFA1010 provide illumination in imaging setup
Whitelight Source Thorlabs WFA1010 Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm  Thorlabs WPH05M-1030 alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm  Thorlabs WPLQ05M-3500 alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages Optosigma TSD-65122CUU positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier Thorlabs XT95RC4 mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation Thorlabs XYR1 precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole Thorlabs XYT1 provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser Light Conversion CB3-40W Seed laser
β-Cyclodextrin Thermo Fischer Scientific J63161.22 Self-assembly component
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