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Chemistry

Multimodale nichtlineare hyperspektrale chemische Bildgebung mit Line-Scanning-Schwingungssummen-Frequenz-Generierungsmikroskopie

Published: December 01, 2023
doi:
10.3791/65388
, , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program,UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering,UC San Diego

Summary

Es wurde ein multimodales, schnelles hyperspektrales Bildgebungssystem entwickelt, um breitbandige VSFG-Bilder (Vibrational Sum-Frequency Generation) zusammen mit Hellfeld-Bildgebungsmodalitäten der zweiten harmonischen Erzeugung (SHG) zu erhalten. Da die Infrarotfrequenz mit molekularen Schwingungen in Resonanz steht, werden mikroskopische strukturelle und mesoskopische morphologische Erkenntnisse über symmetriefähige Proben enthüllt.

Abstract

Die Erzeugung von Schwingungssummen (VSFG), ein nichtlineares optisches Signal zweiter Ordnung, wurde traditionell zur Untersuchung von Molekülen an Grenzflächen als Spektroskopietechnik mit einer räumlichen Auflösung von ~100 μm verwendet. Die Spektroskopie ist jedoch nicht empfindlich gegenüber der Heterogenität einer Probe. Um mesoskopisch heterogene Proben zu untersuchen, haben wir zusammen mit anderen die Auflösungsgrenze der VSFG-Spektroskopie auf ~1 μm gesenkt und das VSFG-Mikroskop konstruiert. Diese Bildgebungstechnik kann nicht nur die Morphologien der Proben durch Bildgebung auflösen, sondern auch ein breitbandiges VSFG-Spektrum an jedem Pixel der Bilder aufzeichnen. Da es sich um ein nichtlineares optisches Verfahren zweiter Ordnung handelt, ermöglicht seine Auswahlregel die Visualisierung nicht-zentrometrischer oder chiraler selbstorganisierter Strukturen, die unter anderem in der Biologie, den Materialwissenschaften und dem Bioingenieurwesen zu finden sind. In diesem Artikel wird das Publikum durch ein invertiertes Übertragungsdesign geführt, das die Abbildung nicht fixierter Proben ermöglicht. Diese Arbeit zeigt auch, dass die VSFG-Mikroskopie chemikalienspezifische geometrische Informationen einzelner selbstorganisierter Schichten auflösen kann, indem sie mit einem neuronalen Netzwerkfunktionslöser kombiniert wird. Schließlich werden die Bilder, die unter Hellfeld-, SHG- und VSFG-Konfigurationen verschiedener Proben aufgenommen wurden, kurz auf die einzigartigen Informationen eingehen, die durch die VSFG-Bildgebung enthüllt werden.

Introduction

Die Erzeugung von Schwingungssummen (VSFG), eine nichtlineare optische Technik zweiter Ordnung1,2, wurde ausgiebig als Spektroskopiewerkzeug eingesetzt, um symmetriefähigeProben 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 chemisch zu profilieren.14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Traditionell wurde VSFG auf die Grenzflächensysteme 8,9,10,11 (d. h. Gas-Flüssigkeit, Flüssig-Flüssig, Gas-Fest, Fest-Flüssig) angewendet, denen die Inversionssymmetrie fehlt – eine Voraussetzung für die VSFG-Aktivität. Diese Anwendung von VSFG hat eine Fülle von molekularen Details der vergrabenen Grenzflächen 12,13, der Konfigurationen von Wassermolekülen an den Grenzflächen 14,15,16,17,18 und der chemischen Spezies an den Grenzflächen 19,20,21,22 geliefert.

Obwohl VSFG bei der Bestimmung molekularer Spezies und Konfigurationen an Grenzflächen leistungsfähig war, wurde sein Potenzial bei der Messung molekularer Strukturen von Materialien, denen Inversionszentren fehlen, nicht ausgeschöpft. Dies liegt zum Teil daran, dass die Materialien in ihrer chemischen Umgebung, Zusammensetzung und geometrischen Anordnung heterogen sein können und ein herkömmliches VSFG-Spektrometer eine große Beleuchtungsfläche in der Größenordnung von 100 μm2 hat. So berichtet die traditionelle VSFG-Spektroskopie über eine typische Beleuchtungsfläche von 100 μm2 über Ensemble-gemittelte Informationen der Probe. Diese Ensemble-Mittelung kann zu Signalauslöschungen zwischen wohlgeordneten Domänen mit entgegengesetzten Orientierungen und zu einer Fehlcharakterisierung lokaler Heterogenitäten führen 15,20,23,24.

Mit Fortschritten bei reflektierenden Mikroskopobjektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) (Schwarzschild- und Cassegrain-Geometrie), die nahezu frei von chromatischen Aberrationen sind, kann die Fokusgröße der beiden Strahlen in VSFG-Experimenten von 100 μm2 auf 1-2μm2 und in einigen Fällen Submikron25 verringert werden. Unter Berücksichtigung dieses technologischen Fortschritts haben unsere Gruppe und andere VSFG zu einer Mikroskopieplattform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 entwickelt. Vor kurzem haben wir ein invertiertes optisches Layout und ein breitbandiges Detektionsschema37 implementiert, das eine nahtlose Erfassung multimodaler Bilder (VSFG, zweite harmonische Generation (SHG) und optische Hellfeldbilder) ermöglicht. Die multimodale Bildgebung ermöglicht eine schnelle Inspektion von Proben mit optischer Bildgebung, die Korrelation verschiedener Arten von Bildern miteinander und die Lokalisierung von Signalpositionen auf den Probenbildern. Mit der achromatischen Beleuchtungsoptik und der Wahl der gepulsten Laserbeleuchtungsquelle ermöglicht diese optische Plattform die zukünftige nahtlose Integration zusätzlicher Techniken wie Fluoreszenzmikroskopie38 und Raman-Mikroskopie, um nur einige zu nennen.

In dieser neuen Anordnung wurden Proben wie hierarchische Organisationen und eine Klasse von molekularen Selbstassemblierungen (MSAs) untersucht. Zu diesen Materialien gehören Kollagen und Biomimetika, bei denen sowohl die chemische Zusammensetzung als auch die geometrische Organisation für die letztendliche Funktion des Materials wichtig sind. Da es sich bei VSFG um ein nichtlineares optisches Signal zweiter Ordnung handelt, ist es spezifisch empfindlich für intermolekulare Anordnungen39,40, wie z. B. intermolekulare Abstände oder Verdrehungswinkel, was es zu einem idealen Werkzeug für die Aufdeckung sowohl chemischer Zusammensetzungen als auch molekularer Anordnungen macht. Diese Arbeit beschreibt die VSFG-, SHG- und Hellfeld-Modalitäten des Kerninstruments, das aus einem Ytterbium-dotierten Hohlraum-Festkörperlaser besteht, der einen optisch-parametrischen Verstärker (OPA), ein selbstgebautes multimodales inverses Mikroskop und einen Monochromator-Frequenzanalysator pumpt, der mit einem zweidimensionalen CCD-Detektor (Charged Coupled Device)27 gekoppelt ist. Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Konstruktion und Ausrichtung sowie eine vollständige Stückliste des Aufbaus werden bereitgestellt. Eine eingehende Analyse eines MSA, dessen fundamentale molekulare Untereinheit aus einem Molekül Natrium-Dodecylsulfat (SDS), einem gewöhnlichen Tensid, und zwei Molekülen β-Cyclodextrin (β-CD), bekannt als SDS@2 β-CD, besteht, wird ebenfalls als Beispiel bereitgestellt, um zu zeigen, wie VSFG molekülspezifische geometrische Details von organisierter Materie aufdecken kann. Es wurde auch gezeigt, dass chemikalienspezifische geometrische Details der MSA mit einem neuronalen Netzfunktionslöser-Ansatz bestimmt werden können.

Protocol

1. Hyperspektrales Zeilen-Scanning-VSFG-Mikroskop LasersystemVerwenden Sie ein gepulstes Lasersystem (siehe Materialtabelle), zentriert bei 1025 nm ± 5 nm. Der Laser ist auf 40 W, 200 kHz (200 μJ/Puls) mit einer Pulsbreite von ~290 fs eingestellt.HINWEIS: Die genaue Wiederholrate kann variieren, und ein Laser mit hoher Wiederholrate eignet sich im Allgemeinen besser für dieses VSFG-Mikroskop. Leiten Sie den Ausgang des Seed-Lasers in einen handelsüblichen optisch-para…

Representative Results

Abbildung 5: Molekularstruktur, Morphologie und potentielle Orientierung von SDS@β-CD . (A) Draufsicht und (B) Seitenansicht der chemischen Struktur von SDS@β-CD. (C) Repräsentative heterogene Probenverteilung der mesoskaligen Schichten auf der Probenebene. Die molekulare Untereinheit könnte unt…

Discussion

Die kritischsten Schritte sind von 1,42 bis 1,44. Es ist wichtig, die Objektivlinse gut auszurichten, um eine optische räumliche Auflösung zu erzielen. Es ist auch wichtig, das emittierte Signal zu sammeln, weiterzuleiten und den Abtaststrahl als Linie an den Eingangsschlitzen zu projizieren. Die richtige Ausrichtung würde die beste Auflösung und das beste Signal-Rausch-Verhältnis garantieren. Für eine typische Probe, wie z. B. SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm Blätter, würde ein Bild mit guter Auflösung (~1 μm Auf…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Entwicklung des Instruments wird durch den Zuschuss NSF CHE-1828666 unterstützt. ZW, JCW und WX werden von den National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01, unterstützt. BY wird von der Youth Innovation Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (CAS, 2021183) unterstützt.

Materials

1x Camera Por Thorlabs WFA4100 connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold Thorlabs MRA25-M01 reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack Thorlabs UPH3-P5 hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick Thorlabs LCP4S convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm Thorlabs CEA1500 provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris Thorlabs LCP50S control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket Thorlabs LCP01B mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon SLS Optics Ltd. Customized generate narrow-band 1030 nm light 
Cage Plate Mounting Bracket Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD Andor Technologies Newton  2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier Light Conversion Orpheus-One-HP Tunable MID light generator
Copper Chloride Thermo Fischer Scientific A16064.30 Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror Newport Customized selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter Thorlabs SM1A34 provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective Zeiss 420150-9900-000 Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective Pike Technologies Inc. 891-0007 Reflective objective
Laser Carbide, Light-Conversion C18212 Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS Thorlabs M32RMSS adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving Thorlabs M32M27S adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
Manual Mid-Height Condenser Focus Module Thorlabs ZFM1030 adjust the focus of an optical element
Monochromator Andor Technologies Shamrock 500i Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms Thorlabs ZFM2020 control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner Mad City Labs Inc. MMP3 3D sample stage
Resonant Scanner EOPC SC-25 325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera Thorlabs DCU224C Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens Thorlabs ITL200 white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard Thorlabs OPX2400 incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm Thorlabs KCB1 hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage Thorlabs CSA2100 securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, Thorlabs C60L24 enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fischer Scientific J63394.AK Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages Thorlabs MCM3001 control ZFM2020
Tube lens Thorlabs LA1380-AB – N-BK7 SFG signal collection
Visible LED Set Thorlabs WFA1010 provide illumination in imaging setup
Whitelight Source Thorlabs WFA1010 Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm  Thorlabs WPH05M-1030 alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm  Thorlabs WPLQ05M-3500 alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages Optosigma TSD-65122CUU positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier Thorlabs XT95RC4 mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation Thorlabs XYR1 precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole Thorlabs XYT1 provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser Light Conversion CB3-40W Seed laser
β-Cyclodextrin Thermo Fischer Scientific J63161.22 Self-assembly component
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Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z., Xiong, W. Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65388, doi:10.3791/65388 (2023).
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