Summary
Es wurde ein multimodales, schnelles hyperspektrales Bildgebungssystem entwickelt, um breitbandige VSFG-Bilder (Vibrational Sum-Frequency Generation) zusammen mit Hellfeld-Bildgebungsmodalitäten der zweiten harmonischen Erzeugung (SHG) zu erhalten. Da die Infrarotfrequenz mit molekularen Schwingungen in Resonanz steht, werden mikroskopische strukturelle und mesoskopische morphologische Erkenntnisse über symmetriefähige Proben enthüllt.
Abstract
Die Erzeugung von Schwingungssummen (VSFG), ein nichtlineares optisches Signal zweiter Ordnung, wurde traditionell zur Untersuchung von Molekülen an Grenzflächen als Spektroskopietechnik mit einer räumlichen Auflösung von ~100 μm verwendet. Die Spektroskopie ist jedoch nicht empfindlich gegenüber der Heterogenität einer Probe. Um mesoskopisch heterogene Proben zu untersuchen, haben wir zusammen mit anderen die Auflösungsgrenze der VSFG-Spektroskopie auf ~1 μm gesenkt und das VSFG-Mikroskop konstruiert. Diese Bildgebungstechnik kann nicht nur die Morphologien der Proben durch Bildgebung auflösen, sondern auch ein breitbandiges VSFG-Spektrum an jedem Pixel der Bilder aufzeichnen. Da es sich um ein nichtlineares optisches Verfahren zweiter Ordnung handelt, ermöglicht seine Auswahlregel die Visualisierung nicht-zentrometrischer oder chiraler selbstorganisierter Strukturen, die unter anderem in der Biologie, den Materialwissenschaften und dem Bioingenieurwesen zu finden sind. In diesem Artikel wird das Publikum durch ein invertiertes Übertragungsdesign geführt, das die Abbildung nicht fixierter Proben ermöglicht. Diese Arbeit zeigt auch, dass die VSFG-Mikroskopie chemikalienspezifische geometrische Informationen einzelner selbstorganisierter Schichten auflösen kann, indem sie mit einem neuronalen Netzwerkfunktionslöser kombiniert wird. Schließlich werden die Bilder, die unter Hellfeld-, SHG- und VSFG-Konfigurationen verschiedener Proben aufgenommen wurden, kurz auf die einzigartigen Informationen eingehen, die durch die VSFG-Bildgebung enthüllt werden.
Introduction
Die Erzeugung von Schwingungssummen (VSFG), eine nichtlineare optische Technik zweiter Ordnung1,2, wurde ausgiebig als Spektroskopiewerkzeug eingesetzt, um symmetriefähigeProben 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 chemisch zu profilieren.14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Traditionell wurde VSFG auf die Grenzflächensysteme 8,9,10,11 (d. h. Gas-Flüssigkeit, Flüssig-Flüssig, Gas-Fest, Fest-Flüssig) angewendet, denen die Inversionssymmetrie fehlt - eine Voraussetzung für die VSFG-Aktivität. Diese Anwendung von VSFG hat eine Fülle von molekularen Details der vergrabenen Grenzflächen 12,13, der Konfigurationen von Wassermolekülen an den Grenzflächen 14,15,16,17,18 und der chemischen Spezies an den Grenzflächen 19,20,21,22 geliefert.
Obwohl VSFG bei der Bestimmung molekularer Spezies und Konfigurationen an Grenzflächen leistungsfähig war, wurde sein Potenzial bei der Messung molekularer Strukturen von Materialien, denen Inversionszentren fehlen, nicht ausgeschöpft. Dies liegt zum Teil daran, dass die Materialien in ihrer chemischen Umgebung, Zusammensetzung und geometrischen Anordnung heterogen sein können und ein herkömmliches VSFG-Spektrometer eine große Beleuchtungsfläche in der Größenordnung von 100 μm2 hat. So berichtet die traditionelle VSFG-Spektroskopie über eine typische Beleuchtungsfläche von 100 μm2 über Ensemble-gemittelte Informationen der Probe. Diese Ensemble-Mittelung kann zu Signalauslöschungen zwischen wohlgeordneten Domänen mit entgegengesetzten Orientierungen und zu einer Fehlcharakterisierung lokaler Heterogenitäten führen 15,20,23,24.
Mit Fortschritten bei reflektierenden Mikroskopobjektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) (Schwarzschild- und Cassegrain-Geometrie), die nahezu frei von chromatischen Aberrationen sind, kann die Fokusgröße der beiden Strahlen in VSFG-Experimenten von 100 μm2 auf 1-2μm2 und in einigen Fällen Submikron25 verringert werden. Unter Berücksichtigung dieses technologischen Fortschritts haben unsere Gruppe und andere VSFG zu einer Mikroskopieplattform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 entwickelt. Vor kurzem haben wir ein invertiertes optisches Layout und ein breitbandiges Detektionsschema37 implementiert, das eine nahtlose Erfassung multimodaler Bilder (VSFG, zweite harmonische Generation (SHG) und optische Hellfeldbilder) ermöglicht. Die multimodale Bildgebung ermöglicht eine schnelle Inspektion von Proben mit optischer Bildgebung, die Korrelation verschiedener Arten von Bildern miteinander und die Lokalisierung von Signalpositionen auf den Probenbildern. Mit der achromatischen Beleuchtungsoptik und der Wahl der gepulsten Laserbeleuchtungsquelle ermöglicht diese optische Plattform die zukünftige nahtlose Integration zusätzlicher Techniken wie Fluoreszenzmikroskopie38 und Raman-Mikroskopie, um nur einige zu nennen.
In dieser neuen Anordnung wurden Proben wie hierarchische Organisationen und eine Klasse von molekularen Selbstassemblierungen (MSAs) untersucht. Zu diesen Materialien gehören Kollagen und Biomimetika, bei denen sowohl die chemische Zusammensetzung als auch die geometrische Organisation für die letztendliche Funktion des Materials wichtig sind. Da es sich bei VSFG um ein nichtlineares optisches Signal zweiter Ordnung handelt, ist es spezifisch empfindlich für intermolekulare Anordnungen39,40, wie z. B. intermolekulare Abstände oder Verdrehungswinkel, was es zu einem idealen Werkzeug für die Aufdeckung sowohl chemischer Zusammensetzungen als auch molekularer Anordnungen macht. Diese Arbeit beschreibt die VSFG-, SHG- und Hellfeld-Modalitäten des Kerninstruments, das aus einem Ytterbium-dotierten Hohlraum-Festkörperlaser besteht, der einen optisch-parametrischen Verstärker (OPA), ein selbstgebautes multimodales inverses Mikroskop und einen Monochromator-Frequenzanalysator pumpt, der mit einem zweidimensionalen CCD-Detektor (Charged Coupled Device)27 gekoppelt ist. Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Konstruktion und Ausrichtung sowie eine vollständige Stückliste des Aufbaus werden bereitgestellt. Eine eingehende Analyse eines MSA, dessen fundamentale molekulare Untereinheit aus einem Molekül Natrium-Dodecylsulfat (SDS), einem gewöhnlichen Tensid, und zwei Molekülen β-Cyclodextrin (β-CD), bekannt als SDS@2 β-CD, besteht, wird ebenfalls als Beispiel bereitgestellt, um zu zeigen, wie VSFG molekülspezifische geometrische Details von organisierter Materie aufdecken kann. Es wurde auch gezeigt, dass chemikalienspezifische geometrische Details der MSA mit einem neuronalen Netzfunktionslöser-Ansatz bestimmt werden können.
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Protocol
1. Hyperspektrales Zeilen-Scanning-VSFG-Mikroskop
- Lasersystem
- Verwenden Sie ein gepulstes Lasersystem (siehe Materialtabelle), zentriert bei 1025 nm ± 5 nm. Der Laser ist auf 40 W, 200 kHz (200 μJ/Puls) mit einer Pulsbreite von ~290 fs eingestellt.
HINWEIS: Die genaue Wiederholrate kann variieren, und ein Laser mit hoher Wiederholrate eignet sich im Allgemeinen besser für dieses VSFG-Mikroskop. - Leiten Sie den Ausgang des Seed-Lasers in einen handelsüblichen optisch-parametrischen Verstärker (OPA), um einen Strahl im mittleren Infrarotbereich (MIR) zu erzeugen (siehe Materialtabelle). Passen Sie die MIR an die Häufigkeit der Interessen an (Abbildung 1A).
ANMERKUNG: In der vorliegenden Studie ist die MIR bei 3450 nm ± 85 nm (~2900 ± 72 cm-1) mit einer Pulsdauer von ~290 fs und einer Pulsenergie von ~6 μJ zentriert, was einen Teil der funktionellen Gruppenregion -CHx umfasst.
- Verwenden Sie ein gepulstes Lasersystem (siehe Materialtabelle), zentriert bei 1025 nm ± 5 nm. Der Laser ist auf 40 W, 200 kHz (200 μJ/Puls) mit einer Pulsbreite von ~290 fs eingestellt.
- Aufwärts-Konvertierungsbalken
- Lassen Sie den verbleibenden 1025-nm-Strahl von OPA durch ein Fabry-Perot-Etalon (siehe Materialtabelle) leiten, um einen spektral verengten Aufwärtskonversionsstrahl mit einer FWHM von ~4,75 cm-1 zu erzeugen.
- Filtern Sie den verengten 1025-nm-Strahl mit einer 8-μm-Saphirblende räumlich.
HINWEIS: Der 1025-nm-Strahl kann mit einer NIR-Karte visualisiert werden. - Kontrollieren Sie die Polarisation des 1025-nm-Pulses mit einer λ/2-Verzögerungsplatte (siehe Materialtabelle).
- MIR-Strahl
- Führen Sie den MIR-Strahl durch eine Verzögerungsstufe zur Feinsteuerung der zeitlichen Überlappung.
- Steuern Sie die Polarisation der MIR mit einer λ/2-Verzögerungsplatte.
- VSFG-Mikroskop
- Räumliche Überlappung sowohl der Aufwärtswandlung als auch der MIR-Strahlen an einem angepassten dichroitischen Spiegel (DM, Abbildung 1B), der für MIR durchlässig und für NIR reflektierend ist (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie zwei Irisblenden, um die Ausrichtung zu steuern: eine direkt nach dem DM und eine am anderen Ende. Verwenden Sie einen Leistungsmesser nach der Iris, um festzustellen, ob die MIR zentriert ist, und verwenden Sie eine NIR-Karte, um die NIR-Positionen zu lokalisieren.
HINWEIS: Nach der Überlappung kann der NIR-Strahl verwendet werden, um beide Strahlen zu führen. - Richten Sie die überlappenden Strahlen in ein inverses Mikroskop mit einem integrierten 325-Hz-Einachs-Resonanzstrahlscanner (montiert an einem integrierten Zwei-Positionen-Scanner (I2PS), Abbildung 1B) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Der Resonanzscanner projiziert eine Linie der beiden überlappenden Strahlen auf die hintere Apertur des Kondensorobjektivs. Es ist an einem Schieberegler montiert, der die nahtlose Neukonfiguration zwischen VSFG/SHG- und Hellfeld-Modalitäten ermöglicht. - Fokussieren Sie die beiden räumlich überlappenden Strahlen mit einem rein reflektierenden Schwarzschildobjektiv (SO, Abbildung 1B,D) auf die Probe (siehe Materialtabelle).
- Erfassen Sie das von der Probe erzeugte VSFG-Signal mit einem unendlich korrigierten Brechungsobjektiv (RO, Abbildung 1B,D) (siehe Materialtabelle).
- Das kollimierte Ausgangssignal VSFG wird durch einen linearen Polarisator und dann durch ein telezentrisches Tubuslinsensystem geführt, das aus zwei f = 60 mm Brennweitenlinsen (TL1 und TL2, Abbildung 1B,C) besteht (siehe Materialtabelle).
ANMERKUNG: Das vergrößerte Bild der Tubuslinsen wird am Eingangsspalt des Monochromators (MC, Abbildung 1B, C) erzeugt, und die räumlich / frequenzaufgelösten Daten werden auf einem zweidimensionalen CCD-Detektor (CCD, Abbildung 1B) erfasst.
- Räumliche Überlappung sowohl der Aufwärtswandlung als auch der MIR-Strahlen an einem angepassten dichroitischen Spiegel (DM, Abbildung 1B), der für MIR durchlässig und für NIR reflektierend ist (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie zwei Irisblenden, um die Ausrichtung zu steuern: eine direkt nach dem DM und eine am anderen Ende. Verwenden Sie einen Leistungsmesser nach der Iris, um festzustellen, ob die MIR zentriert ist, und verwenden Sie eine NIR-Karte, um die NIR-Positionen zu lokalisieren.
- SHG-Modus
- Um zur SHG-Bildgebung zu wechseln, blockieren Sie den IR-Strahl und drehen Sie das Gitter des Spektrographen auf 501,5 nm, um das SHG-Signal abzubilden.
- Hellfeld-Modus
- Um zur optischen Hellfeld-Bildgebung zu wechseln, schalten Sie die Weißlichtquelle ein (siehe Materialtabelle). Bewegen Sie den integrierten Schieberegler (I2PS, Abbildung 1B), um Hellfeldbilder in gegenläufiger Richtung zu erfassen, wobei das Bildobjektiv (RO) als Kondensor und das Kondensorobjektiv (SO) als Abbildungsobjektiv fungieren.
- Erstellen Sie ein Bild der kollimierten Ausgabe des refraktiven Objektivs auf der Sensorebene einer RGB-Hellfeldkamera mit einem handelsüblichen Tubus-Linsensystem (siehe Materialtabelle).
Abbildung 1: Multimodales hyperspektrales VSFG-Mikroskop. (A) Draufsicht auf das Core-Setup. Ein 1025-nm-Pumplaser wurde zu einem OPA geschickt, um einen abstimmbaren Puls im mittleren IR-Bereich zu erzeugen. Die verbleibenden 1025 nm wurden häufig durch ein Etalon (E) eingeengt und durch einen räumlichen Filter (SFG) räumlich zu einem Gaußschen Strahl gefiltert. Strahlen im mittleren IR- und 1025-nm-Bereich werden an einem kundenspezifischen dichroitischen Spiegel (DM) räumlich überlappt und durch das inverse Mikroskop geführt (geschachtelter Bereich in A). (B) Die beiden Strahlen werden an einen 325-Hz-Resonanzstrahlscanner gesendet, der an einem integrierten 2-Positionen-Schieber (I2PS) montiert ist, der einen nahtlosen Wechsel zwischen Hellfeld und nichtlinearen optischen Modalitäten ermöglicht. Die Mikroskopplattform ist mit einem reflexionsbasierten, unendlich korrigierten Schwarzschild-Objektiv (SO) ausgestattet, das als Kondensor fungiert, und einem refraktiven, unendlich korrigierten Bildgebungsobjektiv (RO), das auf einem vertikalen Nanopositionierungstisch (VNP) der Z-Achse montiert ist. Der SO fokussiert die Linie der eingehenden Strahlen, die der Resonanzstrahlscanner auf die Probe reflektiert, während der RO den VSFG-Linienabschnitt der Signale sammelt. Es ist wichtig, die Position der Z-Achse des RO mit einer Genauigkeit von 1 μm fein zu steuern, um sicherzustellen, dass sich die Probe im besten Fokuszustand für eine qualitativ hochwertige Bildgebung befindet. Die kollimierte Linie des VSFG-Signals wird dann auf ein Tubuslinsensystem geleitet, das aus 2 Tub-Linsen (TL1 und TL2) besteht und ein vergrößertes Bild am Eingangsspalt des Monochromators (MC) bildet. Die frequenzaufgelöste Spektrenlinie wird dann hyperspektral auf einem ladungsgekoppelten Bauelement (CCD) abgebildet. Nach dem Sammeln jeder Hyperspektrallinie wird die Probe in der Achse senkrecht zur Scanachse des Resonanzstrahlscanners mit dem NP abgetastet. Um Hellfeldbilder der Probe zu sammeln, wird der I2PS in die Hellfeldposition bewegt und ein Spiegel installiert, der die Weißlichtquelle (WLS) abfängt. Das Licht wird dann von der RO fokussiert und von der SO abgebildet. Anschließend wird ein Bild auf der Sensorebene der Hellfeldkamera (BC) an der Oberseite des inversen Mikroskops erzeugt. (C) Detaillierte Ansicht des optischen Weges durch den Tubus-Linsenbereich in den MC und CCD. (D) Detailansicht des Probenbereichs zwischen SO und RO. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Hyperspektrale Mikroskopausrichtung und räumliche Kalibrierung der vertikalen CCD-Achse
- Optimieren Sie grob die Position der Probenebene (z-Achse des Nanopositionierers) mit einer Standardprobe aus ZnO-Muster (1 μm dick), die mit 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm Deckglas beschichtet ist, und bringen Sie sie mit der Hellfeld-Bildgebungsmodalität in den Hellfeldfokus.
HINWEIS: Die Z-Position des RO sowie die Ausrichtung des Weißlichts müssen möglicherweise bei Bedarf angepasst werden. Ein repräsentatives Bild des ZnO auf dem Glasmuster, das für die Ausrichtungskalibrierung verwendet wird, ist in Abbildung 2 dargestellt. - Schieben Sie den I2PS zurück zum nichtlinearen Beleuchtungsarm und optimieren Sie die Probenhöhe für die maximale nichtresonante VSFG-Intensität, die von den von der CCD-Kamera beobachteten ZnO-Bereichen erzeugt wird.
HINWEIS: Die Z-Position des RO muss für maximale Intensität eingestellt werden. Es kann sein, dass man die Schritte 2.1 und 2.2 einige Male wiederholen muss, bevor die optimale Höhe der Probe und RO erreicht ist. - Schalten Sie den Resonanzstrahlscanner ein und sammeln Sie eine Zeile der Bilder.
- Erfassen Sie Bilder mit nichtresonanter Intensität, indem Sie die Probe senkrecht zur Richtung des Strahlscanners abtasten. Nehmen Sie vertikale Scheiben der Bilddaten und legen Sie das Pixel-Mikrometer-Verhältnis fest. (siehe Abbildung 3 und die dazugehörige Legende).
HINWEIS: Die Ableitung dieser Linienabschnitte wird analysiert, um das vertikale Verhältnis von Pixel zu Mikrometer auf der vertikalen CCD-Achse zu erzeugen, das für zukünftige Bilder verwendet wird.
Abbildung 2: Repräsentative Bildqualität für die grobe Ausrichtung der Hellfeld-Bildgebungsmodalität eines ZnO-Musters. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Arbeitsablauf bei der Kalibrierung der vertikalen Achse. Diese Abbildung zeigt, wie die CCD-Pixel in vertikale räumliche Abmessungen in der Einheit μm umgerechnet werden. (A) Ein Bild des ZnO-gemusterten Deckglases wird gesammelt und rekonstruiert. Dann der Pixelabstand von einer Kante zur anderen Kante des Musters (kleiner vertikaler Balken in A). Da das ZnO-Musterkreuz für eine Breite von 25 μm ausgelegt ist, kann man hier das Verhältnis von physikalischer Breite zu Pixelbreite verwenden, um das Verhältnis von physikalischen zu Pixelmaßen zu berechnen. Ein repräsentatives, auf der vertikalen Achse kalibriertes Bild ist in (B) dargestellt. (C) Zum Schluss wird eine vertikale Scheibe genommen, die durch die rote Linie gekennzeichnet ist. (D) Die Ableitung des vertikalen Schnitts wird verwendet, um die räumliche Auflösung zu erhalten. Die Ableitung des vertikalen Schnitts wird verwendet, um die räumliche Auflösung zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Hyperspektrale Datenerfassung
- Sammeln Sie die Spektren einer vertikalen Linie der VSFG-Signale auf dem CCD, deren Spektren entlang der horizontalen Achse gestreut sind und deren räumliche Positionen auf der vertikalen Achse des CCD aufgezeichnet werden.
Hinweis: Dies führt zu einem zweidimensionalen Datensatz für einen einzeiligen Abschnitt. - Nachdem der Linienschnitt der Probe hyperspektral abgebildet wurde, scannen Sie die Probe in der Achse senkrecht zur Linienabtastachse mit dem dreidimensionalen Nanopositionierer (NP, Abbildung 1).
HINWEIS: Der 3D-Nanopositionierer ist wichtig für eine hohe Präzision und Reproduzierbarkeit bei der Lokalisierung von Probenbereichen (x-y-Ebene) sowie bei der Fokussierung der Probe (z-Achse). - Durchlaufen Sie zwischen Schritt 3.1 und Schritt 3.2, um ein hyperspektrales VSFG-Bild zu erfassen.
4. Hyperspektrale Datenanalyse
- Entmischen Sie die Daten spektral unter Verwendung des Arbeitsablaufs41 der Hyperspektral-Bildgebungsbibliothek der MatLab-Bildgebungstoolbox.
HINWEIS: Die spektrale Entmischung korreliert räumliche Positionen mit eindeutigen Spektren. Matlab-Code für die hyperspektrale Datenanalyse wird in Ergänzungsdatei 1 bereitgestellt.- Erstellen Sie einen 4-dimensionalen Hyperwürfel (x = räumlich, y = räumlich, z = frequenzabhängige Intensität, ω = Frequenz) unter Verwendung der Hyperwürfelfunktion in der Hyperspektral-Bildgebungsbibliothek41 der Matlab Image processing Toolbox.
- Identifizieren Sie die Anzahl der eindeutigen Spektren mit der Funktion countEndmembersHFC mit einem PFA-Wert (Probability of False Alarm) von 10-7.
- Identifizieren Sie eindeutige Spektren mit der nfindr-Funktion zur spektralen Entmischung.
- Verknüpfen Sie abschließend mit der sid-Funktion jedes Pixel mit einem der eindeutigen Spektren, die im vorherigen Schritt identifiziert wurden.
HINWEIS: Zusätzliche spektrale Entmischungs- und Anpassungsmethoden können mit alternativen Funktionen/Algorithmen durchgeführt werden, die in der MatLab Hyperspectral Imaging Library41 angeboten werden.
- Passen Sie die Summendaten für jedes isolierte Blatt an die Voigt-Funktion42 (Ergänzungsdatei 1) an.
ANMERKUNG: Die Lorentzsche Funktion stellt den reinen homogenen Linienformgrenzwert dar, während die Gaußsche Funktion aus inhomogenen Grenzwerten stammt. In der Realität könnten sich die Systeme in einer Kombination aus homogenen und inhomogenen Grenzen befinden, was eine Voigt-Funktion erfordert - eine gängige Praxis für die Kondensphasenspektroskopie, einschließlich VSFG.
5. Geometrische Analyse der Probe
- Bestimmen Sie die Geometrie der Proben nach dem in Schritt 5.2-5.3 beschriebenen Verfahren. In dieser Studie wird SDS@2 β-CD als Beispiel verwendet. Die symmetrieerlaubten Tensorelemente von χ(2) werden basierend auf derC7-Symmetrie der molekularen Untereinheit der SDS@2 β-CD-Mesoblattprobe hergeleitet.
ANMERKUNG: Die zulässige Symmetrie χ(2) hängt von der Symmetrie ab. Zur Berechnung der zulässigen nichtlinearen Suszeptibilität einer beliebigen Symmetrie siehe Referenz43. - Wenden Sie die Euler-Rotation27 an, um die Laborrahmenmessungen mit dem molekularen Rahmen in Beziehung zu setzen.
ANMERKUNG: Im Fall von SDS@2 β-CD führt seineC7-Symmetrie zu acht unabhängigen Gleichungen, die 8 Ausgang (Laborrahmen χ(2)) mit 8 Eingaben (6 unabhängige Hyperpolarisierbarkeit β(2)) und zwei Winkel in Beziehung setzen: Θ, der Neigungswinkel relativ zur Probenebene aller Blätter, und φ, die Drehung des Blattes in der Ebene (Abbildung 4)). Zwei Blätter werden verwendet, um die gemeinsamen molekularen Ausrichtungen der beiden Blätter zu extrahieren. Die Beziehungen zwischen φ1 und φ2 (Drehwinkel der beiden Blätter in der Ebene) können aus den Hellfeldbildern extrahiert werden. Im aktuellen Beispiel ist φ2 = φ1 + 60°. Es wird angenommen, dass alle Moleküleinheiten im gleichen Winkel kacheln, also Θ1 = Θ2. Daraus ergeben sich 11 Unbekannte (9 unabhängige, darunter 6 unabhängige Hyperpolarisierbarkeit β(2), Θ 1 und φ1 und das relative Abdeckungsverhältnis zwischen Blatt N und den beiden abhängigen Winkeln, die φ 2 und Θ2 sind) für 16 bekannte (8 Laborrahmenpolarisationen pro Blatt und zwei Blätter). - Beziehen Sie den polarisationsaufgelösten Laborrahmen χ(2) und die Hyperpolarisierbarkeit des molekularen Rahmens β(2) mit einem neuronalen Netzfunktionslöser.
ANMERKUNG: Eine ausführliche Zusammenfassung dieses Ansatzes findet sich in Referenz27.- Erstellen Sie ein mehrschichtiges neuronales Netzwerkmodell in Python44mit Keras, das aus einer 200-100-50-Knotenstruktur und einer hyperbolischen Tangentenaktivierungsfunktion besteht.
- Erstellen Sie eine zufällig generierte 100000 x 11 Matrix mit den Werten β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 und N. Berechnen Sie den entsprechenden Laborrahmen 16 χ(2) unter Verwendung der Gleichung, die in 5.2 durch Euler-Rotationen bestimmt wird.
- Verwenden Sie die berechneten χ(2)-Werte (insgesamt 100.000 x 16 Werte) als Eingabe und lernen Sie, 11 Werte (β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 und N) vorherzusagen, wenn Sie 16 χ(2)-Werte erhalten.
- Verwenden Sie nach dem Trainieren einen weiteren Satz von 1000 Einträgen mit den Eingaben und Ausgaben, um das trainierte Modell zu testen. Die vorhergesagte Ausgabe und die tatsächliche Ausgabe sollten eine lineare Beziehung mit einer Steigung von 1 aufweisen.
- Zum Schluss liefern Sie das experimentell gemessene χ(2) aus zwei Blättern (jedes Blatt hat 8 χ(2 ) gemessen) und verwenden Sie das trainierte Modell, um den Neigungswinkel Θ zusammen mit anderen Eigenschaften vorherzusagen.
Abbildung 4: Illustration der Euler-Transformation. (A) Darstellung der Euler-Transformation zwischen der Laborkoordinate (XYZ) II. Ordnung χ(2) und der Hyperpolarisierbarkeit der Molekülkoordinaten (xyz) βijk. Die z-y'-z'' Euler-Rotation wird auf den Molekülkoordinaten durchgeführt, wobei φ als Drehwinkel in der Ebene, θ als Neigungswinkel und ψ als Drehwinkel gilt. ψ ist für beliebige Verdrehwinkel um die Molekülachse integriert. φ ist nicht integriert, da sich alle Moleküle in einem bestimmten Winkel relativ zum Laborrahmen drehen, um die selbstorganisierten Schichten zu bilden. N ist die relative Flächendeckung der beiden Blätter. (B) Visualisierung der geneigten Untereinheiten, die ein Blatt bilden, das durch die Ergebnisse des neuronalen Netzes bestimmt wird. Diese Zahl wurde von Wagner et al.27 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Abbildung 5: Molekularstruktur, Morphologie und potentielle Orientierung von SDS@β-CD . (A) Draufsicht und (B) Seitenansicht der chemischen Struktur von SDS@β-CD. (C) Repräsentative heterogene Probenverteilung der mesoskaligen Schichten auf der Probenebene. Die molekulare Untereinheit könnte unterschiedliche Orientierungen und Ausrichtungen auf dem Substrat haben, was unbekannt ist. Diese Zahl wurde von Wagner et al.27 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Fähigkeit des Mikroskops, zwischen einzigartig organisierten molekularen Strukturen und isotroper Masse zu unterscheiden, wird mit der SDS@2 β-CD-Probe23,34 demonstriert (Abbildung 5). In dieser Studie wurde die Probe durch Zugabe von β-CD und SDS zu deionisiertem Wasser (DI) im Verhältnis 2:1 hergestellt, bis die beiden gelösten Stoffe eine Konzentration von 10 % m/m erreichten. Die Suspension wurde dann auf Klarheit erhitzt und über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt. CuCl2 wurde in einer Konzentration von 1:10 CuCl2:SDS zugegeben, um die elektrostatischen Wechselwirkungen abzustimmen, und das Gemischwurde 3-5 Tage lang ruhen gelassen, damit sich SDS@2 β-CD-Mesoblätter vollständig gebildet hatten. Schließlich wurden isolierte Mesobleche hergestellt, indem 5 μl der Blechsuspension auf ein Deckglas von 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm gegossen wurden, das auf einem Spin Coater mit 10.000 U/min befestigt war.
Die mesoskaligen Bleche bildeten sich aus ihrer Selbstorganisation mit einer spezifischenC7-Symmetrie . Unklar ist jedoch die molekulare Ausrichtung der einzelnen molekularen Einheit in dieser Selbstorganisation, ein grundlegendes Wissen, das die Materialfunktionen beeinflussen kann. (Abbildung 5C). VSFG-Bilder der selbstorganisierten Blätter, die auf einem Deckglas verteilt waren, wurden aufgenommen (Abbildung 6A). Durch die spektrale Identifizierung (Schritt 4 Hyperspektrale Datenanalyse) mit der hyperspektralen Bildgebungsfunktion von Matlab wurde festgestellt, dass alle Blätter in zwei Typen eingeteilt werden können, einer mit höherer VSFG-Intensität (blaue Spektren in Abbildung 6B und blau markierte Blätter in Abbildung 6A) und der andere mit geringerer Intensität. Bei der Inspektion und dem Vergleich mit dem optischen Bild (Abbildung 6C,D) schien das große Blatt in der Mitte der Bilder Doppelblätter gestapelt zu haben, wodurch die geringere VSFG-Intensität aufgrund der destruktiven Interferenz zwischen den beiden unterschiedlichen Orientierungsblättern zugeschrieben wurde. Das einzelne Blatt wurde fokussiert, um die Orientierung einzelner molekularer Einheiten zu extrahieren (blaue in Abbildung 6A). Zwei der Blätter (in Abbildung 6A mit roten und blauen Quadraten hervorgehoben) wurden mit verschiedenen VSFG-Polarisationen gemessen, und die Spektren wurden mit den Voigt-Funktionen angepasst. Beachten Sie, dass die VSFG-Polarisation im Ordnungssignal, in der Aufwärtswandlung und im MIR beschrieben wird. SSP bedeutet z. B. P-Polarisation von IR, S-Polarisation von Aufwärtskonversion und S-Polarisation von Signalen.
Abbildung 6: Polarisationsaufgelöste VSFG-Bildüberlagerung mit Hellfeld-Modalität. (A) Polarisationsaufgelöstes (SSS) hyperspektrales VSFG-Bild von SDS@2 β-CD. Violette und rosa Farben stellen Bereiche dar, in denen sich verschiedene Spektren befinden, und die entsprechenden Spektren sind in (B) aufgetragen, die repräsentative Spektren für einzelne Pixel mit einem Signal-Rausch-Verhältnis für blaue und magentafarbene Spektren ~56 bzw. ~26 sind. Die Blätter in den roten und blauen Kästchen werden im Folgenden explizit analysiert, um die Neigungswinkel des Supramoleküls zu extrahieren. (C) Hellfeldbild des gleichen Bereichs wie in (A). (D) Hyperspektrales VSFG-Bild, das mit einem optischen Bild eines identischen Bereichs überlagert ist. (E) Von links nach rechts: PPS-, PPP-, SSP- und SSS-polarisationsaufgelöste Spektren, summiert über 180 und 480 Pixel innerhalb der beiden Einzelblätter, die in roten und blauen Kästchen in (A) hervorgehoben sind. Alle Spektren wiesen ein dominantes Merkmal auf, das bei etwa 2910 cm-1 zentriert war, und ein Signal-Rausch-Verhältnis in der Größenordnung von 1000. Die Spektren wurden mit mehreren Voigt-Funktionen ausgestattet, die durch die schattierten Bereiche dargestellt wurden, und für die weitere Orientierungsanalyse verwendet. Diese Zahl wurde von Wagner et al.27 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um dann die molekularen Orientierungen zu extrahieren, wurde zunächst die symmetrieerlaubte Hyperpolarisierbarkeit 
bestimmt, die durch die Symmetrieauswahlregel unter Verwendung des zuvor veröffentlichten Verfahrens43 zugelassen wurde. Dann wird die Beziehung zwischen dem Laborrahmen und dem molekularen Rahmen aus der Euler-Rotation27 abgeleitet. Der Neigungswinkel θ wird dann mit der oben beschriebenen Methode des neuronalen Netzes extrahiert, und es wurde festgestellt, dass der Neigungswinkel ~23° beträgt (Abbildung 6).
Schließlich wird die Fähigkeit der multimodalen Bildgebung in dieser Plattform37gezeigt (7). Hier werden drei verschiedene Proben, nämlich SDS@2 β-CD, Kollagen und L-Phenylalanyl-L-Phenylalanin (FF), mit dem Mikroskop mit Hellfeld-, SHG- und VSFG-Bildgebungsmodalitäten untersucht. Zunächst einmal zeigten alle Proben ähnliche Morphologien über verschiedene Bildgebungsmodalitäten hinweg. Sowohl SHG als auch VSFG zeigten räumliche Intensitätsschwankungen, die in optischen Bildern fehlen. Da sowohl SHG als auch VSFG geordnete nicht-zentrosymmetrische Strukturen erfordern, könnte die Variation der Signalintensität auf Variationen der lokalen molekularen Ordnung oder der molekularen Orientierungen zurückzuführen sein. Im Gegensatz zu SHG kann man den MIR-Strahl von VSFG so einstellen, dass er mit verschiedenen Schwingungsmoden in Resonanz ist. In dem hier gezeigten Fall wurden CHx Schwingungsmoden bei 3,5 μm und Amid-I Mode bei 6 μm untersucht. Für FF wurden VSFG-Bilder mit starken und gleichmäßigen Signalen erhalten, was auf eine wohlgeordnete, selbstorganisierte Struktur für alle Schwingungsgruppen hindeutet - was mit ihrer kristallinen Natur übereinstimmt. Im Gegensatz dazu zeigte die Kollagenprobe ein stärkeres VSFG-Signal in derCHX-Region gegenüber der Amid-Region , was darauf hindeutet, dass die Proben flexibel sind und ihre Schwingungsgruppen unterschiedliche Ordnungsgrade aufweisen.
Abbildung 7: Multimodale Bilder von drei verschiedenen Proben. (Eini-A iii) SDS@2 β-CD-Hellfeld-, SHG- (PP-Polarisation) bzw. VSFG-(PPP-Polarisation) von 3,5-μm-Bereichsbildern. Nichtlineare Bilder werden mit Hellfeldbildern überlagert. Die chemischen Strukturen von SDS und 2β-CD sind im Einschub einesi dargestellt. (B i-B iv) Gefriergetrocknetes Kollagen Hellfeld, SHG (PP-Polarisation), VSFG (PPP-Polarisation) von 3,5 μm bzw. 6 μm-Regionen. Die chemische Struktur des primären Proteintrimerrests von Kollagen, bestehend aus Glycin, Prolin und Hydroxyprolin, ist im Einschub von Bi dargestellt. (C i-Civ) FF-Hellfeld, SHG (PP-Polarisation) und VSFG (PPP-Polarisation) von 3,5 μm bzw. 6 μm-Bereichen. Die chemische Struktur der FF-Moleküluntereinheiten ist im Einschub von ci dargestellt. Alle 6-μm-Bilder werden unter einer gespülten Stickstoffgeräteumgebung aufgenommen, um die Dämpfung der Umgebungsluftfeuchte zu entfernen. SDS@2 β-CD hat kein VSFG-Bild bei 6 μm, da es keine Amid-Gruppen hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsdatei 1: Matlab-Code für hyperspektrale Datenanalyse Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die kritischsten Schritte sind von 1,42 bis 1,44. Es ist wichtig, die Objektivlinse gut auszurichten, um eine optische räumliche Auflösung zu erzielen. Es ist auch wichtig, das emittierte Signal zu sammeln, weiterzuleiten und den Abtaststrahl als Linie an den Eingangsschlitzen zu projizieren. Die richtige Ausrichtung würde die beste Auflösung und das beste Signal-Rausch-Verhältnis garantieren. Für eine typische Probe, wie z. B. SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm Blätter, würde ein Bild mit guter Auflösung (~1 μm Auflösung) mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis 20 Minuten dauern. Dies ist bereits schneller als die vorherige Version des Instruments24,26. Eine weitere Verbesserung der Datenerfassungsgeschwindigkeit kann durch einen Laser mit höherer Wiederholrate realisiert werden.
Die derzeitige Einschränkung ist die räumliche Auflösung, die mit noch höheren NA-Objektivoptiken und potenziellen nichtlinearen optischen Super-Resolution-Techniken weiter verbessert werden könnte45. Die Heterodyn-Detektion wurde in der VSFG-Spektroskopie angewendet, um ihre Phase aufzulösen und die molekularen Orientierungen 5,46,47,48 zu extrahieren. Das ist in unserem Experiment technisch machbar. Die VSFG-Bildgebung beruht jedoch natürlich auf der Signalstreuung an der Probe, wodurch ihre Phase verfälscht und dadurch die Beziehungen zwischen der molekularen Orientierung und der Phase des VSFG-Signals verkompliziert werden.
Die Abbildung der Morphologie von Materialien mit chemischer Spezifität ist eine Herausforderung, da vielen bildgebenden Verfahren die molekulare Empfindlichkeit fehlt. Die schnelle hyperspektrale VSFG-Mikroskopie füllt diese Lücke, indem sie molekulare Schwingungssignaturen untersucht und molekulare Ausrichtungen mesoskaliger organisierter Materie aufdeckt, die in den Materialwissenschaften, der Chemie und der Biologie wichtig sind. In Zukunft wird die reflektierende Natur der Beleuchtungsoptik es ermöglichen, andere Techniken in das Kerninstrument zu integrieren, was seine Fähigkeiten weiter erhöht und multimodale Bilder von chemischen, biologischen und materiellen Proben ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Entwicklung des Instruments wird durch den Zuschuss NSF CHE-1828666 unterstützt. ZW, JCW und WX werden von den National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01, unterstützt. BY wird von der Youth Innovation Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (CAS, 2021183) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
| 25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
| 3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
| 30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
| 500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
| 60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
| 60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
| Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
| Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
| CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
| Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
| Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
| Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
| Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
| Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
| Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
| Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
| M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
| M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
| Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
| Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
| Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
| Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
| Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
| RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
| RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
| Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
| Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
| Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
| SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
| Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
| Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
| Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB - N-BK7 | SFG signal collection |
| Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
| Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
| WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
| WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
| X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
| XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
| X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
| XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
| Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
| β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |
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