Imagerie chimique hyperspectrale non linéaire multimodale à l’aide de la microscopie à génération de somme et de fréquence vibrationnelle à balayage linéaire

Summary

Un cadre d’imagerie hyperspectrale multimodale rapide a été développé pour obtenir des images de génération de somme de fréquence vibratoire (VSFG) à large bande, ainsi que des modalités d’imagerie de génération de deuxième harmonique (SHG) en fond clair. En raison de la fréquence infrarouge en résonance avec les vibrations moléculaires, des connaissances microscopiques structurelles et morphologiques mésoscopiques sont révélées à partir d’échantillons autorisés par symétrie.

Abstract

La génération de somme de fréquence vibrationnelle (VSFG), un signal optique non linéaire de second ordre, est traditionnellement utilisée pour étudier les molécules aux interfaces en tant que technique de spectroscopie avec une résolution spatiale de ~100 μm. Cependant, la spectroscopie n’est pas sensible à l’hétérogénéité d’un échantillon. Pour étudier des échantillons mésoscopiquement hétérogènes, nous avons, avec d’autres, repoussé la limite de résolution de la spectroscopie VSFG jusqu’à ~1 μm et construit le microscope VSFG. Cette technique d’imagerie permet non seulement de résoudre les morphologies d’échantillons par imagerie, mais aussi d’enregistrer un spectre VSFG à large bande à chaque pixel des images. Comme il s’agit d’une technique optique non linéaire de second ordre, sa règle de sélection permet de visualiser des structures auto-assemblées non centrosymétriques ou chirales que l’on trouve couramment en biologie, en science des matériaux et en bio-ingénierie, entre autres. Dans cet article, le public sera guidé à travers une conception de transmission inversée qui permet d’imager des échantillons non fixés. Ce travail montre également que la microscopie VSFG peut résoudre des informations géométriques spécifiques à des produits chimiques de feuilles individuelles auto-assemblées en les combinant avec un solveur de fonction de réseau neuronal. Enfin, les images obtenues sous fond clair, SHG et VSFG de divers échantillons discutent brièvement des informations uniques révélées par l’imagerie VSFG.

Introduction

La génération de somme de fréquence vibrationnelle (VSFG), une technique optique non linéaire de second ordre^1,2, a été largement utilisée comme outil de spectroscopie pour profiler chimiquement des échantillons de symétrie autorisés 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13^, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Traditionnellement, le VSFG a été appliqué aux systèmes interfaciaux 8,9,10,11 (c’est-à-dire gaz-liquide, liquide-liquide, gaz-solide^, solide-liquide), qui n’ont pas de symétrie d’inversion – une exigence pour l’activité VSFG. Cette application de VSFG a fourni une multitude de détails moléculaires sur les interfaces enfouies 12,13, les configurations des molécules d’eau aux interfaces 14,15,16,17,18 et les espèces chimiques aux interfaces 19,20,21,22.

Bien que le VSFG ait été puissant dans la détermination des espèces moléculaires et des configurations aux interfaces, son potentiel dans la mesure des structures moléculaires de matériaux dépourvus de centres d’inversion n’a pas été exploité. Cela s’explique en partie par le fait que les matériaux peuvent être hétérogènes dans leur environnement chimique, leur composition et leur disposition géométrique, et qu’un spectromètre VSFG traditionnel a une grande zone d’éclairage de l’ordre de 100 μm². Ainsi, la spectroscopie VSFG traditionnelle rapporte des informations moyennées par ensemble de l’échantillon sur une zone d’éclairage typique de 100 μm². Cette moyenne d’ensemble peut conduire à des annulations de signaux entre des domaines bien ordonnés avec des orientations opposées et à une mauvaise caractérisation des hétérogénéités locales 15,20,23,24.

Grâce aux progrès réalisés dans le domaine des objectifs de microscope à haute ouverture numérique (NA) et à réflexion (géométries Schwarzschild et Cassegrain), qui sont presque exempts d’aberrations chromatiques, la taille de la mise au point des deux faisceaux dans les expériences VSFG peut être réduite de 100 μm 2 à 1-2 μm² et, dans certains cas, submicronique²⁵. En tenant compte de cette avancée technologique, notre groupe et d’autres ont développé VSFG en une plate-forme de microscopie 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Récemment, nous avons mis en place une disposition optique inversée et un schéma de détection à large bande³⁷, qui permet une collecte transparente d’images multimodales (VSFG, génération de deuxième harmonique (SHG) et optique à fond clair). L’imagerie multimodale permet d’inspecter rapidement les échantillons à l’aide de l’imagerie optique, de corréler différents types d’images et de localiser les positions des signaux sur les images d’échantillons. Grâce à l’optique d’éclairage achromatique et au choix de la source d’éclairage laser pulsé, cette plate-forme optique permet l’intégration transparente de techniques supplémentaires telles que la microscopie à fluorescence³⁸ et la microscopie Raman, entre autres.

Dans ce nouvel arrangement, des échantillons tels que des organisations hiérarchiques et une classe d’auto-assemblages moléculaires (MSA) ont été étudiés. Ces matériaux comprennent le collagène et le biomimétique, où la composition chimique et l’organisation géométrique sont importantes pour la fonction ultime du matériau. Parce que le VSFG est un signal optique non linéaire de second ordre, il est particulièrement sensible aux arrangements intermoléculaires^39,40, tels que la distance intermoléculaire ou les angles de torsion^, ce qui en fait un outil idéal pour révéler à la fois les compositions chimiques et les arrangements moléculaires. Ce travail décrit les modalités VSFG, SHG et fond clair de l’instrument de base constitué d’un laser à semi-conducteurs à cavité dopé à l’ytterbium qui pompe un amplificateur paramétrique optique (OPA), d’un microscope inversé multimodal et d’un analyseur de fréquence monochromateur de fabrication artisanale couplé à un détecteur à dispositif à couplage chargé (CCD)^{bidimensionnel 27}. Des procédures de construction et d’alignement étape par étape, ainsi qu’une liste complète des pièces de l’installation, sont fournies. Une analyse approfondie d’un MSA, dont la sous-unité moléculaire fondamentale est composée d’une molécule de sulfate de sodium-dodécyle (SDS), un tensioactif commun, et de deux molécules de β-cyclodextrine (β-CD), connue sous le nom de SDS@2 β-CD ici, est également fournie à titre d’exemple pour montrer comment le VSFG peut révéler des détails géométriques spécifiques à la molécule de la matière organisée. Il a également été démontré que les détails géométriques spécifiques à la chimie de la MSA peuvent être déterminés avec une approche de solveur de fonction de réseau neuronal.

Protocol

1. Microscope VSFG hyperspectral à balayage linéaire Système laserUtiliser un système laser pulsé (voir tableau des matériaux) centré à 1025 nm ± 5 nm. Le laser est réglé à 40 W, 200 kHz (200 μJ/impulsion) avec une largeur d’impulsion de ~290 fs.REMARQUE : Le taux de répétition exact peut varier, et un laser à taux de répétition élevé fonctionne généralement mieux pour ce microscope VSFG. Guidez la sortie du laser d’amorçage dans un amplificate…

Representative Results

Figure 5 : Structure moléculaire, morphologie et orientation potentielle du SDS@β-CD. (A) Vue de dessus et (B) Vue de côté Structure chimique du SDS@β-CD. (C) Distribution hétérogène représentative de l’échantillon des feuilles de méso-échelle sur le plan de l’échantillonnage. La so…

Discussion

Les étapes les plus critiques vont de 1,42 à 1,44. Il est essentiel de bien aligner l’objectif pour obtenir une résolution spatiale optique. Il est également important de collecter le signal émis, de le relayer et de projeter le faisceau de balayage sous forme de ligne au niveau des fentes d’entrée. Des alignements appropriés garantiraient la meilleure résolution et le meilleur rapport signal/bruit. Pour un échantillon typique, comme SDS@2 β-CD 100 μm par 100 μm de feuilles, une image de bonne résolution…

Materials

1x Camera Por	Thorlabs	WFA4100	connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold	Thorlabs	MRA25-M01	reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack	Thorlabs	UPH3-P5	hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick	Thorlabs	LCP4S	convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm	Thorlabs	CEA1500	provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris	Thorlabs	LCP50S	control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket	Thorlabs	LCP01B	mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon	SLS Optics Ltd.	Customized	generate narrow-band 1030 nm light
Cage Plate Mounting Bracket	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD	Andor Technologies	Newton	2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier	Light Conversion	Orpheus-One-HP	Tunable MID light generator
Copper Chloride	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror	Newport	Customized	selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter	Thorlabs	SM1A34	provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective	Zeiss	420150-9900-000	Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective	Pike Technologies Inc.	891-0007	Reflective objective
Laser	Carbide, Light-Conversion	C18212	Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS	Thorlabs	M32RMSS	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving	Thorlabs	M32M27S	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
Manual Mid-Height Condenser Focus Module	Thorlabs	ZFM1030	adjust the focus of an optical element
Monochromator	Andor Technologies	Shamrock 500i	Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms	Thorlabs	ZFM2020	control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner	Mad City Labs Inc.	MMP3	3D sample stage
Resonant Scanner	EOPC	SC-25	325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera	Thorlabs	DCU224C	Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens	Thorlabs	ITL200	white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard	Thorlabs	OPX2400	incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm	Thorlabs	KCB1	hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage	Thorlabs	CSA2100	securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,	Thorlabs	C60L24	enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages	Thorlabs	MCM3001	control ZFM2020
Tube lens	Thorlabs	LA1380-AB – N-BK7	SFG signal collection
Visible LED Set	Thorlabs	WFA1010	provide illumination in imaging setup
Whitelight Source	Thorlabs	WFA1010	Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages	Optosigma	TSD-65122CUU	positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier	Thorlabs	XT95RC4	mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation	Thorlabs	XYR1	precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole	Thorlabs	XYT1	provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser	Light Conversion	CB3-40W	Seed laser
β-Cyclodextrin	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	Self-assembly component