ライン走査型振動和周波数発生顕微鏡を用いたマルチモーダル非線形ハイパースペクトルケミカルイメージング
Summary
広帯域振動和周波数発生(VSFG)画像と明視野第2高調波発生(SHG)イメージングモダリティを取得するために、マルチモーダルで高速ハイパースペクトルイメージングフレームワークが開発されました。赤外線周波数は分子振動と共鳴するため、対称性が許容されるサンプルの微視的構造およびメゾスコピックな形態学の知識が明らかになります。
Abstract
2次の非線形光信号である振動和周波数発生(VSFG)は、~100μmの空間分解能を持つ分光法として、界面の分子を研究するために伝統的に使用されてきました。ただし、分光法はサンプルの不均一性に敏感ではありません。メゾスコピック的に不均一なサンプルを研究するために、私たちは他の研究者とともに、VSFG分光法の分解能の限界を~1μmレベルまで下げ、VSFG顕微鏡を構築しました。このイメージング技術は、イメージングによってサンプルの形態を分解できるだけでなく、画像のすべてのピクセルで広帯域のVSFGスペクトルを記録することもできます。2次非線形光学技術であるため、その選択規則により、生物学、材料科学、生物工学などで一般的に見られる非中心対称またはキラルな自己組織化構造を可視化できます。本稿では、固定されていないサンプルのイメージングを可能にする倒立透過設計について説明します。また、この研究は、VSFG顕微鏡をニューラルネットワーク関数ソルバーと組み合わせることで、個々の自己組織化シートの化学的特異的な幾何学的情報を解像できることも示しています。最後に、さまざまなサンプルの明視野、SHG、およびVSFG構成で得られた画像は、VSFGイメージングによって明らかにされる固有の情報について簡単に説明します。
Introduction
2次非線形光学技術1,2である振動和周波数発生(VSFG)は、対称性で許容されるサンプル3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13を化学的にプロファイリングするための分光ツールとして広く使用されています。14、15、16、17、18、19、20、21、22。従来、VSFGは界面系8,9,10,11(気液、液液、気体-固体、固液)に適用されてきましたが、VSFG活性の要件である反転対称性を欠いています。VSFGのこの応用により、埋もれた界面12,13、界面14,15,16,17,18の水分子の配置、界面19,20,21,22の化学種の豊富な分子詳細が得られました。
VSFGは、界面の分子種や配置を決定するのに強力ですが、反転中心を欠く物質の分子構造を測定する可能性はまだ十分に発揮されていませんでした。これは、材料が化学的環境、組成、および幾何学的配置において不均一である可能性があり、従来のVSFG分光計は100μm2程度の広い照明面積を有することによるものです。したがって、従来のVSFG分光法は、典型的な100μm2の照明領域におけるサンプルのアンサンブル平均情報を報告します。このアンサンブル平均化は、反対の配向を持つ整然としたドメイン間のシグナルキャンセルと、局所的な不均一性の誤った特徴付けにつながる可能性があります15,20,23,24。
色収差がほとんどない高開口数(NA)、反射型顕微鏡対物レンズ(シュワルツシルトおよびカセグレン形状)の進歩により、VSFG実験における2つのビームの焦点サイズを100μm2から1〜2μm2に、場合によってはサブミクロン25に縮小することができます。この技術的進歩を含め、私たちのグループなどはVSFGを顕微鏡プラットフォームに開発しました20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36。最近、我々は、マルチモーダル画像(VSFG、第2高調波発生(SHG)、および明視野光学)のシームレスな収集を可能にする反転光学レイアウトおよび広帯域検出スキーム37を実装した。マルチモダリティイメージングにより、光学イメージング、さまざまなタイプの画像を相関させ、サンプル画像上の信号位置を特定することで、サンプルの迅速な検査が可能になります。アクロマティック照明光学系とパルスレーザー照明光源の選択により、この光学プラットフォームは、蛍光顕微鏡38やラマン顕微鏡などの追加技術を将来シームレスに統合することができます。
この新しい配置では、階層組織や分子自己組織化(MSA)のクラスなどのサンプルが研究されています。これらの材料には、コラーゲンとバイオミメティクスが含まれ、化学組成と幾何学的構造の両方が材料の最終的な機能にとって重要です。VSFGは2次の非線形光信号であるため、分子間距離やねじれ角などの分子間配列39,40に特に敏感であり、化学組成と分子配列の両方を明らかにするための理想的なツールとなる。この作業は、光パラメトリック増幅器(OPA)をポンピングするイッテルビウムドープ共振器固体レーザー、自作のマルチモーダル倒立顕微鏡および2次元荷電結合素子(CCD)検出器27に結合されたモノクロメーター周波数分析器からなるコア機器のVSFG、SHG、および明視野モダリティについて説明する。ステップバイステップの構造と位置合わせ手順、およびセットアップの完全な部品リストが提供されます。基本的な分子サブユニットが、一般的な界面活性剤である1分子のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と、2分子のβ-シクロデキストリン(β-CD)(本明細書ではSDS@2 β-CD)で構成されるMSAの詳細な分析も、VSFGが組織化物質の分子固有の幾何学的詳細を明らかにする方法を示す例として提供されています。また、MSAの化学的特異的な幾何学的詳細は、ニューラルネットワーク関数ソルバーアプローチで決定できることも実証されています。
Protocol
1. ハイパースペクトルライン走査型VSFG顕微鏡 レーザーシステム1025nm±5nmを中心とするパルスレーザーシステム( 材料表を参照)を使用します。レーザーは40W、200kHz(200μJ/パルス)、パルス幅は~290fsに設定されています。注:正確な繰り返し率は異なる場合があり、このVSFG顕微鏡では一般的に高繰り返し率のレーザーの方がうまく機能します。 シードレーザー?…
Representative Results
図5:SDS@β-CDの分子構造、形態、ポテンシャル配向 。 (A)SDS@β-CDの上面図と(B)側面図の化学構造。(C)試料面上のメソスケールシートの代表的な不均質な試料分布。分子サブユニットは、基質上で異なる配向とアライメントを持?…
Discussion
最も重要なステップは 1.42 から 1.44 です。光学空間分解能を得るためには、対物レンズの位置を合わせることが重要です。また、出射された信号を集めて中継し、入射スリットに走査ビームを線状に投影することも重要です。適切なアライメントにより、最高の分解能とS/N比が保証されます。SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm シートのような一般的なサンプルでは、高い S/N 比で高解像度の画像(~1 μm 分…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
装置の開発は、Grant NSF CHE-1828666によってサポートされています。ZW、JCW、WXは、米国国立衛生研究所、国立総合医学研究所、助成金1R35GM138092-01の支援を受けています。BYは、中国科学院青年イノベーション促進協会(CAS、2021183)の支援を受けています。
Materials
| 1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
| 25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
| 3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
| 30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
| 500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
| 60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
| 60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
| Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
| Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
| CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
| Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
| Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
| Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
| Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
| Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
| Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
| Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
| M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
| M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
| Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
| Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
| Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
| Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
| Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
| RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
| RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
| Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
| Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
| Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
| SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
| Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
| Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
| Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB – N-BK7 | SFG signal collection |
| Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
| Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
| WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
| WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
| X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
| XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
| X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
| XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
| Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
| β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |
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Cite This Article
Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z., Xiong, W. Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65388, doi:10.3791/65388 (2023).