Multimodal ikke-lineær hyperspektral kjemisk avbildning ved hjelp av linjeskanning Vibrasjonell sumfrekvensgenereringsmikroskopi

Summary

Et multimodalt, raskt hyperspektralt bilderammeverk ble utviklet for å oppnå bredbånds vibrasjonell sumfrekvensgenerering (VSFG) bilder, sammen med brightfield, andre harmoniske generasjons (SHG) bildebehandlingsmodaliteter. På grunn av at den infrarøde frekvensen resonerer med molekylære vibrasjoner, avsløres mikroskopisk strukturell og mesoskopisk morfologikunnskap om symmetritillatte prøver.

Abstract

Vibrasjonell sumfrekvensgenerering (VSFG), et andreordens ikke-lineært optisk signal, har tradisjonelt blitt brukt til å studere molekyler ved grensesnitt som en spektroskopiteknikk med en romlig oppløsning på ~ 100 μm. Spektroskopien er imidlertid ikke følsom for heterogeniteten til en prøve. For å studere mesoskopisk heterogene prøver, presset vi sammen med andre oppløsningsgrensen for VSFG-spektroskopi ned til ~ 1 μm nivå og konstruerte VSFG-mikroskopet. Denne bildebehandlingsteknikken kan ikke bare løse prøvemorfologier gjennom bildebehandling, men også registrere et bredbånds VSFG-spektrum på hver piksel av bildene. Å være en andreordens ikke-lineær optisk teknikk, muliggjør valgregelen visualisering av ikke-sentrosymmetriske eller kirale selvmonterte strukturer som ofte finnes i biologi, materialvitenskap og bioteknologi, blant andre. I denne artikkelen vil publikum bli guidet gjennom en invertert overføringsdesign som gjør det mulig å avbilde ufikserte prøver. Dette arbeidet viser også at VSFG-mikroskopi kan løse kjemisk-spesifikk geometrisk informasjon om individuelle selvmonterte ark ved å kombinere den med en nevral nettverksfunksjonsløser. Til slutt diskuterer bildene som er oppnådd under brightfield-, SHG- og VSFG-konfigurasjoner av forskjellige prøver, kort den unike informasjonen som ble avslørt av VSFG-bildebehandling.

Introduction

Vibrasjonell sumfrekvensgenerering (VSFG), en andreordens ikke-lineær optisk teknikk^1,2, har blitt brukt mye som et spektroskopiverktøy for å kjemisk profilere symmetritillatte prøver 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13^, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradisjonelt har VSFG blitt brukt på grenseflatesystemer 8,9,10,11 (dvs. gass-væske, væske-væske, gass-fast^, fast-væske), som mangler inversjonssymmetri – et krav for VSFG-aktivitet. Denne anvendelsen av VSFG har gitt et vell av molekylære detaljer av nedgravde grensesnitt 12,13, konfigurasjoner av vannmolekyler ved grensesnitt 14,15,16,17,18 og kjemiske arter ved grensesnitt 19,20,21,22.

Selv om VSFG har vært kraftig i å bestemme molekylære arter og konfigurasjoner ved grensesnitt, har potensialet i å måle molekylære strukturer av materialer som mangler inversjonssentre ikke blitt oppfylt. Dette skyldes blant annet at materialene kan være heterogene i sitt kjemiske miljø, sammensetninger og geometriske arrangement, og et tradisjonelt VSFG-spektrometer har et stort belysningsområde i størrelsesorden 100 μm². Dermed rapporterer tradisjonell VSFG-spektroskopi om ensemble-gjennomsnittlig informasjon om prøven over et typisk 100 μm² belysningsområde. Dette ensemblegjennomsnittet kan føre til signalkanselleringer mellom velordnede domener med motsatt orientering og feilkarakterisering av lokale heterogeniteter 15,20,23,24.

Med fremskritt i høy numerisk blenderåpning (NA), reflekterende mikroskopmål (Schwarzschild og Cassegrain geometrier), som er nesten fri for kromatiske avvik, kan fokusstørrelsen på de to bjelkene i VSFG-eksperimenter reduseres fra 100 μm 2 til 1-2 μm² og i noen tilfeller submikron²⁵. Inkludert denne teknologiske utviklingen har vår gruppe og andre utviklet VSFG til en mikroskopiplattform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Nylig har vi implementert et invertert optisk layout og bredbåndsdeteksjonsskjema³⁷, som muliggjør en sømløs samling av multimodale bilder (VSFG, andre harmoniske generasjon (SHG) og brightfield optisk). Multimodalitetsavbildningen tillater rask inspeksjon av prøver ved hjelp av optisk bildebehandling, korrelerer ulike typer bilder sammen og lokaliserer signalposisjoner på prøvebildene. Med den akromatiske belysningsoptikken og valget av pulserende laserbelysningskilde, muliggjør denne optiske plattformen fremtidig sømløs integrering av tilleggsteknikker som fluorescensmikroskopi³⁸ og Raman-mikroskopi, blant andre.

I dette nye arrangementet har prøver som hierarkiske organisasjoner og en klasse av molekylære selvsamlinger (MSA) blitt studert. Disse materialene inkluderer kollagen og biomimetikk, hvor både kjemisk sammensetning og geometrisk organisering er viktig for materialets endelige funksjon. Fordi VSFG er et andreordens ikke-lineært optisk signal, er det spesielt følsomt for intermolekylære arrangementer^39,40, for eksempel intermolekylære avstands- eller vridningsvinkler^, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å avsløre både kjemiske sammensetninger og molekylære arrangementer. Dette arbeidet beskriver VSFG-, SHG- og brightfield-modalitetene til kjerneinstrumentet som består av en ytterbium-dopet hulrom solid-state laser som pumper en optisk parametrisk forsterker (OPA), et hjemmebygd multimodalt invertert mikroskop og monokromatatorfrekvensanalysator koblet til en todimensjonal ladet koblet enhet (CCD) detektor²⁷. En trinnvis konstruksjons- og justeringsprosedyrer, og en komplett deleliste over oppsettet, er gitt. En grundig analyse av en MSA, hvis grunnleggende molekylære underenhet består av ett molekyl natrium-dodecylsulfat (SDS), et vanlig overflateaktivt middel og to molekyler β-cyklodekstrin (β-CD), kjent som SDS@2 β-CD heri, er også gitt som et eksempel for å vise hvordan VSFG kan avsløre molekylspesifikke geometriske detaljer av organisert materie. Det har også blitt demonstrert at kjemisk-spesifikke geometriske detaljer av MSA kan bestemmes med en nevrale nettverksfunksjonsløser-tilnærming.

Protocol

1. Hyperspektral linjeskanning VSFG-mikroskop Laser-systemBruk et pulserende lasersystem (se materialfortegnelse) sentrert ved 1025 nm ± 5 nm. Laseren er satt til 40 W, 200 kHz (200 μJ/puls) med en pulsbredde på ~290 fs.MERK: Den nøyaktige repetisjonsfrekvensen kan variere, og en laser med høy repetisjonsfrekvens fungerer generelt bedre for dette VSFG-mikroskopet. Før utgangen av frølaseren inn i en kommersiell optisk parametrisk forsterker (OPA) for å generere en…

Representative Results

Figur 5: Molekylær struktur, morfologi og potensiell orientering av SDS@β-CD. (A) Top-view og (B) side-view kjemisk struktur av SDS@β-CD. (C) Representativ heterogen prøvefordeling av mesoskalaarkene på prøveplanet. Den molekylære subenheten kan ha forskjellige orienteringer og justering på …

Discussion

De mest kritiske trinnene er fra 1,42 til 1,44. Det er viktig å justere objektivlinsen godt for en optisk romlig oppløsning. Det er også viktig å samle det utsendte signalet, reléet og projisere skannestrålen som en linje ved inngangsspaltene. Riktig justering vil garantere den beste oppløsningen og signal-støy-forholdet. For en typisk prøve, som SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm ark, vil et bilde med god oppløsning (~1 μm oppløsning) med høyt signal-støy-forhold ta 20 minutter. Dette er allerede raskere enn de…

Materials

1x Camera Por	Thorlabs	WFA4100	connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold	Thorlabs	MRA25-M01	reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack	Thorlabs	UPH3-P5	hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick	Thorlabs	LCP4S	convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm	Thorlabs	CEA1500	provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris	Thorlabs	LCP50S	control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket	Thorlabs	LCP01B	mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon	SLS Optics Ltd.	Customized	generate narrow-band 1030 nm light
Cage Plate Mounting Bracket	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD	Andor Technologies	Newton	2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier	Light Conversion	Orpheus-One-HP	Tunable MID light generator
Copper Chloride	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror	Newport	Customized	selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter	Thorlabs	SM1A34	provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective	Zeiss	420150-9900-000	Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective	Pike Technologies Inc.	891-0007	Reflective objective
Laser	Carbide, Light-Conversion	C18212	Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS	Thorlabs	M32RMSS	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving	Thorlabs	M32M27S	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
Manual Mid-Height Condenser Focus Module	Thorlabs	ZFM1030	adjust the focus of an optical element
Monochromator	Andor Technologies	Shamrock 500i	Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms	Thorlabs	ZFM2020	control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner	Mad City Labs Inc.	MMP3	3D sample stage
Resonant Scanner	EOPC	SC-25	325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera	Thorlabs	DCU224C	Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens	Thorlabs	ITL200	white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard	Thorlabs	OPX2400	incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm	Thorlabs	KCB1	hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage	Thorlabs	CSA2100	securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,	Thorlabs	C60L24	enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages	Thorlabs	MCM3001	control ZFM2020
Tube lens	Thorlabs	LA1380-AB – N-BK7	SFG signal collection
Visible LED Set	Thorlabs	WFA1010	provide illumination in imaging setup
Whitelight Source	Thorlabs	WFA1010	Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages	Optosigma	TSD-65122CUU	positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier	Thorlabs	XT95RC4	mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation	Thorlabs	XYR1	precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole	Thorlabs	XYT1	provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser	Light Conversion	CB3-40W	Seed laser
β-Cyclodextrin	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	Self-assembly component