Imagem Química Hiperespectral Não Linear Multimodal Usando Microscopia de Geração de Soma e Frequência Vibracional de Varredura de Linha

Summary

Uma estrutura de imagem hiperespectral rápida e multimodal foi desenvolvida para obter imagens de geração de soma e frequência vibracional de banda larga (VSFG), juntamente com modalidades de imagem de segunda geração harmônica (SHG) de campo claro. Devido à frequência do infravermelho ser ressonante com vibrações moleculares, o conhecimento microscópico estrutural e morfológico mesoscópico é revelado de amostras permitidas por simetria.

Abstract

A geração de soma de frequência vibracional (VSFG), um sinal óptico não-linear de segunda ordem, tem sido tradicionalmente usada para estudar moléculas em interfaces como uma técnica de espectroscopia com uma resolução espacial de ~100 μm. No entanto, a espectroscopia não é sensível à heterogeneidade de uma amostra. Para estudar amostras mesoscopicamente heterogêneas, nós, juntamente com outros, empurramos o limite de resolução da espectroscopia VSFG para o nível de ~1 μm e construímos o microscópio VSFG. Esta técnica de imagem não só pode resolver morfologias de amostras através de imagens, mas também gravar um espectro VSFG de banda larga em cada pixel das imagens. Por ser uma técnica óptica não linear de segunda ordem, sua regra de seleção permite a visualização de estruturas automontadas não centrossimétricas ou quirais comumente encontradas em biologia, ciência dos materiais, bioengenharia, entre outras. Neste artigo, o público será guiado por um projeto de transmissão invertida que permite a obtenção de imagens de amostras não fixas. Este trabalho também mostra que a microscopia VSFG pode resolver informações geométricas químico-específicas de folhas auto-montadas individuais combinando-as com um solver de função de rede neural. Por fim, as imagens obtidas sob configurações de campo brilhante, SHG e VSFG de várias amostras discutem brevemente as informações únicas reveladas pelas imagens VSFG.

Introduction

A geração de soma de frequência vibracional (VSFG), uma técnica óptica não linear de segunda ordem^1,2, tem sido usada extensivamente como uma ferramenta de espectroscopia para perfilar quimicamente amostras permitidas por simetria 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13^, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradicionalmente, os VSFG têm sido aplicados a sistemas interfaciais 8,9,10,11 (isto é, gás-líquido, líquido-líquido, gás-sólido^, sólido-líquido), que não possuem simetria de inversão – um requisito para a atividade do VSFG. Esta aplicação do VSFG tem fornecido uma riqueza de detalhes moleculares de interfaces enterradas 12,13, configurações de moléculas de água em interfaces 14,15,16,17,18 e espécies químicas em interfaces 19,20,21,22.

Embora o VSFG tenha sido poderoso na determinação de espécies moleculares e configurações em interfaces, seu potencial na medição de estruturas moleculares de materiais sem centros de inversão não foi realizado. Isso ocorre em parte porque os materiais podem ser heterogêneos em seu ambiente químico, composições e arranjo geométrico, e um espectrômetro VSFG tradicional tem uma grande área de iluminação da ordem de 100 μm². Assim, a espectroscopia VSFG tradicional relata informações médias da amostra sobre uma área de iluminação típica de 100 μm². Essa média de conjunto pode levar a cancelamentos de sinal entre domínios bem ordenados com orientações opostas e descaracterização de heterogeneidades locais 15,20,23,24.

Com os avanços em alta abertura numérica (NA), objetivas de microscópio baseadas em reflexo (geometrias de Schwarzschild e Cassegrain), que são quase livres de aberrações cromáticas, o tamanho do foco dos dois feixes em experimentos VSFG pode ser reduzido de 100 μm 2 para 1-2 μm² e, em alguns casos, submícron²⁵. Incluindo esse avanço tecnológico, nosso grupo e outros desenvolveram o VSFG em uma plataforma de microscopia 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recentemente, implementamos um layout óptico invertido e um esquema de detecção de banda larga³⁷, que permite uma coleção perfeita de imagens multimodais (VSFG, segunda geração harmônica (SHG) e óptica de campo brilhante). A imagem multimodalidade permite a inspeção rápida de amostras usando imagens ópticas, correlacionando vários tipos de imagens e localizando as posições do sinal nas imagens da amostra. Com a óptica de iluminação acromática e a escolha da fonte de iluminação a laser pulsada, esta plataforma óptica permite a integração perfeita futura de técnicas adicionais, como microscopia de fluorescência³⁸ e microscopia Raman, entre outras.

Nesse novo arranjo, amostras como organizações hierárquicas e uma classe de automontagens moleculares (AMEs) têm sido estudadas. Esses materiais incluem colágeno e biomiméticos, onde tanto a composição química quanto a organização geométrica são importantes para a função final do material. Por ser um sinal óptico não-linear de segunda ordem, o VSFG é especificamente sensível a arranjos intermoleculares^39,40, como distância intermolecular ou ângulos de torção^, tornando-se uma ferramenta ideal para revelar tanto composições químicas quanto arranjos moleculares. Este trabalho descreve as modalidades VSFG, SHG e campo claro do instrumento central que consiste em um laser de estado sólido de cavidade dopada com itérbio que bombeia um amplificador paramétrico óptico (OPA), um microscópio invertido multimodal construído em casa e analisador de frequência monocromador acoplado a um detector bidimensional charged coupled device (CCD)²⁷. Um passo a passo de construção e procedimentos de alinhamento, e uma lista completa de peças da configuração, são fornecidos. Uma análise aprofundada de uma MSA, cuja subunidade molecular fundamental é composta por uma molécula de sulfato de sódio-dodecil (SDS), um surfactante comum, e duas moléculas de β-ciclodextrina (β-CD), conhecidas como SDS@2 β-CD aqui, também são fornecidas como um exemplo para mostrar como o VSFG pode revelar detalhes geométricos específicos de moléculas de matéria organizada. Também foi demonstrado que detalhes geométricos químicos específicos da MSA podem ser determinados com uma abordagem de solucionador de funções de redes neurais.

Protocol

1. Microscópio VSFG de varredura de linha hiperespectral Sistema laserUse um sistema de laser pulsado (ver Tabela de Materiais) centrado em 1025 nm ± 5 nm. O laser é regulado em 40 W, 200 kHz (200 μJ/pulso) com uma largura de pulso de ~290 fs.NOTA: A taxa de repetição exata pode variar, e um laser de alta taxa de repetição geralmente funciona melhor para este microscópio VSFG. Guie a saída do laser de semente em um amplificador paramétrico óptico comercial (OP…

Representative Results

Figura 5: Estrutura molecular, morfologia e orientação potencial do SDS@β-CD. (A) Vista superior e (B) Estrutura química lateral do SDS@β-CD. (C) Distribuição representativa e heterogênea das folhas de mesoescala no plano amostral. A subunidade molecular poderia ter diferentes orientações …

Discussion

As etapas mais críticas são de 1,42 a 1,44. É fundamental alinhar bem a lente objetiva para uma resolução espacial óptica. Também é importante coletar o sinal emitido, relé e projetar o feixe de varredura como uma linha nas fendas de entrada. Alinhamentos adequados garantiriam a melhor resolução e relação sinal-ruído. Para uma amostra típica, como folhas de SDS@2 β-CD de 100 μm por 100 μm, uma imagem de boa resolução (~1 μm de resolução) com uma alta relação sinal-ruído levaria 20 minutos. Isso …

Materials

1x Camera Por	Thorlabs	WFA4100	connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold	Thorlabs	MRA25-M01	reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack	Thorlabs	UPH3-P5	hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick	Thorlabs	LCP4S	convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm	Thorlabs	CEA1500	provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris	Thorlabs	LCP50S	control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket	Thorlabs	LCP01B	mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon	SLS Optics Ltd.	Customized	generate narrow-band 1030 nm light
Cage Plate Mounting Bracket	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD	Andor Technologies	Newton	2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier	Light Conversion	Orpheus-One-HP	Tunable MID light generator
Copper Chloride	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror	Newport	Customized	selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter	Thorlabs	SM1A34	provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective	Zeiss	420150-9900-000	Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective	Pike Technologies Inc.	891-0007	Reflective objective
Laser	Carbide, Light-Conversion	C18212	Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS	Thorlabs	M32RMSS	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving	Thorlabs	M32M27S	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
Manual Mid-Height Condenser Focus Module	Thorlabs	ZFM1030	adjust the focus of an optical element
Monochromator	Andor Technologies	Shamrock 500i	Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms	Thorlabs	ZFM2020	control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner	Mad City Labs Inc.	MMP3	3D sample stage
Resonant Scanner	EOPC	SC-25	325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera	Thorlabs	DCU224C	Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens	Thorlabs	ITL200	white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard	Thorlabs	OPX2400	incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm	Thorlabs	KCB1	hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage	Thorlabs	CSA2100	securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,	Thorlabs	C60L24	enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages	Thorlabs	MCM3001	control ZFM2020
Tube lens	Thorlabs	LA1380-AB – N-BK7	SFG signal collection
Visible LED Set	Thorlabs	WFA1010	provide illumination in imaging setup
Whitelight Source	Thorlabs	WFA1010	Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages	Optosigma	TSD-65122CUU	positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier	Thorlabs	XT95RC4	mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation	Thorlabs	XYR1	precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole	Thorlabs	XYT1	provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser	Light Conversion	CB3-40W	Seed laser
β-Cyclodextrin	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	Self-assembly component