Imágenes químicas hiperespectrales no lineales multimodales mediante microscopía de generación de suma de frecuencia vibracional de barrido lineal

Summary

Se desarrolló un marco de imágenes hiperespectrales rápidas y multimodales para obtener imágenes de generación de suma de frecuencia vibracional (VSFG) de banda ancha, junto con modalidades de imágenes de generación de segundos armónicos (SHG) de campo claro. Debido a que la frecuencia infrarroja es resonante con las vibraciones moleculares, se revela el conocimiento microscópico estructural y de la morfología mesoscópica de las muestras permitidas por simetría.

Abstract

La generación vibracional de suma de frecuencia (VSFG), una señal óptica no lineal de segundo orden, se ha utilizado tradicionalmente para estudiar moléculas en interfaces como una técnica de espectroscopia con una resolución espacial de ~100 μm. Sin embargo, la espectroscopia no es sensible a la heterogeneidad de una muestra. Para estudiar muestras mesoscópicamente heterogéneas, nosotros, junto con otros, empujamos el límite de resolución de la espectroscopia VSFG hasta un nivel de ~1 μm y construimos el microscopio VSFG. Esta técnica de imagen no solo puede resolver las morfologías de las muestras a través de imágenes, sino que también registra un espectro VSFG de banda ancha en cada píxel de las imágenes. Al ser una técnica óptica no lineal de segundo orden, su regla de selección permite la visualización de estructuras autoensambladas no centrosimétricas o quirales que se encuentran comúnmente en biología, ciencia de materiales y bioingeniería, entre otras. En este artículo, se guiará a la audiencia a través de un diseño de transmisión invertida que permite obtener imágenes de muestras no fijadas. Este trabajo también muestra que la microscopía VSFG puede resolver información geométrica química específica de láminas autoensambladas individuales combinándola con un solucionador de funciones de red neuronal. Por último, las imágenes obtenidas bajo configuraciones de campo claro, SHG y VSFG de varias muestras discuten brevemente la información única revelada por las imágenes VSFG.

Introduction

La generación vibracional de suma de frecuencia (VSFG), una técnica óptica no lineal de segundo orden^1,2, se ha utilizado ampliamente como herramienta de espectroscopia para perfilar químicamente muestras con simetría permitida 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13^, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradicionalmente, VSFG se ha aplicado a los sistemas interfaciales 8,9,10,11 (es decir, gas-líquido, líquido-líquido, gas-sólido, sólido-líquido), que carecen de simetría de inversión^, un requisito para la actividad de VSFG. Esta aplicación de VSFG ha proporcionado una gran cantidad de detalles moleculares de las interfaces enterradas 12,13, las configuraciones de las moléculas de agua en las interfaces 14,15,16,17,18 y las especies químicas en las interfaces 19,20,21,22.

Aunque VSFG ha sido poderoso en la determinación de especies moleculares y configuraciones en interfaces, su potencial en la medición de estructuras moleculares de materiales que carecen de centros de inversión no se ha cumplido. Esto se debe en parte a que los materiales podrían ser heterogéneos en su entorno químico, composiciones y disposición geométrica, y un espectrómetro VSFG tradicional tiene una gran área de iluminación del orden de 100 μm². Por lo tanto, la espectroscopia VSFG tradicional informa sobre la información promediada por conjuntos de la muestra en un área de iluminación típica de 100 μm². Este promedio de conjuntos puede conducir a cancelaciones de señales entre dominios bien ordenados con orientaciones opuestas y a una caracterización errónea de las heterogeneidades locales 15,20,23,24.

Con los avances en los objetivos de microscopio basados en reflectantes de alta apertura numérica (NA) (geometrías Schwarzschild y Cassegrain), que están casi libres de aberraciones cromáticas, el tamaño de enfoque de los dos haces en experimentos VSFG puede reducirse de 100 μm 2 a 1-2 μm² y, en algunos casos, submicrónico²⁵. Incluyendo este avance tecnológico, nuestro grupo y otros han desarrollado VSFG en una plataforma de microscopía 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recientemente, hemos implementado un diseño óptico invertido y un esquema de detección de banda ancha³⁷, que permite una recopilación perfecta de imágenes multimodales (VSFG, segunda generación de armónicos (SHG) y óptica de campo claro). Las imágenes multimodales permiten una inspección rápida de las muestras mediante imágenes ópticas, correlacionando varios tipos de imágenes y localizando las posiciones de las señales en las imágenes de la muestra. Con la óptica de iluminación acromática y la elección de la fuente de iluminación láser pulsada, esta plataforma óptica permite la integración perfecta en el futuro de técnicas adicionales como la microscopía de fluorescencia³⁸ y la microscopía Raman, entre otras.

En esta nueva disposición, se han estudiado muestras como organizaciones jerárquicas y una clase de autoensamblajes moleculares (MSA). Estos materiales incluyen el colágeno y la biomimética, donde tanto la composición química como la organización geométrica son importantes para la función final del material. Debido a que VSFG es una señal óptica no lineal de segundo orden, es específicamente sensible a los arreglos intermoleculares^39,40, como la distancia intermolecular o los ángulos de torsión^, lo que lo convierte en una herramienta ideal para revelar tanto composiciones químicas como arreglos moleculares. Este trabajo describe las modalidades VSFG, SHG y de campo claro del instrumento central que consiste en un láser de estado sólido de cavidad dopada con iterbio que bombea un amplificador paramétrico óptico (OPA), un microscopio invertido multimodal construido en casa y un analizador de frecuencia monocromador acoplado a un detector de dispositivo acoplado cargado bidimensional (CCD)²⁷. Se proporciona un procedimiento de construcción y alineación paso a paso, y una lista completa de piezas de la configuración. Un análisis en profundidad de un MSA, cuya subunidad molecular fundamental está compuesta por una molécula de sulfato de sodio-dodecilo (SDS), un tensioactivo común, y dos moléculas de β-ciclodextrina (β-CD), conocida como SDS@2 β-CD en este documento, también se proporciona como ejemplo para mostrar cómo VSFG puede revelar detalles geométricos específicos de moléculas de materia organizada. También se ha demostrado que los detalles geométricos específicos de la MSA se pueden determinar con un enfoque de solucionador de funciones de red neuronal.

Protocol

1. Microscopio VSFG de barrido de línea hiperespectral Sistema láserUtilice un sistema de láser pulsado (consulte la tabla de materiales) centrado a 1025 nm ± 5 nm. El láser está configurado a 40 W, 200 kHz (200 μJ / pulso) con un ancho de pulso de ~ 290 fs.NOTA: La tasa de repetición exacta puede variar, y un láser de alta tasa de repetición generalmente funciona mejor para este microscopio VSFG. Guíe la salida del láser de semillas en un amplificador paramé…

Representative Results

Figura 5: Estructura molecular, morfología y orientación potencial del SDS@β-CD. (A) Vista superior y (B) vista lateral de la estructura química del SDS@β-CD. (C) Distribución muestral heterogénea representativa de las láminas de mesoescala en el plano muestral. La subunidad molecular podrí…

Discussion

Los pasos más críticos son de 1,42 a 1,44. Es fundamental alinear bien la lente del objetivo para obtener una resolución espacial óptica. También es importante recoger la señal emitida, retransmitir y proyectar el haz de escaneo como una línea en las rendijas de entrada. Las alineaciones adecuadas garantizarían la mejor resolución y la mejor relación señal-ruido. Para una muestra típica, como hojas de SDS@2 β-CD de 100 μm por 100 μm, una imagen de buena resolución (~1 μm de resolución) con una alta rela…

Materials

1x Camera Por	Thorlabs	WFA4100	connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold	Thorlabs	MRA25-M01	reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack	Thorlabs	UPH3-P5	hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick	Thorlabs	LCP4S	convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm	Thorlabs	CEA1500	provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris	Thorlabs	LCP50S	control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket	Thorlabs	LCP01B	mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon	SLS Optics Ltd.	Customized	generate narrow-band 1030 nm light
Cage Plate Mounting Bracket	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD	Andor Technologies	Newton	2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier	Light Conversion	Orpheus-One-HP	Tunable MID light generator
Copper Chloride	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror	Newport	Customized	selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter	Thorlabs	SM1A34	provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective	Zeiss	420150-9900-000	Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective	Pike Technologies Inc.	891-0007	Reflective objective
Laser	Carbide, Light-Conversion	C18212	Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS	Thorlabs	M32RMSS	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving	Thorlabs	M32M27S	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
Manual Mid-Height Condenser Focus Module	Thorlabs	ZFM1030	adjust the focus of an optical element
Monochromator	Andor Technologies	Shamrock 500i	Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms	Thorlabs	ZFM2020	control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner	Mad City Labs Inc.	MMP3	3D sample stage
Resonant Scanner	EOPC	SC-25	325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera	Thorlabs	DCU224C	Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens	Thorlabs	ITL200	white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard	Thorlabs	OPX2400	incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm	Thorlabs	KCB1	hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage	Thorlabs	CSA2100	securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,	Thorlabs	C60L24	enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages	Thorlabs	MCM3001	control ZFM2020
Tube lens	Thorlabs	LA1380-AB – N-BK7	SFG signal collection
Visible LED Set	Thorlabs	WFA1010	provide illumination in imaging setup
Whitelight Source	Thorlabs	WFA1010	Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages	Optosigma	TSD-65122CUU	positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier	Thorlabs	XT95RC4	mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation	Thorlabs	XYR1	precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole	Thorlabs	XYT1	provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser	Light Conversion	CB3-40W	Seed laser
β-Cyclodextrin	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	Self-assembly component