Ett multimodalt, snabbt ramverk för hyperspektral avbildning utvecklades för att erhålla VSFG-bilder (Broadband Vibrational Sum-Frequency Generation), tillsammans med bildmodaliteter för ljusfält, andra harmoniska generationen (SHG). På grund av att den infraröda frekvensen är i resonans med molekylära vibrationer, avslöjas mikroskopisk strukturell och mesoskopisk morfologi kunskap om symmetritillåtna prover.
Vibrational sum-frequency generation (VSFG), en andra ordningens icke-linjär optisk signal, har traditionellt använts för att studera molekyler vid gränsytor som en spektroskopiteknik med en rumslig upplösning på ~100 μm. Spektroskopin är dock inte känslig för heterogeniteten hos ett prov. För att studera mesoskopiskt heterogena prover pressade vi, tillsammans med andra, ner upplösningsgränsen för VSFG-spektroskopi till ~1 μm-nivå och konstruerade VSFG-mikroskopet. Denna avbildningsteknik kan inte bara lösa provmorfologier genom avbildning, utan också spela in ett bredbands-VSFG-spektrum vid varje pixel i bilderna. Eftersom det är en andra ordningens icke-linjär optisk teknik, möjliggör dess urvalsregel visualisering av icke-centrosymmetriska eller kirala självmonterade strukturer som vanligtvis finns inom bland annat biologi, materialvetenskap och bioteknik. I den här artikeln kommer publiken att guidas genom en inverterad överföringsdesign som gör det möjligt att avbilda ofixerade prover. Detta arbete visar också att VSFG-mikroskopi kan upplösa kemikaliespecifik geometrisk information om enskilda självmonterade ark genom att kombinera den med en neural nätverksfunktionslösare. Slutligen diskuterar bilderna som erhållits under brightfield-, SHG- och VSFG-konfigurationer av olika prover kortfattat den unika information som avslöjas av VSFG-avbildning.
Vibrationssummafrekvensgenerering (VSFG), en andra ordningens icke-linjär optisk teknik1,2, har använts i stor utsträckning som ett spektroskopiverktyg för att kemiskt profilera symmetritillåtna prover 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Traditionellt har VSFG tillämpats på gränssnittssystem 8,9,10,11 (dvs. gas-vätska, vätska-vätska, gas-fast, fast-vätska), som saknar inversionssymmetri – ett krav för VSFG-aktivitet. Denna tillämpning av VSFG har gett en mängd molekylära detaljer om begravda gränssnitt 12,13, konfigurationer av vattenmolekyler vid gränsytor 14,15,16,17,18 och kemiska arter vid gränsytor 19,20,21,22.
Även om VSFG har varit kraftfull när det gäller att bestämma molekylära arter och konfigurationer vid gränsytor, har dess potential att mäta molekylära strukturer hos material som saknar inversionscentra inte uppfyllts. Detta beror delvis på att materialen kan vara heterogena i sin kemiska miljö, sammansättning och geometriska arrangemang, och en traditionell VSFG-spektrometer har ett stort belysningsområde i storleksordningen 100 μm2. Således rapporterar traditionell VSFG-spektroskopi på ensemblemedelvärdesinformation av provet över ett typiskt 100 μm2 belysningsområde. Denna ensemblemedelvärdesberäkning kan leda till signalannulleringar mellan välordnade domäner med motsatta orienteringar och felkarakterisering av lokala heterogeniteter 15,20,23,24.
Med framsteg inom hög numerisk bländare (NA), reflektivbaserade mikroskopobjektiv (Schwarzschild- och Cassegrain-geometrier), som är nästan fria från kromatiska aberrationer, kan fokusstorleken för de två strålarna i VSFG-experiment minskas från 100 μm 2 till 1-2 μm2 och i vissa fall submikron25. Inklusive detta tekniska framsteg har vår grupp och andra utvecklat VSFG till en mikroskopiplattform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Nyligen har vi implementerat en inverterad optisk layout och bredbandsdetekteringsschema37, vilket möjliggör en sömlös insamling av multimodala bilder (VSFG, andra övertonsgenerationen (SHG) och ljusfältsoptik). Den multimodala avbildningen möjliggör snabb inspektion av prover med hjälp av optisk avbildning, korrelerar olika typer av bilder tillsammans och lokaliserar signalpositioner på provbilderna. Med den akromatiska belysningsoptiken och valet av pulsad laserbelysningskälla möjliggör denna optiska plattform framtida sömlös integration av ytterligare tekniker som fluorescensmikroskopi38 och Raman-mikroskopi, bland andra.
I detta nya arrangemang har prover som hierarkiska organisationer och en klass av molekylära självsammansättningar (MSA) studerats. Dessa material inkluderar kollagen och biomimetik, där både den kemiska sammansättningen och den geometriska organisationen är viktiga för materialets slutliga funktion. Eftersom VSFG är en andra ordningens icke-linjär optisk signal, är den specifikt känslig för intermolekylära arrangemang39,40, såsom intermolekylära avstånd eller vridningsvinklar, vilket gör den till ett idealiskt verktyg för att avslöja både kemiska sammansättningar och molekylära arrangemang. Detta arbete beskriver VSFG-, SHG- och ljusfältsmodaliteterna för kärninstrumentet som består av en ytterbium-dopad hålrums-solid-state-laser som pumpar en optisk parametrisk förstärkare (OPA), ett hemmabyggt multimodalt inverterat mikroskop och monokromatorfrekvensanalysator kopplad till en tvådimensionell CCD-detektor (Charged Coupled Device)27. En steg-för-steg-procedur för konstruktion och inriktning och en komplett dellista över installationen tillhandahålls. En djupgående analys av en MSA, vars grundläggande molekylära subenhet består av en molekyl av natrium-dodecylsulfat (SDS), ett vanligt ytaktivt ämne, och två molekyler av β-cyklodextrin (β-CD), känd som SDS@2 β-CD häri, ges också som ett exempel för att visa hur VSFG kan avslöja molekylspecifika geometriska detaljer i organiserad materia. Det har också visats att kemikaliespecifika geometriska detaljer i MSA kan bestämmas med en neural nätverks funktionslösare.
De mest kritiska stegen är från 1,42 till 1,44. Det är viktigt att rikta in objektivlinsen väl för en optisk rumslig upplösning. Det är också viktigt att samla in den utsända signalen, reläet och projicera skanningsstrålen som en linje vid ingångsslitsarna. Korrekta justeringar skulle garantera den bästa upplösningen och signal-brusförhållandet. För ett typiskt prov, som SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm ark, skulle en bild med bra upplösning (~1 μm upplösning) med ett högt signal-brusförhållande ta 20…
The authors have nothing to disclose.
Instrumentutvecklingen stöds av Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW och WX stöds av National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. BY stöds av Youth Innovation Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (CAS, 2021183).
1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB – N-BK7 | SFG signal collection |
Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |