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Biology

एकल नाभिक अनुक्रमण के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से एकल नाभिक के अलगाव के लिए एक सरल, त्वरित और आंशिक रूप से स्वचालित प्रोटोकॉल

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65611
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Roche Pharma Research and Early Development, Pharmaceutical Sciences, Roche Innovation Centre Basel

Summary

अध्ययन डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए एक सरल, त्वरित और आंशिक रूप से स्वचालित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

एकल-कोशिका और एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण ट्रांसक्रिप्टोमिक जानकारी के धन के कारण आम प्रयोगशाला अनुप्रयोग बन गए हैं जो वे प्रदान करते हैं। एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण, विशेष रूप से, मुश्किल-से-अलग ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण जमे हुए (अभिलेखीय) सामग्री के साथ भी संगत है। यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों और अभिकर्मकों का उपयोग करके आंशिक रूप से स्वचालित तरीके से डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, एक रोबोट डिस्सोसिएटर का उपयोग ऊतक समरूपीकरण को स्वचालित और मानकीकृत करने के लिए किया जाता है, इसके बाद नाभिक को फ़िल्टर करने के लिए एक अनुकूलित रासायनिक ढाल होता है। अंत में, हम एक स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक को सटीक और स्वचालित रूप से गिनते हैं। इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन माउस मस्तिष्क, चूहे के गुर्दे और साइनोमोलगस यकृत और प्लीहा ऊतक पर प्रदर्शित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता के बिना विभिन्न स्तनधारी ऊतकों के लिए सरल, तेज़ और आसानी से अनुकूलनीय है और डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले नाभिक प्रदान करता है।

Introduction

थोक आरएनए अनुक्रमण की तुलना में जीन अभिव्यक्ति के बढ़ते संकल्प के कारण एकल-कोशिका (एससी) और एकल-नाभिक (एसएन) आरएनए अनुक्रमण आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल बन गए हैं। हालांकि, ठोस ऊतकों से अच्छी गुणवत्ता वाले एकल कोशिका और एकल नाभिक की तैयारी का अलगाव एक चुनौती बनी हुई है और अक्सर एससी / एसएन-आरएनएसेक प्रयोगों में दर-सीमित कदम है। वास्तव में, प्रोटोकॉल की एक बहुतायत विकसित की गई है जो सेल / नाभिक निलंबन 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 प्राप्त करने के लिए विभिन्न रासायनिक और यांत्रिक प्रक्रियाओं का उपयोग करती है।. इसके अलावा, मलबे / झुरमुट आदि से ऐसी तैयारी को साफ करने की रणनीतियां, प्रवाह छंटाई से निस्पंदन से धोने तक होती हैं। इस तरह के प्रोटोकॉल अक्सर मैनुअल होते हैं (उपयोगकर्ता से संबंधित परिवर्तनशीलता के लिए अग्रणी), समय लेने वाले हो सकते हैं (जिससे सेल / न्यूक्लियस व्यवहार्यता कम हो जाती है), और / या सेल / न्यूक्लियस सॉर्टिंग के लिए फ्लो साइटोमीटर तक पहुंच की आवश्यकता हो सकती है। इस अध्ययन ने डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से एक सरल, त्वरित और आंशिक रूप से स्वचालित एकल नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया। हमने विशेष रूप से सेल अलगाव के विपरीत नाभिक अलगाव पर ध्यान केंद्रित किया क्योंकि यह जमे हुए ऊतकों के उपयोग के साथ संगत है, नमूना संग्रह / प्रसंस्करण को अधिक व्यावहारिक बनाता है और नमूनों के निष्पक्ष बैचिंग को सक्षम करता है, खासकर समय-पाठ्यक्रम प्रयोगों में। इसके अलावा, हालांकि परमाणु प्रतिलेख पूरी तरह से सेलुलर ट्रांसक्रिपटम को प्रतिबिंबित नहीं करता है, कई अध्ययनों से अब पता चला है कि एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण डेटा सेल-प्रकार की पहचान के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा के बराबर है, भले ही सेल प्रकारों का अनुपात 6,16,17,18,19 भिन्न हो सकता है।

नाभिक अलगाव में कई चरण होते हैं: 1) नाभिक को छोड़ने के लिए ऊतक का यांत्रिक या रासायनिक विघटन, 2) मलबे और झुरमुट की सफाई, और 3) डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की तैयारी के लिए नाभिक की सटीक गिनती। कई प्रोटोकॉल में, चरण 1 में अक्सर ऊतक 3,20 को बाधित करने के लिए डोंस होमोजिनाइज़र का उपयोग शामिल होता है। वैकल्पिक रूप से, रासायनिक तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि इन्हें अक्सर विभिन्न ऊतकों 2,5,6 के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। हमने अनुभव किया है कि एक मैनुअल ऊतक विघटन प्रक्रिया ऑपरेटर से जुड़ी परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है, जिससे नाभिक की परिवर्तनीय गुणवत्ता और उपज होती है। तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने और ऊतकों में काम करने वाले अधिक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल रखने के लिए, एक प्रोटोकॉल जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोबोट ऊतक विघटनकारी का उपयोग करता है,विकसित किया गया था। चरण 2 के लिए, हालांकि बफर एक्सचेंज आमतौर पर नाभिक को धोने के लिए सबसे सरल साधन है, हमने मलबे को अधिक पूरी तरह से हटाने के लिए अपेक्षाकृत कम सुक्रोज ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन चरण का उपयोग अपनाया। विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, हम अधिक प्रभावी माइलिन हटाने के लिए सुक्रोज ढाल के बजाय सिलिका कोलाइड ढाल का उपयोग करते हैं। अंत में, गिनती के लिए, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग नाभिक की गिनती और नेत्रहीन निरीक्षण के लिए स्वर्ण मानक है। हमारे प्रोटोकॉल में, इस कदम को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर22 का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से स्वचालित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया है और यह विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों (चूहा, माउस और गैर-मानव प्राइमेट) से मस्तिष्क, गुर्दे, प्लीहा और यकृत सहित कई जमे हुए स्तनधारी ऊतकों के साथ संगत है और एक बूंद-आधारित वाणिज्यिक मंच के साथ डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले नाभिक प्रदान करता है। प्रोटोकॉल ऊतक तैयार करने से एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण वर्कफ़्लो की शुरुआत तक लगभग 75 मिनट लेता है।

Protocol

सभी पशु अध्ययन पशु संरक्षण पर स्विस संघीय नियमों के सख्त पालन में बेसल-स्टैड के कैंटोनल पशु चिकित्सा प्राधिकरण के अनुमोदन के साथ या जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के अनुपालन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के साथ आयोजित किए गए थे।

1. ऊतक और अभिकर्मक / उपकरण तैयार करना

  1. सफाई और उपकरण तैयार करना
    1. 70% इथेनॉल और आरएनएस परिशोधन समाधान के साथ बेंचटॉप और चिमटी साफ करें। सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-ठंडा करें।
    2. कम से कम 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में नाभिक अलगाव कारतूस को प्री-ठंडा करें।
    3. रोबोटिक डिससोसिएटर शुरू करें और स्लाइडर को ठंडा करने के लिए स्क्रीन के शीर्ष दाईं ओर सेट करके और ठंडा करना शुरू करने के लिए उस पर क्लिक करके कूलिंग चालू करें ताकि स्लाइडर नारंगी दिखाई दे। जांचें कि संलग्न नाभिक भंडारण अभिकर्मक (एनएसआर) बोतल और नाभिक अलगाव बफर (एनआईबी) बोतल में पर्याप्त तरल बचा है और ठीक से ठंडा है।
    4. सूखी बर्फ और सूखी बर्फ पर प्री-कूल पेट्री व्यंजन और स्केलपेल ब्लेड से भरा एक पॉलीस्टाइनिन फोम बॉक्स तैयार करें।
  2. बफर की तैयारी
    1. तालिका 1 में दिखाए अनुसार 1.5 एम सुक्रोज कुशन समाधान (एससीएस) तैयार करें। प्रति नमूने चार 500 μL SCS एलिकोट प्राप्त करने के लिए SCS को 2 mL DNase / RNase ट्यूबों में 500 μL एलिकोट में वितरित करें। आगे के उपयोग तक एलिकोट को बर्फ पर रखें।
    2. मस्तिष्क के ऊतकों को संसाधित करने के मामले में, एनएसआर में सिलिका कोलाइड स्टॉक समाधान को पतला करके और आरएनएस अवरोधक को जोड़कर तालिका 2 में वर्णित 18% सिलिका कोलाइड समाधान तैयार करें। प्रति नमूना 18% सिलिका कोलाइड समाधान का 3 एमएल तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें।

2. ऊतक समरूपीकरण और नाभिक अलगाव।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूना निकालें और इसे तुरंत सूखी बर्फ पर रखें।
  2. प्री-कूल्ड पेट्री डिश या मेटल प्लेट पर प्री-कूल्ड स्केलपेल के साथ सूखी बर्फ पर 15-50 मिलीग्राम के टुकड़े में नमूना काटें (यदि यह पहले से ही सही आकार का नहीं है)। नमूने को सही दिशा में काटना सुनिश्चित करें ताकि नमूना अभी भी रुचि के अंग संरचनाओं का प्रतिनिधि हो।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के साथ, 15-50 मिलीग्राम परमाणु निष्कर्षण के लिए इष्टतम नमूना आकार है। सफाई के बाद अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए, कम से कम 25 मिलीग्राम के नमूना आकार की सिफारिश की जाती है। छोटे नमूनों के लिए, विशेष कारतूस उपलब्ध हैं जो रोबोट डिस्सोसिएटर के साथ छोटे इनपुट को संसाधित करने के लिए अनुकूलित हैं। डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उपज के साथ 4 मिलीग्राम से कम वजन वाले ऊतक के नमूनों को अलग करने के लिए छोटे इनपुट नाभिक अलगाव कारतूस का उपयोग किया गया था। चूहे के यकृत ऊतक से कम इनपुट कारतूस का उपयोग करके नाभिक उपज का एक उदाहरण तालिका 3 में दिखाया गया है।
  3. रेफ्रिजरेटर से नाभिक अलगाव कारतूस निकालें, इसे अनपैक करें, ग्राइंडर को हटा दें, और कारतूस के निचले भाग में आरएनएस इनहिबिटर (40 यू / μL) के 15 μL पिपेट करें।
    नोट: नाभिक निष्कर्षण के दौरान, रोबोट डिस्सोसिएटर 3 एमएल (कम मात्रा नाभिक निष्कर्षण प्रोटोकॉल के साथ) की कुल मात्रा में कारतूस में एनआईबी और एनएसआर जोड़ देगा। निष्कर्षण से पहले कारतूस में RNase अवरोधक (40 U / μL) के 15 μL जोड़कर, निलंबन में 0.2 U / μL की वांछित RNAse अवरोधक एकाग्रता होगी।
  4. चिमटी का उपयोग करके कारतूस के नीचे ऊतक का नमूना रखें। इष्टतम व्यवधान दक्षता रखने के लिए नमूने को कारतूस के केंद्र में बिल्कुल न रखें।
  5. उपकरण पर एक प्रोटोकॉल चलाएं का चयन करें और ऊपरी बाएं कोने में नाभिक विकल्प पर क्लिक करें।
    1. मेनू से, कम मात्रा नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल का चयन करें और सत्यापित करें कि परिवर्तन की गति संशोधित पर क्लिक करके तेज हो गई है। दरवाजा खोलकर और लाल नॉब उठाकर मंच से बाहर फिसलकर कारतूस को उपकरण में लोड करें।
    2. कारतूस को निर्दिष्ट स्थान पर डालें, कारतूस लॉक को घुमाएं, और चरण में तब तक स्लाइड करें जब तक कि लाल नॉब जगह पर क्लिक न हो जाए। दरवाजा बंद करें और अगला क्लिक करके उपकरण पर नाभिक निष्कर्षण चलाना शुरू करें। दौड़ लगभग 7 मिनट तक चलती है।
  6. एक बार दौड़ समाप्त हो जाने के बाद, लाल नॉब को उठाकर और मंच को बाहर खींचकर उपकरण से कारतूस को हटा दें। तुरंत कारतूस को बर्फ पर रखें।
  7. मस्तिष्क को छोड़कर सभी ऊतकों के लिए, चरण 3.1 पर आगे बढ़ें। मस्तिष्क के नमूनों के लिए, सीधे चरण 3.2 पर आगे बढ़ें।

3. नाभिक की सफाई

  1. सुक्रोज ग्रेडिएंट क्लीन-अप
    नोट: मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, इस चरण को छोड़ दें और सीधे चरण 3.2 पर जाएं। आरएनए क्षरण को कम करने के लिए सभी सफाई चरण बर्फ पर किए जाते हैं। बफर और ट्यूब के साथ-साथ सेंट्रीफ्यूज को प्री-कूल्ड करने की आवश्यकता होती है। सभी रीसस्पेंशन और मिक्सिंग चरण केवल सावधानीपूर्वक पाइपिंग द्वारा किए जाते हैं, क्योंकि भंवर नाभिक की गुणवत्ता और अखंडता से समझौता कर सकता है।
    1. पिपेट टिप के साथ डिस्सोसिएटर कारतूस पर गोल पन्नी को सावधानी पूर्वक छेदें।
      नोट: पृथक्करण के बाद, परिणामस्वरूप नाभिक निलंबन में 2 एमएल की अनुमानित मात्रा होती है। सुक्रोज ग्रेडिएंट क्लीन-अप की सुविधा के लिए, नाभिक निलंबन को दो 900 μL एलिकोट में विभाजित करें, जिसके परिणामस्वरूप सफाई के दौरान 1.8 एमएल नाभिक निलंबन की कुल मात्रा का उपयोग किया जा रहा है।
    2. कारतूस से नाभिक निलंबन के पहले 900 μL एलिकोट को निकालें और इसे 2 एमएल ट्यूब में पहले से तैयार 500 μL SCS एलिकोट में जोड़ें। मिश्रण के सजातीय होने तक पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
    3. नाभिक निलंबन - एससीएस मिश्रण के 1400 μL को निकालें और ट्यूब को एक कोण पर पकड़कर और मिश्रण को ड्रॉपवाइज जोड़कर इसे एक नए 500 μL SCS एलिकोट पर सावधानीपूर्वक परत करें, जिससे स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाला चरण पृथक्करण बन जाए ( चित्र 1A देखें)।
    4. ट्यूब को ध्यान से बंद करें और चरण पृथक्करण को परेशान किए बिना इसे बर्फ पर वापस रखें।
    5. चरण 3.1.2-3.1.4 को निलंबन के दूसरे 900 μL एलिकोट और एक नए एससीएस एलिकोट के साथ दोहराएं जिसमें ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले चरण पृथक्करण के साथ प्रति नमूने दो 2 एमएल ट्यूब हों।
    6. ध्यान से ट्यूबों को प्री-कूल्ड सेंट्रीफ्यूज में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 13,000 x g पर स्पिन करें।
    7. इस बीच, तालिका 4 में वर्णित एनएसआर तैयार करें, एनएसआर के एलिकोट में आरएनएस अवरोधक को जोड़कर। प्रति नमूना 1 एमएल एनएसआर तैयार करें।
      नोट: इस बिंदु पर, एकल सेल जीन अभिव्यक्ति अभिकर्मक जेल मोतियों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटाया जा सकता है, जिससे उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) के बराबर करने की अनुमति मिलती है, और टेम्पलेट स्विच ऑलिगो को कम टीई बफर में फिर से निलंबित किया जा सकता है।
    8. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, गोली को परेशान किए बिना दोनों ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और निर्माता की सिफारिश के अनुसार बर्फ-ठंडे एनएसआर के 50 μL में गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें। एक ही नमूने के दो छर्रों को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में पूल करें और 1 एमएल की कुल मात्रा में 900 μL बर्फ-ठंडा NSR जोड़ें। पाइपटिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।
    9. एक स्विंगिंग-बाल्टी रोटर सेंट्रीफ्यूज के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: नाभिक के नुकसान को कम करने के लिए स्विंगिंग-बाल्टी रोटर का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, खासकर जब नाभिक की उपज कम होने की उम्मीद होती है या जब ऊतक की छोटी मात्रा से शुरू होता है।
    10. इस बीच, तालिका 5 में वर्णित 0.04% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.2 यू / μएल आरएनएस अवरोधक के साथ 1x PBS (Ca2+ और Mg2+ के बिना) के प्रति नमूने 500 μL तैयार करें।
    11. गोली को छोड़े बिना सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दें और ऊपर तैयार किए गए पीबीएस समाधान के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें (1x PBS + 0.04% BSA + RNase अवरोधक 0.2 U / μL पर)।
      नोट: छोटे ऊतक नमूनों के लिए, नाभिक एकाग्रता कम हो सकती है, और इसलिए, एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस समाधान के केवल 50 μL में गोली को फिर से निलंबित करने की सिफारिश की जाती है।
    12. सीधे चरण 4 पर आगे बढ़ें।
  2. सिलिका कोलाइड ग्रेडिएंट क्लीन-अप
    नोट: मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, नाभिक निलंबन से माइलिन और मलबे को हटाने के लिए एक सिलिका कोलाइड ढाल सुक्रोज ढाल की तुलना में अधिक उपयुक्त है। आरएनए क्षरण को कम करने के लिए सभी सफाई चरण बर्फ पर किए जाते हैं। बफर और ट्यूब, साथ ही सेंट्रीफ्यूज को पूर्व-ठंडा करने की आवश्यकता होती है। सभी रीसस्पेंशन और मिक्सिंग चरण केवल सावधानीपूर्वक पाइपिंग द्वारा किए जाते हैं, क्योंकि भंवर नाभिक की गुणवत्ता और अखंडता से समझौता कर सकता है।
    1. पिपेट टिप के साथ डिस्सोसिएटर कारतूस पर गोल पन्नी को सावधानी पूर्वक छेदें।
    2. कारतूस से नाभिक निलंबन निकालें और इसे 5 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
    3. प्री-कूल्ड सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    4. गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें और 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे 18% सिलिका कोलाइड समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. 3 एमएल की कुल मात्रा के लिए 18% सिलिका कोलाइड समाधान का अतिरिक्त 2 एमएल जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।
    6. ब्रेक सेट के साथ स्विंगिंग-बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. इस बीच, एनएसआर के एलिकोट में आरएनएस अवरोधक को जोड़कर तालिका 4 में वर्णित एनएसआर तैयार करें। प्रति नमूना 1 एमएल एनएसआर तैयार करें।
      नोट: इस बिंदु पर, एकल सेल जीन अभिव्यक्ति अभिकर्मक जेल मोतियों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटाया जा सकता है, जिससे इसे आरटी के बराबर करने की अनुमति मिलती है और टेम्पलेट स्विच ऑलिगो को कम टीई बफर में फिर से निलंबित किया जा सकता है।
    8. शीर्ष पर तैरने वाली माइलिन परत को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज से नमूने को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    9. सबसे पहले, शीर्ष से माइलिन परत को हटा दें और त्याग दें; फिर, गोली को परेशान किए बिना पूरे सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
      नोट: माइलिन परत को 1-2 मिलीलीटर सतह पर तैरने वाले के साथ माइलिन परत को हटाने के लिए 1 एमएल पिपेट टिप के चारों ओर एक बाँझ लिंट-मुक्त पोंछे को लपेटकर आसानी से हटाया जा सकता है।
    10. निर्माता की सिफारिश के अनुसार बर्फ-ठंडे एनएसआर के 1 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
    11. एक स्विंगिंग-बाल्टी रोटर के साथ एक सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: नाभिक के नुकसान को कम करने के लिए स्विंगिंग-बाल्टी रोटर का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, खासकर जब नाभिक की उपज कम होने की उम्मीद होती है या जब ऊतक की छोटी मात्रा से शुरू होता है।
    12. इस बीच, तालिका 5 में वर्णित 0.04% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.2 यू / μएल आरएनएस अवरोधक के साथ 1x PBS (Ca2+ और Mg2+ के बिना) के प्रति नमूने 500 μL तैयार करें।
    13. गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें और ऊपर तैयार किए गए पीबीएस समाधान के 100 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें (1x PBS + 0.04% बीएसए + RNase अवरोधक 0.2 U / μL पर)।
      नोट: छोटे ऊतक नमूनों के लिए, नाभिक एकाग्रता कम हो सकती है, और इसलिए, एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस समाधान के केवल 50 μL में गोली को फिर से निलंबित करने की सिफारिश की जाती है।

4. गिनती

  1. प्रत्येक नमूने की गणना के लिए, 1: 3 कमजोर पड़ने के लिए पीबीएस समाधान के 20 μL में 10 μL नाभिक निलंबन को पतला करें।
  2. गिनती के लिए, फ्लोरोसेंट काउंटर काउंटिंग प्लेट के मिश्रण कुएं में प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला घोल के 25 μL जोड़ें। पतला नाभिक निलंबन के 25 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। 50 μL दाग वाले नमूने को मिश्रण से अच्छी तरह से लोडिंग अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
  3. सेल काउंटर पर गिनती प्लेट लोड करें और गिनती शुरू करें।
    नोट: नाभिक गणना 700 एमएस के एक्सपोजर समय के साथ लाल फ्लोरोसेंट चैनल से ली जाती है। इस चैनल को माइक्रोस्कोप के नीचे न्यूबॉयर चैंबर और ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ मैनुअल गिनती की क्रॉस-तुलना करके एक सटीक नाभिक गणना प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। उच्च सांद्रता पर, नाभिक एक साथ बहुत करीब होते हैं, जिससे सॉफ्टवेयर के लिए उन्हें अलग करना मुश्किल हो जाता है। इस मामले में, एक उपयुक्त कमजोर पड़ने में नमूने को फिर से गिनने की सिफारिश की जाती है। नाभिक की अखंडता के साथ-साथ स्वच्छता, उज्ज्वल क्षेत्र छवि से या माइक्रोस्कोप के नीचे मूल्यांकन किया जा सकता है।
  4. एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वांछित एकाग्रता के लिए पीबीएस (1x पीबीएस + 0.04% बीएसए + आरएनएस अवरोधक 0.2 यू / μL पर) के साथ नमूने को पतला करें।
    नोट: 700-1,200 नाभिक / μL के बीच सांद्रता को एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए इष्टतम माना जाता है। कम सेल सांद्रता, जैसे 700 नाभिक / μL, के परिणामस्वरूप परिवेश आरएनए से पृष्ठभूमि संदूषण कम हो सकता है।

5. पुस्तकालय की तैयारी

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति अभिकर्मकों के साथ एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण करें जो प्रति नमूने 8000-10,000 नाभिक की नाभिक वसूली को लक्षित करता है।

6. अनुक्रमण

  1. युग्मित-अंत, दोहरी अनुक्रमणिका के साथ वांछित अनुक्रमण गहराई के साथ पुस्तकालयों को अनुक्रमित करें, और निम्नलिखित अनुक्रमण पढ़ता है: पढ़ें 1: 28 चक्र, आई 7 सूचकांक: 10 चक्र, आई 5 सूचकांक: 10 चक्र और पढ़ें 2: 90 चक्र।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन और बहुमुखी प्रतिभा को तीन बी 6 चूहों से ताजा जमे हुए मस्तिष्क ओसीसीपिटल कॉर्टेक्स ऊतक पर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण करके, तीन विस्टार चूहों से ताजा जमे हुए ट्रांसवर्सल रूप से कटे हुए गुर्दे के ऊतक, अभिलेखीय (11 वर्षीय) यकृत और तीन मॉरीशस सिनोमोलगस मकाक से प्लीहा ऊतक करके प्रदर्शित किया जाता है। सभी जानवर गैर-संक्रमित थे।

जैसा कि आंकड़े 1 बी, सी में दिखाया गया है, अच्छी गुणवत्ता वाले नाभिक जो धब्बे, मलबे और झुरमुट के संकेतों से मुक्त थे, प्राप्त किए गए थे। सुक्रोज ढाल-आधारित निस्पंदन को विभिन्न घनत्व, स्पिन गति और समय का परीक्षण करके और माइक्रोस्कोप के तहत परमाणु शुद्धता / अखंडता का आकलन करने के साथ-साथ नाभिक आकार वितरण और उपज का आकलन करके मलबे के बहुमत को हटाने के लिए अनुकूलित किया गया था (चित्रा 1 डी)। इसने हमें 1.5 मीटर के सुक्रोज ढाल घनत्व का चयन करने और 15 मिनट के छोटे स्पिन समय का उपयोग करने की अनुमति दी। इसके बाद, नाभिक की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, डेटा को 10एक्स सेल रेंजर का उपयोग करके प्रीप्रोसेस किया गया था, और आगे डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण बेस्का23 का उपयोग करके किया गया था। >5% प्रतिशत माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री वाले नाभिक (क्योंकि ये क्षतिग्रस्त / तनावग्रस्त नाभिक होते हैं) को फ़िल्टर किया गया था, और 500-7,000 जीन (खाली बूंदों और गुणकों को कम करने के लिए) वाले नाभिक को बरकरार रखा गया था। हमने केवल उन जीनों को शामिल किया जो कम से कम 30 नाभिक में मौजूद थे। हमने प्रति मस्तिष्क कॉर्टेक्स नमूने में 8,000 नाभिक और गुर्दे, यकृत और प्लीहा के नमूने में 10,000 नाभिक को लक्षित किया। निस्पंदन के बाद, तीन मस्तिष्क के नमूनों से 10,644 उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक, तीन गुर्दे के नमूनों से 14,960 उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक, तीन यकृत नमूनों से 18,795 उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक और तीन प्लीहा के नमूनों से 13,882 उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक प्राप्त किए गए। चित्रा 2 ए, डी, जी, जे प्रत्येक नमूने में यूएमआई गणना, जीन गणना और माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के वितरण का प्रतिनिधित्व करने वाले वायलिन प्लॉट दिखाते हैं। मस्तिष्क के सभी नमूनों में गिनती की औसत संख्या 7,563 यूएमआई / नाभिक और 3,208 जीन / नाभिक थी। सभी गुर्दे के नमूनों में गिनती की औसत संख्या 3,841 यूएमआई / नाभिक और 1,915 जीन / नाभिक थी। सभी यकृत नमूनों में गिनती की औसत संख्या 2,649 यूएमआई / नाभिक और 1,676 जीन / नाभिक थी। सभी प्लीहा के नमूनों में गिनती की औसत संख्या 1,609 यूएमआई / नाभिक और 1,138 जीन / नाभिक थी। फिर हमने अत्यधिक परिवर्तनशील जीन का उपयोग करके क्लस्टर उत्पन्न किए और ज्ञात मार्कर जीन17,24,25,26 का उपयोग करके उन्हें एनोटेट किया। जैसा कि चित्रा 2 बी, ई, एच, के में देखा गया है, हम प्रत्येक ऊतक से अपेक्षित सेल प्रकारों की पहचान करने में सक्षम थे। इसके अलावा, जैसा कि चित्रा 2 बी, ई, एच, के में देखा गया है, सभी जानवरों ने सभी समूहों में योगदान दिया, जो प्रोटोकॉल द्वारा पेश की गई समग्र कम तकनीकी परिवर्तनशीलता को दर्शाता है। इसके अलावा, सेलुलर अनुपात प्रति ऊतक प्रकार के सभी तीन नमूनों में तुलनीय थे, जैसा कि यूएमआई और जीन गणना (चित्रा 2 ए, सी, डी, एफ, जी, आई, जे, एल) थे। एक उल्लेखनीय अपवाद यकृत है, जहां तीन यकृत नमूनों के बीच हेपेटोसाइट आबादी अनुपात और प्रोफ़ाइल में भिन्न थी। यह जानवरों (लिंग, आयु, चयापचय स्थिति) के बीच जैविक अंतर के कारण सबसे अधिक संभावना है।

Figure 1
चित्रा 1: नाभिक की गुणवत्ता और सुक्रोज ढाल अनुकूलन का आकलन । (ए) सुक्रोज ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान अपेक्षित चरण पृथक्करण को एक तीर के साथ दिखाया गया है। (बी) प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त प्रोपिडियम आयोडाइड से सना चूहा गुर्दे (ऊपर) और साइनोमोलगस प्लीहा (नीचे) नाभिक की प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां। (सी) माउस यकृत (ऊपर) और माउस मस्तिष्क (नीचे) से अलग नाभिक की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवियां, स्केल बार 500 μm। नाभिक की नियमित चिकनी सतह पर ध्यान दें जो अच्छी परमाणु गुणवत्ता का संकेत देती है। (डी) सुक्रोज ग्रेडिएंट ऑप्टिमाइज़ेशन। कई सुक्रोज घनत्व, स्पिन गति और स्पिन समय का परीक्षण किया गया था। प्रत्येक स्थिति के लिए नाभिक, नाभिक आकार वितरण और नाभिक उपज की उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवियां दिखाई जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस मस्तिष्क ओसीसीपिटल कॉर्टेक्स, चूहे के गुर्दे (कॉर्टेक्स और मेडुला), और सिनोमोलगस मकाक यकृत और प्लीहा पर एसएनआरएनएसेक से प्रतिनिधि डेटा। (ए) वायलिन प्लॉट जीन / न्यूक्लियस, यूएमआई / न्यूक्लियस के वितरण और प्रति मस्तिष्क नमूने में प्रतिशत माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री दिखाते हैं। (बी) बाएं पैनल: यूएमएपी प्लॉट मस्तिष्क में पहचाने गए समूहों में प्रत्येक नमूने के योगदान को दर्शाता है। दायां पैनल: मस्तिष्क के ऊतकों में मार्कर जीन के आधार पर एनोटेट किए गए समूहों की पहचान दिखाने वाला यूएमएपी। (सी) 3 मस्तिष्क नमूनों में सेलुलर अनुपात देखा गया। (डी) वायलिन प्लॉट जीन / न्यूक्लियस, यूएमआई / न्यूक्लियस के वितरण और प्रति गुर्दे के नमूने में प्रतिशत माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री दिखाते हैं। (ई) बाएं पैनल: यूएमएपी प्लॉट गुर्दे में पहचाने गए समूहों में प्रत्येक नमूने के योगदान को दर्शाता है। दायां पैनल: यूएमएपी गुर्दे के ऊतकों में मार्कर जीन के आधार पर एनोटेट किए गए समूहों की पहचान दिखाता है। (एफ) 3 गुर्दे के नमूनों में सेलुलर अनुपात देखा गया। (जी) वायलिन प्लॉट जीन / न्यूक्लियस, यूएमआई / न्यूक्लियस, और प्रति यकृत नमूने प्रतिशत माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के वितरण को दर्शाता है। (एच) बाएं पैनल: यूएमएपी प्लॉट यकृत में पहचाने गए समूहों में प्रत्येक नमूने के योगदान को दर्शाता है। दायां पैनल: यूएमएपी यकृत ऊतक में मार्कर जीन के आधार पर एनोटेट किए गए समूहों की पहचान दिखाता है। (i) 3 यकृत नमूनों में सेलुलर अनुपात देखा गया। (जे) वायलिन प्लॉट जीन / नाभिक, यूएमआई / नाभिक, और प्रति प्लीहा नमूने में प्रतिशत माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के वितरण को दर्शाता है। (के) बाएं पैनल: यूएमएपी प्लॉट प्लीहा में पहचाने गए समूहों में प्रत्येक नमूने के योगदान को दर्शाता है। दायां पैनल: यूएमएपी प्लीहा ऊतक में मार्कर जीन के आधार पर एनोटेट किए गए समूहों की पहचान दिखाता है। (एल) 3 प्लीहा नमूनों में सेलुलर अनुपात देखा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक स्टॉक एकाग्रता प्रति नमूना मात्रा अंतिम एकाग्रता
सुक्रोज कुशन समाधान 2 M 1500 μL 1.5 मीटर
सुक्रोज कुशन बफर - 500 μL -
Dithiothreitol (DTT) 1 M 2 μL 1 mM
आरएनएस अवरोधक 40 U/μL 10 μL 0.2 U/μL

तालिका 1: 1.5 एम सुक्रोज कुशन समाधान (एससीएस) की तैयारी। इस समाधान का उपयोग चरण 3.1 में सफाई के दौरान सुक्रोज ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए किया जाता है और प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले हर बार ताजा तैयार किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के दौरान हमेशा एससीएस को बर्फ पर रखें। इस तालिका में उल्लिखित समाधान सामग्री की तालिका में संदर्भित हैं।

घटक स्टॉक एकाग्रता प्रति नमूना मात्रा अंतिम एकाग्रता
सिलिका कोलाइड स्टॉक समाधान 90% 600 μL 18%
नाभिक भंडारण अभिकर्मक (एस 2 जीनोमिक्स) - 2400 μL -
आरएनएस अवरोधक 40 U/μL 15 μL 0.2 U/μL

तालिका 2: 18% सिलिका कोलाइड समाधान की तैयारी। इस समाधान का उपयोग चरण 3.2 में सफाई के दौरान सिलिका कोलाइड ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए किया जाता है और प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले हर बार ताजा तैयार किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के दौरान हमेशा बर्फ पर 18% सिलिका कोलाइड समाधान रखें।

टिशू पेपर नमूना वजन कारतूस पैदावार
चूहे का जिगर 25 मिलीग्राम नाभिक अलगाव कारतूस ऊतक के प्रति मिलीग्राम 65,000 नाभिक
चूहे का जिगर 4 मिलीग्राम छोटे इनपुट नाभिक अलगाव कारतूस ऊतक के प्रति मिलीग्राम 32,000 नाभिक

तालिका 3: सुक्रोज ग्रेडिएंट क्लीन-अप के बाद नाभिक अलगाव कारतूस बनाम नाभिक अलगाव कारतूस से नाभिक उपज।

घटक स्टॉक एकाग्रता प्रति नमूना मात्रा अंतिम एकाग्रता
नाभिक भंडारण अभिकर्मक - 1000 μL -
आरएनएस अवरोधक 40 U/μL 5 μL 0.2 U/μL

तालिका 4: नाभिक भंडारण अभिकर्मक (एनएसआर) की तैयारी। इस समाधान का उपयोग चरण 3-5 में नाभिक अलगाव के दौरान और साथ ही चरण 3.1.8 में सफाई के दौरान किया जाता है। इसे 4 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। क्लीन-अप चरण 6 में सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान आरएनएस अवरोधक के साथ एक ताजा एलिकोट तैयार करें। इस तालिका में उल्लिखित समाधान सामग्री की तालिका में संदर्भित हैं।

1x PBS + 0.04% बीएसए स्टॉक समाधान
घटक स्टॉक एकाग्रता स्टॉक के लिए मात्रा अंतिम एकाग्रता
पीबीएस (कोई सीए 2 +, कोई एमजी2 +) नहीं 1x 30 एमएल -
बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) 30% 40 μL 0.04%
1x PBS + 0.04% BSA + 0.2 U/μL RNAse अवरोधक
घटक स्टॉक एकाग्रता प्रति नमूना मात्रा अंतिम एकाग्रता
1x PBS + 0.04% बीएसए स्टॉक समाधान - 500 μL -
आरएनएस अवरोधक 40 U/μL 2.5 μL 0.2 U/μL

तालिका 5: पीबीएस + 0.04% बीएसए की तैयारी। इस समाधान का उपयोग चरण 3.1.10 में सफाई के अंत में और 10एक्स एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (चरण 4.4 की गिनती) के लिए वांछित एकाग्रता के लिए नाभिक निलंबन को पतला करने के लिए किया जाता है। स्टॉक समाधान को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। क्लीन-अप चरण 6 में सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान आरएनएस अवरोधक के साथ एक ताजा एलिकोट तैयार करें।

Discussion

हमने जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक प्राप्त करने के लिए एक बहुमुखी और आंशिक रूप से स्वचालित प्रोटोकॉल विकसित किया है और माउस मस्तिष्क, चूहे के गुर्दे और साइनोमोलगस यकृत और प्लीहा ऊतक पर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है।

मस्तिष्क, गुर्दे, प्लीहा और यकृत ऊतक 6,7,20,24,25,26 में एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन की तुलना करते समय, हम देखते हैं कि हम प्रति नाभिक समान संख्या में जीन और यूएमआई गणना का पता लगाने में सक्षम हैं और अपेक्षित सेल प्रकारों को पुनर्प्राप्त करने में सक्षम हैं। मौजूदा तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं। सबसे पहले, इस अध्ययन में प्रोटोकॉल ऊतक समरूपीकरण और एकल नाभिक के अलगाव को स्वचालित करता है। यह एक रोबोट ऊतक अवरोधक21 के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाता है। अधिकांश प्रोटोकॉल में, एकल नाभिक 3,20 को मुक्त करने के लिए ऊतक को डोंस होमोजिनाइज़र के साथ समरूप किया जाता है। हालांकि, हमने देखा है कि यह मैनुअल कदम समरूपीकरण के दौरान लगाए गए बल की मात्रा के आधार पर नाभिक उपज और अखंडता में प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता पैदा कर सकता है, प्रयोगों की प्रजनन क्षमता से समझौता कर सकता है। यहां, निश्चित सेटिंग्स के साथ एक स्वचालित ऊतक ग्राइंडर का उपयोग करके, प्रयोगों में अधिक स्थिरता के साथ अच्छी नाभिक गुणवत्ता और उपज प्राप्त की गई थी। इसके अलावा, इस चरण को स्वचालित करने से प्रोटोकॉल का हैंड-ऑन समय भी कम हो जाता है (ऊतक विघटन चरण में लगभग 7 मिनट लगते हैं), जिससे उपयोगकर्ता को बाद के चरणों के लिए तैयार करने की अनुमति मिलती है। दूसरा, इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल बहुमुखी है, यानी, यह विभिन्न प्रजातियों के विभिन्न ऊतकों के साथ संगत है। यह हमें लंबे प्रोटोकॉल अनुकूलन से बचने में सक्षम बनाता है, उदाहरण के लिए, विभिन्न ऊतकों 2,5,6 के लिए होमोजेनाइजेशन बफर / डिटर्जेंट की पहचानकरने के लिए। तीसरा, यह प्रोटोकॉल स्वच्छ नाभिक प्राप्त करने के लिए फ्लो सॉर्टर तक पहुंच पर निर्भर नहीं करता है, इसलिए इसे उन प्रयोगशालाओं के लिए अधिक सुलभ बनाता है जिनके पास प्रवाह छंटाई के लिए आवश्यक उपकरण / विशेषज्ञता नहीं है। इसके बजाय, हमने अधिकांश मलबे को हटाने के लिए सुक्रोज ढाल-आधारित निस्पंदन को अनुकूलित किया। हालांकि, विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, अधिक कुशल माइलिन हटाने के लिए सुक्रोज ढाल के बजाय सिलिका कोलाइड ढाल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हमने यह भी पाया है कि सुक्रोज/सिलिका कोलाइड ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के अंत में स्विंगिंग-बकेट रोटर का उपयोग नाभिक के नुकसान को कम करता है। इसलिए, इस तरह के रोटर का उपयोग अत्यधिक अनुशंसित है। चौथा, नाभिक की गणना करने के लिए कई तरीकों का परीक्षण करने के बाद (माइक्रोस्कोप के तहत मैनुअल गिनती, कई स्वचालित काउंटरों का उपयोग), एक स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर22 के उपयोग की सिफारिश की जाती है। प्रोपिडियम आयोडाइड जैसे डीएनए इंटरकैलेटिंग डाई का उपयोग, नाभिक गिनती की सटीकता को बढ़ाता है। पांचवां, इस प्रोटोकॉल को माइक्रोफ्लुइडिक चिप लोड करने से शुरू करने में लगभग 75 मिनट लगते हैं। यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि कई नमूनों को संसाधित करते समय नाभिक अखंडता उच्च रहती है। अंत में, हमने प्रोटोकॉल को इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) -एम्बेडेड ऊतक के साथ भी संगत पाया है। यदि ऐसी सामग्री का उपयोग किया जाता है, तो होमोजेनाइजेशन से पहले स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को ओसीटी ब्लॉक से हटाया जा सकता है।

एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण डेटासेट में एक लगातार चुनौती परिवेश आरएनए की उपस्थिति है, जो गैर-परमाणु (जैसे, माइटोकॉन्ड्रियल) के साथ-साथ परमाणु व्युत्पन्न27,28 हो सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में, माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए (गैर-परमाणु परिवेश आरएनए के लिए एक प्रॉक्सी) फ़िल्टरिंग से पहले भी कम है (दिखाए गए ऊतकों के लिए 0.1-1.6%)। हालांकि, अन्य प्रोटोकॉल और डेटासेट के समान, प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों (जैसे यकृत में हेपेटोसाइट्स, दिमाग में न्यूरॉन्स, आदि) के नाभिक में अत्यधिक व्यक्त जीन से परिवेशी आरएनए संदूषण अभीभी मौजूद है। कई जैव सूचना विज्ञान उपकरण, जैसे सेलबेंडर, सूपएक्स, आदि मौजूद हैं जो नाभिक एनोटेशन 29,30,31 से पहले ऐसे परिवेश आरएनए संदूषण को हटा सकते हैं। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि यद्यपि ऊतक व्यवधान और नाभिक अलगाव चरण स्वचालित हैं, इस चरण का थ्रूपुट अभी भी सीमित है क्योंकि एक समय में केवल एक नमूना संसाधित किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि इस चरण में ऊतक के प्रति टुकड़े में केवल लगभग 7 मिनट लगते हैं, इसलिए कई नमूने अभी भी एक बैच में संसाधित किए जा सकते हैं। हम आम तौर पर प्रति बैच चार नमूने संसाधित करते हैं लेकिन अच्छे परिणामों के साथ प्रति बैच छह नमूने तक किए हैं। एक साथ दो नमूनों के समानांतर प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए रोबोटिक डिससोसिएटर में हालिया सुधार प्रति बैच 8-12 नमूनों के प्रसंस्करण को सक्षम करेगा, जो एकल नाभिक एनकैप्सुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक चिप के थ्रूपुट के साथ संगत है।

यद्यपि हमने इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग किए गए नाभिक का उपयोग अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे कि एटीएसी-सेक या एसएनआरएनएसेक के लिए अन्य प्लेटफार्मों का उपयोग करके नहीं किया है, यहां उपयोग किए जाने वाले जीन अभिव्यक्ति अभिकर्मकों के साथ प्राप्त डेटा की गुणवत्ता के आधार पर, हमारा मानना है कि हमारा प्रोटोकॉल अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ संगत होना चाहिए। हालांकि, भविष्य के काम में इस प्रोटोकॉल को अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ परीक्षण करना शामिल होगा, जैसे कि एटीएसी-सेक।

निष्कर्ष में, हमने डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए एक त्वरित, सरल और आंशिक रूप से स्वचालित नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसे विभिन्न प्रकार के जमे हुए स्तनधारी ऊतकों के साथ संगत दिखाया गया है।

Disclosures

अध्ययन के संचालन के दौरान सभी लेखक एफ हॉफमैन-ला रोश के कर्मचारी थे।

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि में विश्लेषण किए गए जानवरों के ऊतकों को प्रदान करने के लिए फिलिप बोचनर, मैरियन रिचर्डसन, पेट्रा स्टेबल और मैथियास सेलहॉसेन को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पेट्रा श्वाली, क्लास हटजे, रोलैंड श्मकी और मार्टिन एबेलिंग को उनके जैव सूचना विज्ञान समर्थन के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M DTT Thermo Fisher Scientific P2325
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
10x Magnetic Separator 10x genomics PN-120250
10x Vortex Adapter 10x genomics PN-120251
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190144 stored at 4°C
30% Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9576_50ML
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15568025
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Scientific 10777019 Stored at -20 °C
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience CELMXSYSF2 Automated fluorescent cell counter
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns 10x genomics PN-1000127 Single cell gene expression reagent, stored at room temperature
Chromium Next GEM Secondary Holder 10x genomics PN-1000195
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns 10x genomics PN-1000129 Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns 10x genomics PN-1000128 Single cell gene expression reagent
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns 10x genomics PN-1000158 Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns 10x genomics PN-1000130 Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Divided Polystyrene Reservoirs VWR 41428-958
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf Sigma-Aldrich EP0030108051
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf Sigma-Aldrich EP0030108078
Dry ice - -
Dynabeads MyOne SILANE 10x genomics PN-2000048 Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C
Ethanol Pure Sigma-Aldrich E7023
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-16
Heatblock
High-Throughput Nexcelom Counting Plates Nexcelom Bioscience CHM24-A100-001 Cell counter counting plate
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090015
Mini Centrifuge - -
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) Illumina 2002840
Nuclei Isolation Buffer S2 Genomics 100-063-396 Stored at 4 °C
Nuclei Isolation Cartridge S2 Genomics 100-063-287 Precooled at 4 °C before use
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution Sigma-Aldrich NUC201-1KT Sucrose cushion solution 
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer Sigma-Aldrich NUC201-1KT
Nuclei Storage Reagent S2 Genomics 100-063-405 Stored at 4 °C
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 30124359
Percoll GE Healthcare 17-0891-02 Silica colloid solution
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) Eppendorf  5805000010
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) Eppendorf  5811000015
RNAseZap Ambion AM9780 RNAse decontamination solution
Round cell culture petri dish SPL 330005
Scalpel disposable Aesculap AG BA210 pre-cooled on dry ice before use
Single Index Kit T Set A, 96 rxns 10x genomics PN-1000213 Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Singulator 100 System S2 Genomics - Commercially available robotic tissue dissociator
Sodium Hydroxide 1M Sigma-Aldrich 72068
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter b23318
Sterile tweezers - -
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977049
ViaStain PI Staining Solution Nexcelom Bioscience CS1-0109-5mL Propidium iodide staining solution
Vortex Mixer+A2:D44 VWR -

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References

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जीव विज्ञान अंक 197 एकल नाभिक अनुक्रमण एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण जीन अभिव्यक्ति मुश्किल-से-अलग ऊतक अभिलेखीय सामग्री रोबोट डिससोसिएटर ऊतक समरूपीकरण रासायनिक ढाल नाभिक फ़िल्टरिंग स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर माउस मस्तिष्क चूहा गुर्दे साइनोमोलगस यकृत प्लीहा ऊतक
एकल नाभिक अनुक्रमण के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से एकल नाभिक के अलगाव के लिए एक सरल, त्वरित और आंशिक रूप से स्वचालित प्रोटोकॉल
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Stalder, L., Koechl, F., Hahn, K., Sultan, M., Prasad, M. K. A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65611, doi:10.3791/65611 (2023).

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