Summary
Studien beskriver ett enkelt, snabbt och delvis automatiserat protokoll för att isolera högkvalitativa kärnor från frysta däggdjursvävnader för nedströms RNA-sekvensering med enstaka kärnor.
Abstract
RNA-sekvensering med en cell och en kärna har blivit vanliga laboratorietillämpningar på grund av den rikedom av transkriptomisk information som de tillhandahåller. Sekvensering med en enda kärna av RNA är särskilt användbar för att undersöka genuttryck i vävnader som är svåra att separera. Dessutom är detta tillvägagångssätt också kompatibelt med fryst (arkiv) material. Här beskriver vi ett protokoll för att isolera högkvalitativa enstaka kärnor från frysta däggdjursvävnader för nedströms enkelkärnig RNA-sekvensering på ett delvis automatiserat sätt med hjälp av kommersiellt tillgängliga instrument och reagenser. Specifikt används en robotdissociator för att automatisera och standardisera vävnadshomogenisering, följt av en optimerad kemisk gradient för att filtrera kärnorna. Slutligen räknar vi noggrant och automatiskt kärnorna med hjälp av en automatiserad fluorescerande cellräknare. Prestandan för detta protokoll demonstreras på mushjärna, råttnjure och cynomolgus lever- och mjältvävnad. Detta protokoll är enkelt, snabbt och lätt anpassningsbart till olika däggdjursvävnader utan att kräva omfattande optimering och ger kärnor av god kvalitet för nedströms RNA-sekvensering med enstaka kärnor.
Introduction
Encells-RNA-sekvensering (sc) och enkelkärna (sn) har blivit vanliga protokoll inom molekylär- och cellbiologi på grund av den ökade upplösningen av genuttryck jämfört med bulk-RNA-sekvensering. Isoleringen av encells- och enkelkärnepreparat av god kvalitet från fasta vävnader är dock fortfarande en utmaning och är ofta det hastighetsbegränsande steget i sc/sn-RNAseq-experiment. Faktum är att en uppsjö av protokoll har utvecklats som använder olika kemiska och mekaniska procedurer för att erhålla cell/kärnsuspensioner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Dessutom sträcker sig strategier för att rensa upp sådana preparat från skräp/klumpar etc. från flödessortering till filtrering till tvättning. Sådana protokoll är ofta manuella (vilket leder till användarrelaterad variabilitet), kan vara tidskrävande (vilket leder till minskad cell-/kärnviabilitet) och/eller kan kräva tillgång till en flödescytometer för cell-/kärnsortering. Denna studie fokuserade på att utveckla ett enkelt, snabbt och delvis automatiserat isoleringsprotokoll för enstaka kärnor från frysta däggdjursvävnader för nedströms RNA-sekvenseringsapplikationer. Vi fokuserade specifikt på nukleiisolering i motsats till cellisolering eftersom det är kompatibelt med användning av frysta vävnader, vilket gör provtagning/bearbetning mer praktisk och möjliggör opartisk batchning av prover, särskilt i tidsförloppsexperiment. Dessutom, även om det nukleära transkriptomet inte helt återspeglar det cellulära transkriptomet, har flera studier nu visat att sekvenseringsdata för enskilda kärnor är jämförbara med sekvenseringsdata för enskilda celler för identifiering av celltyp, även om proportionerna av celltyper kan variera 6,16,17,18,19.
Kärnisolering består av flera steg: 1) mekanisk eller kemisk störning av vävnaden för att frigöra kärnorna, 2) sanering av skräp och klumpar, och 3) noggrann räkning av kärnor för förberedelse för nedströmsapplikationer. I ett antal protokoll innebär steg 1 ofta användning av en Dounce homogenisator för att störa vävnaden 3,20. Alternativt kan kemiska metoder användas, även om dessa ofta behöver optimeras för olika vävnader 2,5,6. Vi har upplevt att en manuell vävnadsstörningsprocedur är benägen till operatörsassocierad variabilitet, vilket leder till varierande kvalitet och utbyte av kärnor. För att minimera den tekniska variationen och för att få ett mer konsekvent och reproducerbart protokoll som fungerar över vävnader, utvecklades ett protokoll som använder en kommersiellt tillgänglig robotvävnadsdissociator21. För steg 2, även om buffertutbyte vanligtvis är det enklaste sättet att tvätta kärnor, antog vi användningen av ett relativt kort sackarosgradientcentrifugeringssteg för att få en mer grundlig borttagning av skräp. För hjärnvävnad specifikt använder vi en kiseldioxidkolloidgradient istället för en sackarosgradient för effektivare myelinborttagning. Slutligen, för räkning, är användningen av en hemocytometer guldstandarden för att räkna och visuellt inspektera kärnorna. I vårt protokoll kan detta steg automatiseras på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en kommersiellt tillgänglig automatiserad fluorescerande cellräknare22. Detta protokoll har testats och är kompatibelt med flera frysta däggdjursvävnader, inklusive hjärna, njure, mjälte och lever, från olika däggdjursarter (råtta, mus och icke-mänskliga primater) och ger kärnor av god kvalitet för nedströms RNA-sekvensering med enstaka kärnor med en droppbaserad kommersiell plattform. Protokollet tar cirka 75 minuter från vävnadsberedning till start av arbetsflödet för sekvensering av enskilda kärnor.
Protocol
Alla djurstudier har utförts med godkännande av den kantonala veterinärmyndigheten i Basel-Stadt i strikt överensstämmelse med de schweiziska federala bestämmelserna om djurskydd eller med godkännande av den institutionella djurvårds- och användningskommittén i enlighet med den tyska djurskyddslagen.
1. Beredning av vävnad och reagens/instrument
- Rengöring och förberedelse av instrument
- Rengör bänkskivor och pincetter med 70 % etanol och RNase-dekontamineringslösning. Kyl centrifugerna till 4 °C.
- Kyl kärnisoleringspatronerna i kylskåp vid 4 °C i minst 30 minuter.
- Starta robotdissociatorn och slå på kylningen genom att ställa in reglaget längst upp till höger på skärmen för att svalna och genom att klicka på det för att börja kyla så att reglaget ser orange ut. Kontrollera att den bifogade NSR-flaskan (Nuclei Storage Reagens) och NIB-flaskan (Nuclei Isolation Buffer) har tillräckligt med vätska kvar och är ordentligt kylda.
- Förbered en låda av polystyrenskum fylld med torris och förkyl petriskålar och skalpellblad på torris.
- Förberedelse av buffert
- Bered 1,5 M sackaroslösning (SCS) enligt tabell 1. Fördela SCS i 500 μl alikvoter i 2 ml DNas/RNasrör för att erhålla fyra 500 μL SCS-alikvoter per prov. Förvara alikvoterna på is tills vidare användning.
- Vid bearbetning av hjärnvävnad bereds i stället en 18-procentig kolloidlösning av kiseldioxid enligt beskrivningen i tabell 2 genom att späda stamlösningen av kiseldioxidkolloiden i NSR och tillsätta RNashämmare. Förbered 3 ml 18 % kolloidlösning av kiseldioxid per prov och lägg det på is.
2. Homogenisering av vävnader och isolering av kärnor
- Ta ut provet ur frysen vid -80 °C och lägg det omedelbart på torris.
- Skär provet på en förkyld petriskål eller metallplatta på torris med en förkyld skalpell i en 15-50 mg bit (om den inte redan är av rätt storlek). Var noga med att skära sample i rätt riktning så att sample fortfarande är representativ för de organstrukturer som är av intresse.
OBS: Med detta protokoll är 15-50 mg den optimala provstorleken för kärnextraktion. För att uppnå ett bra utbyte efter saneringen rekommenderas en provstorlek på minst 25 mg. För mindre prover finns speciella patroner tillgängliga som är optimerade för bearbetning av små ingångar med robotdissociatorn. Små isoleringspatroner för ingående kärnor användes för att dissociera vävnadsprover som vägde så lite som 4 mg med tillräckligt utbyte för nedströms RNA-sekvensering med enstaka kärnor. Ett exempel på cellkärneutbyte med hjälp av den låga tillförselpatronen från levervävnad från råtta visas i tabell 3. - Ta ut kärnisoleringspatronen ur kylskåpet, packa upp den, ta bort kvarnen och pipettera 15 μL RNashämmare (40 U/μL) till botten av patronen.
OBS: Under kärnextraktionen kommer robotdissociatorn att lägga till NIB och NSR till patronen till en total volym på 3 ml (med protokollet för extraktion av kärnor med låg volym). Genom att tillsätta 15 μl RNashämmare (40 E/μL) till cylinderampullen före extraktionen kommer suspensionen att ha den önskade RNAsehämmarkoncentrationen på 0,2 E/μL. - Placera vävnadsprovet på botten av patronen med hjälp av en pincett. Placera inte sample exakt i mitten av patronen för att få optimal störningseffektivitet.
- Välj Kör ett protokoll på instrumentet och klicka på alternativet Nuclei i det övre vänstra hörnet.
- I menyn väljer du protokollet Low Volume Nuclei Isolation och kontrollerar att störningshastigheten är inställd på snabb genom att klicka på Ändra. Ladda kassetten till instrumentet genom att öppna dörren och skjuta ut stage genom att lyfta den röda ratten.
- Sätt i patronen på den avsedda platsen, vrid patronlåset och skjut i stage tills den röda ratten klickar på plats. Stäng luckan och starta kärnextraktionskörningen på instrumentet genom att klicka på Nästa. Löpningen tar ca 7 min.
- När körningen är klar, ta bort patronen från instrumentet genom att lyfta den röda ratten och dra ut stage. Lägg omedelbart patronen på is.
- För alla vävnader utom hjärnan, fortsätt till steg 3.1. För hjärnprover, fortsätt direkt till steg 3.2.
3. Rensning av kärnor
- Rensning av sackarosgradient
OBS: För hjärnvävnad, hoppa över det här steget och gå direkt till steg 3.2. Alla saneringssteg utförs på is för att minimera RNA-nedbrytningen. Buffertar och rör samt centrifugerna måste förkylas. Alla omblandnings- och blandningssteg utförs endast genom noggrann pipettering, eftersom vortexing kan äventyra kärnornas kvalitet och integritet.- Stick försiktigt hål i den runda folien på dissociatorpatronen med en pipettspets.
OBS: Efter dissociation har den resulterande kärnsuspensionen en ungefärlig volym på 2 ml. För att underlätta sackarosgradientrengöring, dela upp kärnsuspensionen i två alikvoter på 900 μl, vilket resulterar i att en total volym på 1,8 ml kärnsuspension används under rengöringen. - Ta bort den första alikvoten på 900 μl av kärnsuspensionen från cylinderampullen och tillsätt den till en 500 μl SCS-alikvot som tidigare beretts i ett 2 ml rör. Blanda väl genom att pipettera tills blandningen är homogen.
- Ta bort 1400 μl kärnsuspension-SCS-blandningen och lägg den försiktigt på en ny 500 μl SCS-alikvot genom att hålla röret i en vinkel och tillsätta blandningen droppvis, vilket skapar en tydligt synlig fasseparation (se figur 1A).
- Stäng försiktigt röret och lägg tillbaka det på is utan att störa fasseparationen.
- Upprepa steg 3.1.2–3.1.4 med den andra 900 μl alikvoten suspension och en ny SCS-alikvot så att det finns två 2 ml rör per prov med en väl synlig fasseparation för gradientcentrifugering.
- Tillsätt försiktigt rören i en förkyld centrifug och centrifugera med 13 000 x g i 15 minuter vid 4 °C.
- Under tiden bereds den NSR som beskrivs i tabell 4 genom att tillsätta RNashämmaren till en alikvot NSR. Förbered 1 ml NSR per prov.
OBS: Vid denna tidpunkt kan de encelliga genuttrycksgelpärlorna avlägsnas från frysen på -80 °C, vilket gör att de kan komma i jämvikt med rumstemperatur (RT), och mallomkopplaren oligo kan återsuspenderas i låg TE-buffert. - Efter centrifugering, avlägsna supernatanten från båda rören utan att störa pelleten och återsuspendera försiktigt pelleten i 50 μL iskall NSR enligt tillverkarens rekommendation. Slå samman de två pelletsen från samma prov i ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 900 μl iskall NSR till en total volym av 1 ml. Blanda väl genom att pipettera.
- Centrifugera provet vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C med en rotorcentrifug med svängskopa.
OBS: Det rekommenderas starkt att använda en svängskopa för att minimera kärnförlusten, särskilt när kärnutbytet förväntas vara lågt eller när man börjar med små mängder vävnad. - Under tiden bereds 500 μl per prov av 1x PBS (utan Ca2+ och Mg2+) med 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) och 0,2 U/μL RNashämmare enligt beskrivningen i tabell 5.
- Ta försiktigt bort supernatanten utan att kassera pelleten och återsuspendera pelleten i 100 μL PBS-lösning enligt beredningen ovan (1x PBS + 0,04 % BSA + RNashämmare vid 0,2 E/μL).
OBS: För små vävnadsprover, kärnkoncentrationen kan vara låg, och därför rekommenderas det att återsuspendera pelleten i endast 50 μL PBS-lösning för att säkerställa tillräckligt höga koncentrationer för RNA-sekvensering med enstaka kärnor. - Gå direkt till steg 4.
- Stick försiktigt hål i den runda folien på dissociatorpatronen med en pipettspets.
- Rensning av kiseldioxidkolloidgradient
OBS: För hjärnvävnad är en kiseldioxidkolloidgradient lämpligare än en sackarosgradient för att avlägsna myelin och skräp från kärnsuspensionen. Alla saneringssteg utförs på is för att minimera RNA-nedbrytning. Buffertar och rör, liksom centrifugerna, måste förkylas. Alla omblandnings- och blandningssteg utförs endast genom noggrann pipettering, eftersom vortexing kan äventyra kärnornas kvalitet och integritet.- Stick försiktigt hål i den runda folien på dissociatorpatronen med en pipettspets.
- Ta bort kärnsuspensionen från patronen och tillsätt den till ett 5 ml rör.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C i en förkyld centrifug.
- Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten och återsuspendera pelleten i 1 ml iskall 18% kolloidlösning av kiseldioxid.
- Tillsätt ytterligare 2 ml 18 % kolloidlösning av kiseldioxid för att få en total volym på 3 ml och blanda väl genom pipettering.
- Centrifugera provet vid 700 × g i 5 minuter vid 4 °C i en svängskopa med bromsen urkopplad.
- Under tiden bereds den NSR som beskrivs i tabell 4 genom att tillsätta RNashämmaren till en alikvot NSR. Förbered 1 ml NSR per prov.
OBS: Vid denna tidpunkt kan de encelliga genuttrycksgelpärlorna avlägsnas från frysen -80 °C, vilket gör att den kan komma i jämvikt till RT och mallswitcholigo kan återsuspenderas i låg TE-buffert. - Ta försiktigt bort provet från centrifugen utan att störa myelinskiktet som flyter ovanpå.
- Ta först bort myelinskiktet från toppen och kassera; Ta sedan försiktigt bort hela supernatanten utan att störa pelleten.
OBS: Myelinskiktet kan enkelt avlägsnas genom att linda en steril luddfri servett runt en 1 ml pipettspets för att aspirera myelinskiktet tillsammans med 1-2 ml av supernatanten. - Återsuspendera pelleten i 1 ml iskall NSR enligt tillverkarens rekommendation.
- Centrifugera provet vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C i en centrifug med svängskopa.
OBS: Det rekommenderas starkt att använda en svängskopa för att minimera kärnförlusten, särskilt när kärnutbytet förväntas vara lågt eller när man börjar med små mängder vävnad. - Under tiden bereds 500 μl per prov av 1x PBS (utan Ca2+ och Mg2+) med 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) och 0,2 U/μL RNashämmare enligt beskrivningen i tabell 5.
- Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten och återsuspendera provet i 100 μl PBS-lösning enligt ovan (1x PBS + 0,04 % BSA + RNashämmare vid 0,2 E/μL).
OBS: För små vävnadsprover, kärnkoncentrationen kan vara låg, och därför rekommenderas det att återsuspendera pelleten i endast 50 μL PBS-lösning för att säkerställa tillräckligt höga koncentrationer för RNA-sekvensering med enstaka kärnor.
4. Räkning
- För varje prov som ska räknas, späd 10 μl kärnsuspension i 20 μl PBS-lösning för att erhålla en utspädning på 1:3.
- För räkning, tillsätt 25 μL propidiumjodid (PI) färgningslösning till en blandningsbrunn på den fluorescerande räknarplattan. Tillsätt 25 μl av suspensionen av de utspädda kärnorna och blanda väl genom pipettering. Överför det 50 μl färgade provet från blandningsbrunnen till laddningsbrunnen.
- Ladda räkneplattan på cellräknaren och starta räkningen.
OBS: Kärnantalet tas från den röda fluorescerande kanalen med en exponeringstid på 700 ms. Denna kanal optimerades för att få en exakt kärnräkning genom att jämföra med manuell räkning med en Neubauer Chamber och Trypan Blue-färgning under mikroskopet. Vid höga koncentrationer är kärnorna mycket nära varandra, vilket gör det svårt för programvaran att separera dem. I detta fall rekommenderas att provet räknas om i en lämplig spädning. Kärnornas integritet såväl som renheten kan bedömas från ljusfältsbilden eller under ett mikroskop. - Späd proverna med PBS (1x PBS + 0,04 % BSA + RNashämmare vid 0,2 U/μL) till önskad koncentration för RNA-sekvensering med enstaka kärnor.
OBS: Koncentrationer mellan 700-1 200 kärnor/μL anses vara optimala för RNA-sekvensering med enstaka kärnor. Lägre cellkoncentrationer, såsom 700 kärnor/μL, kan resultera i minskad bakgrundskontaminering från omgivande RNA.
5. Förberedelse av bibliotek
- Utför RNA-sekvensering med enstaka kärnor med encellsreagenser för genuttryck med hjälp av tillverkarens protokoll som siktar på en kärnåtervinning på 8000-10 000 kärnor per prov.
6. Sekvensering
- Sekvensera biblioteken med önskat sekvenseringsdjup med parad ände, dubbel indexering och följande sekvenseringsläsningar: Läs 1: 28 cykler, i7 Index: 10 cykler, i5 Index: 10 cykler och Läs 2: 90 cykler.
Representative Results
Prestandan och mångsidigheten hos detta protokoll demonstreras genom att utföra RNA-sekvensering med enstaka kärnor på färskfryst hjärnbarksvävnad från tre B6-möss, färskfryst tvärskuren njurvävnad från tre Wistar-råttor, arkiverad (11-årig) lever och mjältvävnad från tre mauritiska Cynomolgus-makaker. Alla djur var icke-perfunderade.
Som visas i figurerna 1B,C erhölls kärnor av god kvalitet som var fria från tecken på blebbning, skräp och klumpbildning. Den sackarosgradientbaserade filtreringen optimerades för att avlägsna majoriteten av skräpet genom att testa olika densiteter, centrifugeringshastigheter och tider, och bedöma kärnans renhet/integritet under ett mikroskop samt bedöma kärnornas storleksfördelning och utbyte (figur 1D). Detta gjorde det möjligt för oss att välja en sackarosgradientdensitet på 1,5 M och att använda en kort centrifugeringstid på 15 minuter. Därefter, för att ytterligare bedöma kvaliteten på kärnorna, förbehandlades data med hjälp av 10X Cell Ranger, och ytterligare nedströms dataanalys utfördes med hjälp av Besca23. Kärnor med >5 % mitokondrieinnehåll (eftersom dessa tenderar att vara skadade/stressade kärnor) filtrerades bort, och kärnor med 500-7 000 gener (för att minimera tomma droppar och multiplar) behölls. Vi tog bara med gener som fanns i minst 30 kärnor. Vi riktade in oss på 8 000 kärnor per hjärnbarksprov och 10 000 kärnor per njur-, lever- och mjältprov. Efter filtrering erhölls 10 644 kärnor av hög kvalitet från de tre hjärnproverna, 14 960 kärnor av hög kvalitet från de tre njurproverna, 18 795 kärnor av hög kvalitet från de tre leverproverna och 13 882 kärnor av hög kvalitet från de tre mjältproverna. Figur 2A,D,G,J visar fioldiagram som representerar fördelningen av UMI-antal, genantal och mitokondrieinnehåll i varje prov. Medianantalet för alla hjärnprover var 7 563 UMI/kärna och 3 208 gener/kärna. Medianantalet för alla njurprover var 3 841 UMI/kärna och 1 915 gener/kärna. Medianantalet för alla leverprover var 2 649 UMI/kärnor och 1 676 gener/kärnor. Medianantalet för alla mjältprover var 1 609 UMI/kärnor och 1 138 gener/kärnor. Vi genererade sedan kluster med hjälp av mycket variabla gener och annoterade dem med hjälp av kända markörgener 17,24,25,26. Som framgår av figur 2B,E,H,K kunde vi identifiera de förväntade celltyperna från varje vävnad. Som framgår av figur 2B,E,H,K bidrog dessutom alla djur till alla kluster, vilket tyder på att den tekniska variabilitet som protokollet införde totalt sett var låg. Dessutom var de cellulära proportionerna jämförbara i alla tre proverna per vävnadstyp, liksom UMI och genantalet (figur 2A,C,D,F,G,I,J,L). Ett anmärkningsvärt undantag är levern, där hepatocytpopulationerna bland de tre leverproverna skilde sig åt i proportioner och profil. Detta beror troligen på biologiska skillnader mellan djuren (kön, ålder, metabolisk status).
Figur 1: Bedömning av kärnkvalitet och optimering av sackarosgradient . (A) Den förväntade fasseparationen under sackarosgradientcentrifugering visas med en pil. B) Representativa fluorescerande bilder av propidiumjodidfärgade kärnor av råttnjure (överst) och cynomolgus mjälte (nederst) som erhållits med protokollet. (C) Representativa ljusfältsmikroskopibilder av kärnor isolerade från muslever (överst) och mushjärna (nederst), skalstapel 500 μm. Notera den regelbundna släta ytan på kärnor som indikerar god kärnkvalitet. (D) Optimering av sackarosgradient. Flera sackarosdensiteter, centrifugeringshastigheter och centrifugeringstider testades. Ljusfältsmikroskopibilder av kärnor, kärnstorleksfördelning och kärnutbyte visas för varje tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa data från snRNAseq på hjärnbarken hos möss, njure hos råtta (cortex och medulla) samt lever och mjälte hos cynomolgusmakak . (A) Fioldiagram som visar fördelningen av gener/kärna, UMI/kärna och procentuellt mitokondrieinnehåll per hjärnprov. (B) Vänster panel: UMAP-diagram som visar bidraget från varje prov till de kluster som identifierats i hjärnan. Höger panel: UMAP som visar identiteterna för klustren annoterade baserat på markörgener i hjärnvävnad. (C) Cellulära proportioner observerade i de 3 hjärnproverna. (D) Fioldiagram som visar fördelningen av gener/kärna, UMI/kärna och procentuellt mitokondrieinnehåll per njurprov. (E) Vänster panel: UMAP-diagram som visar varje provs bidrag till de kluster som identifierats i njuren. Höger panel: UMAP som visar identiteterna för klustren annoterade baserat på markörgener i njurvävnad. (F) Cellulära proportioner observerade i de 3 njurproverna. (G) Fioldiagram som visar fördelningen av gener/kärna, UMI/kärna och procentuellt mitokondrieinnehåll per leverprov. (H) Vänster panel: UMAP-diagram som visar bidraget från varje prov till de kluster som identifierats i levern. Höger panel: UMAP som visar identiteterna för klustren annoterade baserat på markörgener i levervävnad. (I) Cellulära proportioner observerade i de 3 leverproverna. (J) Fioldiagram som visar fördelningen av gener/kärna, UMI/kärna och procentuellt mitokondrieinnehåll per mjältprov. (K) Vänster panel: UMAP-diagram som visar varje provs bidrag till de kluster som identifierats i mjälten. Höger panel: UMAP som visar identiteterna för klustren annoterade baserat på markörgener i mjältvävnad. (L) Cellulära proportioner observerade i de 3 mjältproverna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komponenter | Beståndets koncentration | Volym per prov | Slutlig koncentration |
| Lösning för sackaroskudde | 2 M | 1500 μL | 1,5 M |
| Buffert för sackaros | - | 500 μL | - |
| Ditiotreitol (DTT) | 1 M | 2 μL | 1 mM |
| RNAse-hämmare | 40 U/μL | 10 μL | 0,2 U/μL |
Tabell 1: Beredning av 1,5 M sackaroslösning (SCS). Denna lösning används för sackarosgradientcentrifugering under rengöringen i steg 3.1 och bör beredas på nytt varje gång innan protokollet påbörjas. Håll alltid SCS på is under protokollet. Lösningarna som nämns i den här tabellen refereras till i materialtabellen.
| Komponenter | Beståndets koncentration | Volym per prov | Slutlig koncentration |
| Stamlösning av kiseldioxidkolloid | 90% | 600 μL | 18% |
| Reagens för lagring av kärnor (S2-genomik) | - | 2400 μL | - |
| RNAse-hämmare | 40 U/μL | 15 μL | 0,2 U/μL |
Tabell 2: Beredning av 18 % kolloidlösning av kiseldioxid. Denna lösning används för centrifugering av kiseldioxidkolloidgradient under rengöringen i steg 3.2 och bör beredas på nytt varje gång innan protokollet påbörjas. Förvara alltid 18 % kiseldioxidkolloidlösningen på is under protokollet.
| Vävnad | Provets vikt | Patron | Avkastning |
| Råttlever | 25 mg filmdragerade tabletter | Nuclei isoleringspatron | 65 000 kärnor per mg vävnad |
| Råttlever | 4 mg filmdragerade tabletter | Liten ingång Nuclei Isolation Cartridge | 32 000 kärnor per mg vävnad |
Tabell 3: Kärnutbyte från den isolerade patronen med låg inmatning jämfört med kärnisoleringspatronen efter sackarosgradientrengöring.
| Komponenter | Beståndets koncentration | Volym per prov | Slutlig koncentration |
| Reagens för lagring av kärnor | - | 1000 μL | - |
| RNAse-hämmare | 40 U/μL | 5 μL | 0,2 U/μL |
Tabell 4: Beredning av lagringsreagens för kärnor (NSR). Denna lösning används under Nuclei Isolation i steg 3-5 samt under rengöringen i steg 3.1.8. Den kan förvaras vid 4 °C i upp till 4 månader. Bered en ny alikvot med RNashämmare under centrifugeringssteget i rengöringssteg 6. Lösningarna som nämns i den här tabellen refereras till i materialtabellen.
| 1x PBS + 0,04 % BSA-stamlösning | |||
| Komponenter | Beståndets koncentration | Volym för lager | Slutlig koncentration |
| PBS (ingen Ca 2+, ingen Mg2+) | 1x | 30 ml | - |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 30% | 40 μL | 0.04% |
| 1x PBS + 0,04 % BSA + 0,2 U/μL RNAse-hämmare | |||
| Komponenter | Beståndets koncentration | Volym per prov | Slutlig koncentration |
| 1x PBS + 0,04 % BSA Lagerlösning | - | 500 μL | - |
| RNAse-hämmare | 40 U/μL | 2,5 μL | 0,2 U/μL |
Tabell 5: Beredning av PBS + 0,04 % BSA. Denna lösning används i slutet av rengöringen i steg 3.1.10 och efter räkning för att späda cellkärnans suspension till önskad koncentration för 10X RNA-sekvensering med en enda kärna (räknande steg 4.4). Stamlösningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad. Bered en ny alikvot med RNashämmare under centrifugeringssteget i rengöringssteg 6.
Discussion
Vi har utvecklat ett mångsidigt och delvis automatiserat protokoll för att erhålla högkvalitativa enstaka kärnor från frysta däggdjursvävnader och demonstrerat protokollet på mushjärna, råttnjure och cynomolgus lever- och mjältvävnad.
När vi jämför prestandan för detta protokoll med andra publicerade protokoll för sekvensering av RNA med en kärna i hjärna, njure, mjälte och levervävnad 6,7,20,24,25,26, observerar vi att vi kan detektera ett liknande antal gener och UMI-antal per kärna och kan återställa de förväntade celltyperna. Jämfört med befintliga metoder finns det flera fördelar med detta protokoll. För det första automatiserar protokollet i denna studie vävnadshomogenisering och isolering av enskilda kärnor. Detta uppnås med hjälp av en robotiserad vävnadsstörare21. I de flesta protokoll homogeniseras vävnaden med en Dounce homogenisator för att frigöra enstaka kärnor 3,20. Vi har dock märkt att detta manuella steg kan leda till experimentell variabilitet i kärnutbyte och integritet beroende på mängden kraft som utövas under homogeniseringen, vilket äventyrar experimentens reproducerbarhet. Här, genom att använda en automatiserad vävnadskvarn med fasta inställningar, erhölls god kärnkvalitet och utbyte med större konsistens över experimenten. Automatisering av detta steg minskar dessutom den praktiska tiden för protokollet (vävnadsstörningssteget tar cirka 7 minuter), vilket gör att användaren kan förbereda sig för de efterföljande stegen. För det andra är protokollet som beskrivs i denna studie mångsidigt, dvs det är kompatibelt med olika vävnader från olika arter. Detta gör det möjligt för oss att undvika långdragen protokolloptimering, t.ex. för att identifiera homogeniseringsbuffertar/tvättmedel för olika vävnader 2,5,6. För det tredje är detta protokoll inte beroende av tillgång till en flödessorterare för att få rena kärnor, vilket gör det mer tillgängligt för laboratorier som inte har den utrustning/expertis som krävs för flödessortering. Istället optimerade vi den sackarosgradientbaserade filtreringen för att ta bort det mesta av skräpet. Särskilt för hjärnvävnad rekommenderas dock att man använder en kiseldioxidkolloidgradient i stället för en sackarosgradient för effektivare myelinborttagning. Vi har också funnit att användningen av en svängskopa i slutet av sackaros/kiseldioxid kolloid gradient centrifugering minimerar kärnförlusten. Därför rekommenderas användningen av en sådan rotor starkt. För det fjärde, efter att ha testat flera metoder för att räkna kärnor (manuell räkning under mikroskopet, användning av flera automatiserade räknare), rekommenderas användning av en automatiserad fluorescerande cellräknare22. Användningen av ett DNA-interkalerande färgämne, såsom propidiumjodid, ökar noggrannheten i kärnräkningen. För det femte tar detta protokoll cirka 75 minuter från start till laddning av mikrofluidikchipet. Detta hjälper till att säkerställa att kärnintegriteten förblir hög vid bearbetning av flera prover. Slutligen har vi funnit att protokollet också är kompatibelt med OCT-inbäddad vävnad (optimal skärtemperaturförening). Om du använder sådant material kan vävnaden avlägsnas från OCT-blocket med hjälp av en skalpell före homogenisering.
En vanlig utmaning i RNA-sekvenseringsdatauppsättningar med enskilda kärnor är närvaron av omgivande RNA, som kan vara icke-nukleärt (t.ex. mitokondriellt) såväl som nukleärthärlett 27,28. I vårt protokoll är mitokondrie-RNA (en proxy för icke-nukleärt omgivande RNA) lågt även före filtrering (0,1-1,6 % för de vävnader som visas). I likhet med andra protokoll och datauppsättningar förekommer dock fortfarande omgivande RNA-kontaminering från starkt uttryckta gener i kärnorna hos rikliga celltyper (såsom hepatocyter i levern, neuroner i hjärnan, etc.)27. Det finns flera bioinformatiska verktyg, såsom CellBender, SoupX, etc., som kan ta bort sådan omgivande RNA-kontaminering före kärnannotering 29,30,31. En annan begränsning med detta protokoll är att även om vävnadsstörnings- och kärnisoleringsstegen är automatiserade, är genomströmningen av detta steg fortfarande begränsande eftersom endast ett prov kan bearbetas åt gången. Men eftersom detta steg bara tar cirka 7 minuter per vävnadsbit kan flera prover fortfarande bearbetas i en sats. Vi bearbetar vanligtvis fyra prover per batch men har gjort upp till sex prover per batch med bra resultat. De senaste förbättringarna av robotdissociatorn för att möjliggöra parallell bearbetning av två prover samtidigt kommer att möjliggöra bearbetning av 8-12 prover per sats, vilket är kompatibelt med genomströmningen av det mikrofluidiska chip som används för inkapsling av enstaka kärnor.
Även om vi inte har använt kärnorna som isolerats av detta protokoll för andra nedströmsapplikationer som ATAC-seq eller snRNAseq med andra plattformar, baserat på kvaliteten på data som erhållits med de genuttrycksreagenser som används här, anser vi att vårt protokoll bör vara kompatibelt med ytterligare nedströmsapplikationer. Framtida arbete kommer dock att innebära att detta protokoll testas med andra nedströmsapplikationer, såsom ATAC-seq.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett snabbt, enkelt och delvis automatiserat cellkärnisoleringsprotokoll för nedströms RNA-sekvensering med en kärna som har visat sig vara kompatibel med olika typer av frysta däggdjursvävnader.
Disclosures
Samtliga författare är/var anställda av F. Hoffmann-La Roche under studiens genomförande.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble och Matthias Selhausen för att ha tillhandahållit de djurvävnader som analyserades i detta manuskript. Vi vill också tacka Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki och Martin Ebeling för deras bioinformatikstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
| 1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
| 30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
| 400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
| Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
| DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
| DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
| Dry ice | - | - | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
| Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
| Heatblock | |||
| High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Mini Centrifuge | - | - | |
| NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
| Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
| Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
| Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
| Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
| Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
| Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
| RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
| Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
| Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
| Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Singulator 100 System | S2 Genomics | - | Commercially available robotic tissue dissociator |
| Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
| Sterile tweezers | - | - | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
| ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
| Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | - |
References
- Burja, B., et al. An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688 (2022).
- Kimbley, L. M., et al. Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue. Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).
- Maitra, M., et al. Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications. Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Current Protocols. 1 (5), e132 (2021).
- Rousselle, T. V., et al. An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq. Scientific Reports. 12, 9851 (2022).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901 (2021).
- Alvarez, M., et al. Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing. Bio-Protocol. 13 (3), e4601 (2023).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Joshi, N., Misharin, A. Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.zu8f6zw (2019).
- Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. 'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.3fkgjkw (2020).
- Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator™ 100. Protocols.io. , https://www.protocols.io/view/nuclei-extraction-for-single-cell-rnaseq-from-froz-q26g74xzqgwz/v1 (2022).
- Matson, K. J. E., et al. Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413 (2018).
- Mendelev, N., et al. Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue. STAR Protocols. 3 (2), 101446 (2022).
- Soule, T. G., et al. A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle. Life Science Alliance. 6 (5), e202201806 (2023).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).
- Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes & Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, 6031 (2017).
- Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542 (2020).
- Jovanovich, S., et al. Automated processing of solid tissues into single cells or nuclei for genomics and cell biology applications with the Singulator™ 100 and 200 systems. , S2 Genomics, Livermore, CA. https://s2genomics.com/poster-download-automated-processing-of-solid-tissues-into-single-cells-or-nuclei-with-the-singulator-100-system-scrna-seq-and-atac-seq-data-on-human-and-mouse-tissues-agbt-2022 (2022).
- Bell, J., et al. Characterization of a novel high-throughput, high-speed and high-precision plate-based image cytometric cell counting method. Cell & Gene Therapy Insights. 7 (4), 427-447 (2021).
- Madler, S. C., et al. Besca, a single-cell transcriptomics analysis toolkit to accelerate translational research. NAR Genomics and Bioinformatics. 3 (4), lqab102 (2021).
- Wu, H., et al. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metabolism. 34 (7), 1064-1078 (2022).
- Han, L., et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis. Nature. 604 (7907), 723-731 (2022).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), 1 (2019).
- Caglayan, E., Liu, Y., Konopka, G. Neuronal ambient RNA contamination causes misinterpreted and masked cell types in brain single-nuclei datasets. Neuron. 110 (24), 4043-4056 (2022).
- Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746 (2019).
- Fleming, S. J., et al. Unsupervised removal of systematic background noise from droplet-based single-cell experiments using CellBender. bioRxiv. , (2022).
- Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biology. 21 (1), 57 (2020).
- Young, M. D., Behjati, S. SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data. Gigascience. 9 (12), giaa151 (2020).
