Summary
이 연구는 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 고품질 핵을 분리하는 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
단일 세포 및 단일 핵 RNA 염기서열 분석은 풍부한 전사체 정보를 제공하기 때문에 일반적인 실험실 응용 분야가 되었습니다. 특히 단핵 RNA 염기서열분석은 해리하기 어려운 조직에서 유전자 발현을 조사하는 데 유용합니다. 또한 이 접근 방식은 냉동(보관) 자료와도 호환됩니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 기기 및 시약을 사용하여 부분적으로 자동화된 방식으로 다운스트림 단핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동된 포유류 조직에서 고품질 단일 핵을 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 특히, 로봇 해리기는 조직 균질화를 자동화하고 표준화하는 데 사용되며, 최적화된 화학적 구배를 사용하여 핵을 필터링합니다. 마지막으로, 자동 형광 세포 계수기를 사용하여 핵을 정확하게 자동 계수합니다. 이 프로토콜의 성능은 쥐의 뇌, 쥐의 신장, 시노몰구스의 간 및 비장 조직에서 입증되었습니다. 이 프로토콜은 간단하고 빠르며 광범위한 최적화 없이 다양한 포유류 조직에 쉽게 적응할 수 있으며 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위한 우수한 품질의 핵을 제공합니다.
Introduction
단일 세포(sc) 및 단일 핵(sn) RNA 염기서열 분석은 벌크 RNA 염기서열 분석에 비해 유전자 발현의 분해능이 높기 때문에 분자 및 세포 생물학에서 일반적으로 사용되는 프로토콜이 되었습니다. 그러나 고형 조직에서 우수한 품질의 단일 세포 및 단일 핵 제제를 분리하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있으며 sc/sn-RNAseq 실험에서 속도를 제한하는 단계인 경우가 많습니다. 실제로, 세포/핵 현탁액 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15를 얻기 위해 다양한 화학적 및 기계적 절차를 사용하는 프로토콜이 과다하게 개발되었습니다 . 또한 파편/덩어리 등에서 이러한 제제를 청소하는 전략은 흐름 분류에서 여과 및 세척에 이르기까지 다양합니다. 이러한 프로토콜은 종종 수동적이거나(사용자 관련 변동성으로 이어짐), 시간이 많이 걸리거나(세포/핵 생존력 감소로 이어짐) 세포/핵 분류를 위해 유세포 분석기에 액세스해야 할 수 있습니다. 이 연구는 다운스트림 RNA 염기서열 분석 응용 분야를 위해 냉동 포유류 조직에서 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 단일 핵 분리 프로토콜을 개발하는 데 중점을 두었습니다. 우리는 특히 세포 분리가 아닌 핵 분리에 초점을 맞췄는데, 이는 냉동 조직 사용과 호환되어 샘플 수집/처리를 보다 실용적으로 만들고 특히 시간 경과 실험에서 샘플의 편향되지 않은 배치를 가능하게 하기 때문입니다. 또한, 핵 전사체가 세포 전사체를 완전히 반영하지는 않지만, 세포 유형의 비율이 6,16,17,18,19로 변할 수 있음에도 불구하고 단일 핵 RNA 염기서열 분석 데이터가 세포 유형 식별을 위한 단일 세포 RNA 염기서열 분석 데이터와 유사하다는 것이 여러 연구에서 밝혀졌습니다.
핵 분리는 1) 핵을 방출하기 위한 조직의 기계적 또는 화학적 파괴, 2) 파편 및 덩어리 청소, 3) 다운스트림 응용 준비를 위한 정확한 핵 계수의 여러 단계로 구성됩니다. 다수의 프로토콜에서, 단계 1은 조직 3,20을 파괴하기 위해 Dounce 균질화기의 사용을 자주 포함한다. 대안으로, 화학적 방법을 사용할 수 있지만, 이들은 종종 다른 조직에 최적화되어야 한다 2,5,6. 우리는 수동 조직 파괴 절차가 작업자와 관련된 변동성이 발생하기 쉬워 핵의 품질과 수율이 가변적이라는 것을 경험했습니다. 기술적 변동성을 최소화하고 조직 전반에 걸쳐 작동하는 보다 일관되고 재현 가능한 프로토콜을 갖기 위해, 상업적으로 이용 가능한 로봇 조직 해리기를 사용하는 프로토콜이 개발되었다21. 2단계의 경우, 완충액 교환이 일반적으로 핵을 세척하는 가장 간단한 방법이지만, 파편을 보다 철저하게 제거하기 위해 비교적 짧은 자당 그래디언트 원심분리 단계를 채택했습니다. 특히 뇌 조직의 경우, 보다 효과적인 미엘린 제거를 위해 자당 구배 대신 실리카 콜로이드 구배를 사용합니다. 마지막으로, 계수를 위해 혈구계를 사용하는 것은 핵을 계수하고 육안으로 검사하기 위한 황금 표준입니다. 우리의 프로토콜에서, 이 단계는 상업적으로 입수가능한 자동 형광 셀 카운터(22)를 사용하여 신뢰성 있게 자동화될 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 포유류 종(쥐, 생쥐 및 비인간 영장류)의 뇌, 신장, 비장 및 간을 포함한 여러 냉동 포유류 조직과 테스트되었으며 호환되며 액적 기반 상용 플랫폼을 사용하여 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위한 우수한 품질의 핵을 제공합니다. 이 프로토콜은 조직 준비부터 단일 핵 RNA 염기서열분석 워크플로우 시작까지 약 75분이 소요됩니다.
Protocol
모든 동물 연구는 동물 보호에 관한 스위스 연방 규정을 엄격히 준수하거나 독일 동물 복지법에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 바젤-슈타트 주 수의학 당국의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 조직 및 시약/기구 준비
- 세척 및 기기 준비
- 70% 에탄올 및 RNase 오염 제거 용액으로 탁상과 핀셋을 청소합니다. 원심분리기를 4°C로 사전 냉각합니다.
- 핵 분리 카트리지를 냉장고의 4°C에서 최소 30분 동안 사전 냉각합니다.
- 로봇 해리기를 시작하고 화면 오른쪽 상단의 슬라이더를 냉각으로 설정하고 슬라이더가 주황색으로 나타나도록 클릭하여 냉각을 시작하여 냉각을 켭니다. 부착된 NSR(Nuclei Storage Reagent) 병과 NIB(Nuclei Isolation Buffer) 병에 충분한 액체가 남아 있고 적절하게 냉각되었는지 확인하십시오.
- 드라이 아이스로 채워진 폴리스티렌 폼 상자와 드라이 아이스 위에 미리 식힌 페트리 접시와 메스 블레이드를 준비합니다.
- 완충액 준비
- 표 1.5에 나타낸 바와 같이 1 M 슈크로스 쿠션 용액(SCS)을 준비한다. SCS를 2mL DNase/RNase 튜브의 500μL 부분 표본으로 분배하여 샘플당 4개의 500μL SCS 부분 표본을 얻습니다. 더 이상 사용할 때까지 부분 표본을 얼음 위에 보관하십시오.
- 뇌조직을 가공하는 경우, NSR에 실리카 콜로이드 원액을 희석하고 RNase 억제제를 첨가하여 표 2와 같이 18% 실리카 콜로이드 용액을 제조한다. 샘플당 3mL의 18% 실리카 콜로이드 용액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
2. 조직 균질화 및 핵 분리
- -80 °C 냉동실에서 샘플을 꺼내 즉시 드라이아이스 위에 놓습니다.
- 예식된 메스를 사용하여 드라이아이스에 미리 식힌 페트리 접시 또는 금속판에 있는 샘플을 15-50mg 조각으로 자릅니다(아직 올바른 크기가 아닌 경우). 샘플이 여전히 관심 기관 구조를 대표할 수 있도록 샘플을 올바른 방향으로 절단해야 합니다.
참고: 이 프로토콜을 사용하면 15-50mg이 핵 추출을 위한 최적의 샘플 크기입니다. 세척 후 양호한 수율을 얻으려면 최소 25mg의 샘플 크기를 권장합니다. 더 작은 샘플의 경우, 로봇 해리기로 작은 입력을 처리하는 데 최적화된 특수 카트리지를 사용할 수 있습니다. 작은 입력 핵 분리 카트리지를 사용하여 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열분석을 위한 충분한 수율로 무게가 4mg에 불과한 조직 샘플을 해리했습니다. 쥐 간 조직으로부터의 낮은 투입 카트리지를 사용한 핵 수율의 예가 표 3에 나타나 있다. - 냉장고에서 핵 분리 카트리지를 꺼내 포장을 풀고 그라인더를 꺼내 RNase inhibitor(40U/μL) 15μL를 카트리지 바닥에 피펫팅합니다.
알림: 핵 추출 중에 로봇 해리기는 NIB 및 NSR을 카트리지에 총 3mL의 부피로 추가합니다(저용량 핵 추출 프로토콜 사용). 추출 전에 카트리지에 15μL의 RNase 억제제(40U/μL)를 첨가하면 현탁액은 원하는 RNAse 억제제 농도가 0.2U/μL가 됩니다. - 티슈 s를 놓으십시오.amp핀셋을 사용하여 카트리지 바닥에 놓습니다. 최적의 파괴 효율을 위해 샘플을 카트리지 중앙에 정확히 배치하지 마십시오.
- 계측기에서 Run a Protocol(프로토콜 실행 )을 선택하고 왼쪽 상단 모서리에 있는 Nuclei 옵션을 클릭합니다.
- 메뉴에서 Low Volume Nuclei Isolation 프로토콜을 선택하고 Modify(수정)를 클릭하여 중단 속도가 고속으로 설정되어 있는지 확인합니다. 도어를 열고 s를 밀어서 카트리지를 악기에 로드합니다.tage 빨간색 손잡이를 들어 올립니다.
- 카트리지를 지정된 위치에 삽입하고 카트리지 잠금 장치를 돌린 다음 s에서 밉니다.tage 빨간색 손잡이가 딸깍 소리를 내며 제자리에 고정될 때까지. 도어를 닫고 Next(다음)를 클릭하여 기기에서 핵 추출 실행을 시작합니다. 달리기는 약 7분 동안 지속됩니다.
- 실행이 끝나면 빨간색 손잡이를 들어 올려 악기에서 카트리지를 제거합니다.tage. 즉시 카트리지를 얼음 위에 놓으십시오.
- 뇌를 제외한 모든 조직에 대해 3.1단계로 진행합니다. 뇌 샘플의 경우 3.2단계로 바로 진행합니다.
3. 핵 세척
- 자당 그래디언트 세척
참고: 뇌 조직의 경우 이 단계를 건너뛰고 3.2단계로 바로 이동합니다. RNA 분해를 최소화하기 위해 모든 세척 단계는 얼음 위에서 수행됩니다. 버퍼와 튜브, 원심분리기는 사전 냉각되어야 합니다. 모든 재현탁 및 혼합 단계는 볼텍싱이 핵의 품질과 무결성을 손상시킬 수 있으므로 신중한 피펫팅으로만 수행됩니다.- 피펫 팁으로 분리기 카트리지의 둥근 호일을 조심스럽게 뚫습니다.
참고: 해리 후 생성된 핵 현탁액의 부피는 대략 2mL입니다. 슈크로스 그래디언트 클린업을 용이하게 하기 위해 핵 현탁액을 2개의 900μL 부분 표본으로 나누어 클린업 중에 총 1.8mL의 핵 현탁액이 사용됩니다. - 카트리지에서 핵 현탁액의 처음 900μL 부분 표본을 제거하고 2mL 튜브에서 미리 준비한 500μL SCS 부분 표본에 추가합니다. 혼합물이 균질해질 때까지 피펫팅하여 잘 섞습니다.
- 1400μL의 핵 현탁액(SCS 혼합물)을 제거하고 튜브를 비스듬히 잡고 혼합물을 적가하여 명확하게 볼 수 있는 상 분리를 만들어 새로운 500μL SCS 부분 표본에 조심스럽게 층을 그립니다( 그림 1A 참조).
- 튜브를 조심스럽게 닫고 상 분리를 방해하지 않고 얼음 위에 다시 놓습니다.
- 두 번째 900μL 현탁액과 새로운 SCS 부분 표본으로 3.1.2-3.1.4단계를 반복하여 그래디언트 원심분리를 위한 상 분리가 명확하게 보이는 샘플당 2개의 2mL 튜브를 갖습니다.
- 튜브를 사전 냉각된 원심분리기에 조심스럽게 넣고 4°C에서 15분 동안 13,000 x g 으로 회전합니다.
- 그 동안, NSR의 분취액에 RNase 억제제를 첨가하여 표 4에 기재된 NSR을 준비한다. 샘플당 1mL의 NSR을 준비합니다.
참고: 이 시점에서 단일 세포 유전자 발현 시약 겔 비드를 -80°C 냉동고에서 제거하여 실온(RT)과 평형을 이룰 수 있으며 템플릿 스위치 올리고는 낮은 TE 버퍼에 재현탁될 수 있습니다. - 원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 두 튜브에서 상층액을 제거하고 제조업체의 권장 사항에 따라 펠릿을 50μL의 얼음처럼 차가운 NSR에 조심스럽게 재현탁합니다. 동일한 샘플의 펠릿 2개를 새 1.5mL 튜브에 모으고 얼음처럼 차가운 NSR 900μL를 총 부피 1mL에 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞습니다.
- 스윙 버켓 로터 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 샘플을 원심분리합니다.
알림: 특히 핵 수율이 낮을 것으로 예상되거나 소량의 조직으로 시작할 때 핵 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. - 그 동안 표 5에 설명된 대로 0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.2U/μL RNase 억제제와 함께 1x PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)의 샘플당 500μL를 준비합니다.
- 펠릿을 버리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 위에서 준비한 대로 100μL의 PBS 용액(0.2U/μL에서 1x PBS + 0.04% BSA + RNase 억제제)에 펠릿을 재현탁시킵니다.
참고: 작은 조직 샘플의 경우 핵 농도가 낮을 수 있으므로 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 충분히 높은 농도를 보장하기 위해 펠릿을 50μL의 PBS 용액에만 재현탁시키는 것이 좋습니다. - 4단계로 바로 진행합니다.
- 피펫 팁으로 분리기 카트리지의 둥근 호일을 조심스럽게 뚫습니다.
- 실리카 콜로이드 그래디언트 클린업
참고: 뇌 조직의 경우, 실리카 콜로이드 그래디언트는 핵 현탁액에서 미엘린과 파편을 제거하는 데 자당 그래디언트보다 더 적합합니다. 모든 세척 단계는 RNA 분해를 최소화하기 위해 얼음 위에서 수행됩니다. 버퍼와 튜브, 원심분리기는 사전 냉각되어야 합니다. 모든 재현탁 및 혼합 단계는 볼텍싱이 핵의 품질과 무결성을 손상시킬 수 있으므로 신중한 피펫팅으로만 수행됩니다.- 피펫 팁으로 분리기 카트리지의 둥근 호일을 조심스럽게 뚫습니다.
- 카트리지에서 핵 현탁액을 제거하고 5mL 튜브에 추가합니다.
- 사전 냉각된 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 500 x g 의 원심분리기.
- 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 얼음처럼 차가운 18% 실리카 콜로이드 용액 1mL에 재현탁시킵니다.
- 18% 실리카 콜로이드 용액 2mL를 추가하여 총 부피가 3mL가 되도록 하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.
- 브레이크를 끈 상태에서 스윙 버켓 로터에서 4°C에서 5분 동안 700 x g 의 샘플을 원심분리합니다.
- 그 동안, NSR의 분취액에 RNase 억제제를 첨가하여 표 4 에 기재된 NSR을 준비한다. 샘플당 1mL의 NSR을 준비합니다.
참고: 이 시점에서 단일 세포 유전자 발현 시약 겔 비드를 -80°C 냉동고에서 제거하여 RT와 평형을 이루고 템플릿 스위치 올리고를 낮은 TE 버퍼에 재현탁시킬 수 있습니다. - 위에 떠 있는 미엘린층을 방해하지 않고 원심분리기에서 샘플을 조심스럽게 제거합니다.
- 먼저 상단에서 미엘린 층을 제거하고 버립니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 전체 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
참고: 미엘린층은 1mL 피펫 팁에 멸균 보푸라기가 없는 물티슈를 감싸 1-2mL의 상층액과 함께 미엘린층을 흡인하여 쉽게 제거할 수 있습니다. - 제조업체의 권장 사항에 따라 펠릿을 얼음처럼 차가운 NSR 1mL에 재현탁시킵니다.
- 스윙 버켓 로터가 있는 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 샘플을 원심분리합니다.
알림: 특히 핵 수율이 낮을 것으로 예상되거나 소량의 조직으로 시작할 때 핵 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. - 그 동안 표 5에 설명된 대로 0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.2U/μL RNase 억제제와 함께 1x PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)의 샘플당 500μL를 준비합니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 위에서 준비한 대로 100μL의 PBS 용액(0.2U/μL에서 1x PBS + 0.04% BSA + RNase 억제제)에 샘플을 재현탁시킵니다.
참고: 작은 조직 샘플의 경우 핵 농도가 낮을 수 있으므로 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 충분히 높은 농도를 보장하기 위해 펠릿을 50μL의 PBS 용액에만 재현탁시키는 것이 좋습니다.
4. 카운팅
- 계수할 각 샘플에 대해 10μL의 핵 현탁액을 20μL의 PBS 용액에 희석하여 1:3 희석을 얻습니다.
- 계수를 위해 25μL의 요오드화 프로피듐(PI) 염색 용액을 형광 카운터 계수판의 혼합 웰에 추가합니다. 희석된 핵 현탁액 25μL를 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 50μL 염색된 샘플을 혼합 웰에서 로딩 웰로 옮깁니다.
- 셀 카운터에 계수 플레이트를 놓고 계수를 시작합니다.
알림: 핵 수는 700ms의 노출 시간으로 적색 형광 채널에서 가져옵니다. 이 채널은 현미경으로 Neubauer Chamber 및 Trypan Blue 염색을 사용한 수동 계수와 교차 비교하여 정확한 핵 계수를 얻을 수 있도록 최적화되었습니다. 고농도에서는 핵이 서로 매우 가깝기 때문에 소프트웨어가 핵을 분리하기가 어렵습니다. 이 경우 적절한 희석액으로 샘플을 계수하는 것이 좋습니다. 핵의 무결성과 청결도는 명시야 이미지 또는 현미경으로 평가할 수 있습니다. - PBS(1x PBS + 0.04% BSA + RNase inhibitor at 0.2 U/μL)로 샘플을 단일 핵 RNA 염기서열분석을 위해 원하는 농도로 희석합니다.
참고: 700-1,200 nuclei/μL 사이의 농도는 단일 핵 RNA 염기서열분석에 최적인 것으로 간주됩니다. 700 nuclei/μL와 같은 낮은 세포 농도는 주변 RNA의 배경 오염을 감소시킬 수 있습니다.
5. 도서관 준비
- 샘플당 8000-10,000개의 핵 회수를 목표로 하는 제조업체의 프로토콜을 사용하여 단일 세포 유전자 발현 시약으로 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 수행합니다.
6. 시퀀싱
- paired-end, dual indexing을 사용하여 원하는 염기서열분석 깊이로 라이브러리를 시퀀싱하고 Read 1: 28 cycles, i7 Index: 10 cycles, i5 Index: 10 cycles 및 Read 2: 90 cycles를 읽습니다.
Representative Results
이 프로토콜의 성능과 다양성은 B6 마우스 3마리의 신선 냉동 뇌 후두엽 피질 조직, Wistar 쥐 3마리의 신선 냉동 횡단 절단 신장 조직, 모리셔스 시노몰구스 원숭이 3마리의 보관(11세) 간 및 비장 조직에서 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 수행함으로써 입증되었습니다. 모든 동물은 관류되지 않았다.
그림 1B,C에서 볼 수 있듯이 출혈, 파편 및 응집의 징후가 없는 양질의 핵이 얻어졌습니다. 자당 그래디언트 기반 여과는 다양한 밀도, 스핀 속도 및 시간을 테스트하고 현미경으로 핵 순도/무결성을 평가하고 핵 크기 분포 및 수율을 평가하여 대부분의 파편을 제거하도록 최적화되었습니다(그림 1D). 이를 통해 1.5M의 자당 기울기 밀도를 선택하고 15분의 짧은 회전 시간을 사용할 수 있었습니다. 다음으로, 핵의 품질을 추가로 평가하기 위해 10X Cell Ranger를 사용하여 데이터를 전처리하고, Besca23을 사용하여 추가 다운스트림 데이터 분석을 수행했습니다. >5%의 미토콘드리아 함량을 가진 핵(손상되거나 스트레스를 받는 핵이 되기 쉬움)은 걸러냈고, 500-7,000개의 유전자를 가진 핵(빈 방울과 다중항을 최소화하기 위해)은 유지되었습니다. 우리는 적어도 30개의 핵에 존재하는 유전자들만 포함시켰다. 뇌 피질 샘플당 8,000개의 핵과 신장, 간, 비장 샘플당 10,000개의 핵을 목표로 삼았습니다. 여과 후, 3개의 뇌 샘플에서 10,644개의 고품질 핵, 3개의 신장 샘플에서 14,960개의 고품질 핵, 3개의 간 샘플에서 18,795개의 고품질 핵, 3개의 비장 샘플에서 13,882개의 고품질 핵을 얻었습니다. 그림 2A,D,G,J는 각 샘플의 UMI 수, 유전자 수 및 미토콘드리아 함량의 분포를 나타내는 바이올린 플롯을 보여줍니다. 모든 뇌 샘플의 평균 개수는 7,563개의 UMI/핵과 3,208개의 유전자/핵이었다. 모든 신장 샘플의 개수 중앙값은 UMI/핵 3,841개, 유전자/핵 1,915개였다. 모든 간 샘플에 대한 개수 중앙값은 2,649개의 UMI/핵 및 1,676개의 유전자/핵이었습니다. 모든 비장 샘플에 대한 개수 중앙값은 1,609개의 UMI/핵 및 1,138개의 유전자/핵이었습니다. 그런 다음 매우 가변적인 유전자를 사용하여 클러스터를 생성하고 알려진 마커 유전자 17,24,25,26을 사용하여 주석을 달았습니다. 그림 2B,E,H,K에서 볼 수 있듯이 각 조직에서 예상되는 세포 유형을 식별할 수 있었습니다. 또한, 그림 2B,E,H,K에서 볼 수 있듯이 모든 동물이 모든 클러스터에 기여했으며, 이는 프로토콜에 의해 도입된 전반적인 낮은 기술적 변동성을 나타냅니다. 또한, 세포 비율은 UMI 및 유전자 수와 마찬가지로 조직 유형당 세 가지 샘플 모두에서 유사했습니다(그림 2A,C,D,F,G,I,J,L). 주목할 만한 예외는 간인데, 3개의 간 샘플 중 간세포 집단은 비율과 프로필이 달랐습니다. 이것은 동물 간의 생물학적 차이(성별, 나이, 신진대사 상태) 때문일 가능성이 큽니다.
그림 1: 핵 품질 평가 및 자당 그래디언트 최적화. (A) 슈크로스 그래디언트 원심분리 동안 예상되는 상 분리는 화살표로 표시됩니다. (B) 프로토콜로 얻은 프로피듐 요오드화물로 염색된 쥐의 신장(위) 및 시노몰구스 비장(아래) 핵의 대표적인 형광 이미지. (C) 생쥐 간(위)과 생쥐 뇌(아래)에서 분리된 핵의 대표적인 명시야 현미경 이미지, 눈금 막대 500μm. 핵의 규칙적이고 매끄러운 표면은 좋은 핵 품질을 나타냅니다. (D) 자당 그래디언트 최적화. 몇 가지 자당 밀도, 스핀 속도 및 스핀 시간을 테스트했습니다. 핵, 핵 크기 분포 및 핵 수율의 명시야 현미경 이미지가 각 조건에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 쥐의 뇌 후두엽 피질, 쥐의 신장(피질 및 수질), 시노몰구스 마카크 간 및 비장에 대한 snRNAseq의 대표 데이터. (A) 유전자/핵, UMI/핵 및 뇌 샘플당 미토콘드리아 함량 비율의 분포를 보여주는 바이올린 플롯. (B) 왼쪽 패널: 뇌에서 식별된 클러스터에 대한 각 샘플의 기여도를 보여주는 UMAP 플롯. 오른쪽 패널: 뇌 조직의 마커 유전자를 기반으로 주석이 달린 클러스터의 ID를 보여주는 UMAP. (C) 3개의 뇌 샘플에서 관찰된 세포 비율. (D) 유전자/핵, UMI/핵 및 신장 샘플당 미토콘드리아 함량 비율의 분포를 보여주는 바이올린 플롯. (E) 왼쪽 패널: 신장에서 식별된 클러스터에 대한 각 샘플의 기여도를 보여주는 UMAP 플롯. 오른쪽 패널: 신장 조직의 마커 유전자를 기반으로 주석이 달린 클러스터의 ID를 보여주는 UMAP. (F) 3개의 신장 샘플에서 관찰된 세포 비율. (G) 간 샘플당 유전자/핵, UMI/핵 및 미토콘드리아 함량 비율의 분포를 보여주는 바이올린 플롯. (H) 왼쪽 패널: 간에서 식별된 클러스터에 대한 각 샘플의 기여도를 보여주는 UMAP 플롯. 오른쪽 패널: 간 조직의 마커 유전자를 기반으로 주석이 달린 클러스터의 ID를 보여주는 UMAP. (I) 3개의 간 샘플에서 관찰된 세포 비율. (J) 유전자/핵, UMI/핵 및 비장 샘플당 미토콘드리아 함량 비율의 분포를 보여주는 바이올린 플롯. (K) 왼쪽 패널: 비장에서 식별된 클러스터에 대한 각 샘플의 기여도를 보여주는 UMAP 플롯. 오른쪽 패널: 비장 조직의 마커 유전자를 기반으로 주석이 달린 클러스터의 ID를 보여주는 UMAP. (L) 3개의 비장 샘플에서 관찰된 세포 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 재고 집중 | 샘플당 부피 | 최종 집중 |
| 자당 쿠션 솔루션 | 2개 M | 1500 마이크로리터 | 1.5 미터 |
| 자당 쿠션 버퍼 | - | 500 마이크로리터 | - |
| 디티오트레이톨(DTT) | 1개 M | 2 μL | 1 mM |
| RNAse 억제제 | 40 유/μL | 10 μL | 0.2 U/μL |
표 1: 1.5M 자당 쿠션 용액(SCS)의 제조. 이 용액은 3.1 단계에서 세척하는 동안 자당 그래디언트 원심분리에 사용되며 프로토콜을 시작하기 전에 매번 새로 준비해야 합니다. 프로토콜 중에는 항상 SCS를 얼음 위에 두십시오. 이 표에 언급된 솔루션은 재료 목차에서 참조됩니다.
| 구성 요소 | 재고 집중 | 샘플당 부피 | 최종 집중 |
| 실리카 콜로이드 원액 | 90% | 600 μL | 18% |
| 핵 저장 시약(S2 유전체학) | - | 2400 마이크로리터 | - |
| RNAse 억제제 | 40 유/μL | 15 μL | 0.2 U/μL |
표 2: 18% 실리카 콜로이드 용액의 제조. 이 용액은 3.2단계에서 세척하는 동안 실리카 콜로이드 그래디언트 원심분리에 사용되며 프로토콜을 시작하기 전에 매번 새로 준비해야 합니다. 프로토콜 동안 항상 18% 실리카 콜로이드 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
| 조직 | 시료 중량 | 카트리지 | 양도하다 |
| 쥐 간 | 25의 mg의 | 핵 분리 카트리지 | 조직 mg당 65,000개의 핵 |
| 쥐 간 | 4의 mg의 | Small Input Nuclei Isolation 카트리지 | 조직 mg당 32,000개의 핵 |
표 3: 저입력 핵 분리 카트리지의 핵 수율과 핵 분리 카트리지의 사후 자당 그래디언트 클린업.
| 구성 요소 | 재고 집중 | 샘플당 부피 | 최종 집중 |
| 핵 저장 시약 | - | 1000 마이크로리터 | - |
| RNAse 억제제 | 40 유/μL | 5 μL | 0.2 U/μL |
표 4: 핵 저장 시약(NSR)의 준비. 이 용액은 3-5단계의 핵 분리 중과 3.1.8단계의 정리 중에 사용됩니다. 4 °C에서 최대 4개월 동안 보관할 수 있습니다. 클린업 단계 6의 원심분리 단계에서 RNase 억제제로 새로운 부분 표본을 준비합니다. 이 표에 언급된 솔루션은 재료 목차에서 참조됩니다.
| 1x PBS + 0.04% BSA 원액 | |||
| 구성 요소 | 재고 집중 | 주식을 위한 양 | 최종 집중 |
| PBS(Ca 2+ 없음, Mg2+ 없음) | 1배 | 30 mL | - |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 30% | 40 μL | 0.04% |
| 1x PBS + 0.04% BSA + 0.2 U/μL RNAse 억제제 | |||
| 구성 요소 | 재고 집중 | 샘플당 부피 | 최종 집중 |
| 1x PBS + 0.04% BSA 스톡 솔루션 | - | 500 마이크로리터 | - |
| RNAse 억제제 | 40 유/μL | 2.5 μL | 0.2 U/μL |
표 5: PBS + 0.04% BSA의 제조. 이 용액은 3.1.10 단계에서 클린업이 끝날 때 그리고 10X 단일 핵 RNA 시퀀싱을 위해 핵 현탁액을 원하는 농도로 희석하기 위해 계수 후에 사용됩니다(계수 단계 4.4). 원액은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 클린업 단계 6의 원심분리 단계에서 RNase 억제제로 새로운 부분 표본을 준비합니다.
Discussion
우리는 냉동 포유류 조직에서 고품질 단일 핵을 얻기 위해 다재다능하고 부분적으로 자동화된 프로토콜을 개발했으며 쥐의 뇌, 쥐의 신장, 시노몰거스 간 및 비장 조직에 대한 프로토콜을 입증했습니다.
이 프로토콜의 성능을 뇌, 신장, 비장 및 간 조직 6,7,20,24,25,26에서 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대해 발표된 다른 프로토콜의 성능과 비교할 때 유사한 수의 유전자와 핵당 UMI 수를 검출할 수 있고 예상되는 세포 유형을 복구할 수 있음을 관찰할 수 있습니다. 기존 방법과 비교할 때 이 프로토콜에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 이 연구의 프로토콜은 단일 핵의 조직 균질화 및 분리를 자동화합니다. 이것은 로봇 조직 교란기(21)의 사용으로 달성된다. 대부분의 의정서에서는, 조직은 Dounce 균질화기로 단 하나 핵 3,20를 해방하기 위하여 균질화된다. 그러나 이 수동 단계는 균질화 중에 가해지는 힘의 양에 따라 핵 수율과 무결성의 실험적 변동성을 유발하여 실험의 재현성을 손상시킬 수 있음을 알게 되었습니다. 여기에서 고정된 설정의 자동 조직 분쇄기를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 우수한 핵 품질과 더 큰 일관성을 가진 수율을 얻을 수 있었습니다. 또한 이 단계를 자동화하면 프로토콜의 수작업 시간이 단축되어(조직 파괴 단계는 약 7분 소요) 사용자가 후속 단계를 준비할 수 있습니다. 둘째, 이 연구에서 설명된 프로토콜은 다재다능하며, 즉, 다른 종의 다른 조직과 호환됩니다. 이를 통해 긴 프로토콜 최적화를 피할 수 있습니다(예: 서로다른 조직에 대한 균질화 완충액/세제 식별). 셋째, 이 프로토콜은 깨끗한 핵을 얻기 위해 유동 분류기에 대한 액세스에 의존하지 않으므로 유동 분류에 필요한 장비/전문 지식이 없는 실험실에서 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 대신, 대부분의 이물질을 제거하기 위해 자당 그래디언트 기반 여과를 최적화했습니다. 그러나 특히 뇌 조직의 경우 보다 효율적인 미엘린 제거를 위해 자당 그래디언트 대신 실리카 콜로이드 그래디언트를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 자당/실리카 콜로이드 그래디언트 원심분리 단계 끝에 스윙 버킷 로터를 사용하면 핵 손실이 최소화된다는 사실도 발견했습니다. 따라서 이러한 로터를 사용하는 것이 좋습니다. 넷째, 핵을 계수하기 위한 여러 방법(현미경 하에서의 수동 계수, 여러 개의 자동화된 계수기의 사용)을 시험한 후, 자동화된 형광 세포 계수기(22)의 사용이 권장된다. 프로피듐 요오드화물(propidium iodide)과 같은 DNA 삽입 염료를 사용하면 핵 계수의 정확도가 높아집니다. 다섯째, 이 프로토콜은 시작부터 미세유체 칩을 로딩하는 데 약 75분이 걸립니다. 이는 여러 샘플을 처리할 때 핵 무결성이 높게 유지되도록 하는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 최적의 절삭 온도 화합물(OCT)이 포매된 조직과도 호환된다는 것을 발견했습니다. 이러한 재료를 사용하는 경우 균질화 전에 메스를 사용하여 OCT 블록에서 조직을 제거할 수 있습니다.
단일 핵 RNA 염기서열 분석 데이터 세트에서 빈번한 문제 중 하나는 핵 유래27,28뿐만 아니라 비핵(예: 미토콘드리아)일 수 있는 주변 RNA의 존재입니다. 당사의 프로토콜에서 미토콘드리아 RNA(비핵 주변 RNA의 프록시)는 필터링 전에도 낮습니다(표시된 조직의 경우 0.1-1.6%). 그러나 다른 프로토콜 및 데이터 세트와 유사하게, 풍부한 세포 유형(예: 간의 간세포, 뇌의 뉴런 등)의 핵에서 고도로 발현된 유전자의 주변 RNA 오염은 여전히 존재한다27. CellBender, SoupX 등과 같은 여러 생물정보학 도구가 존재하며, 이는 핵 주석 29,30,31 이전에 이러한 주변 RNA 오염을 제거할 수 있습니다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 조직 파괴 및 핵 분리 단계가 자동화되어 있음에도 불구하고 한 번에 하나의 샘플만 처리할 수 있기 때문에 이 단계의 처리량이 여전히 제한적이라는 것입니다. 그러나 이 단계는 조직 조각당 약 7분밖에 걸리지 않기 때문에 여러 샘플을 배치로 처리할 수 있습니다. 일반적으로 배치당 4개의 샘플을 처리하지만 배치당 최대 6개의 샘플을 처리하여 좋은 결과를 얻었습니다. 두 개의 시료를 동시에 병렬로 처리할 수 있도록 로봇 해리기의 최근 개선으로 배치당 8-12개의 시료를 처리할 수 있으며, 이는 단일 핵 캡슐화에 사용되는 미세유체 칩의 처리량과 호환됩니다.
다른 플랫폼을 사용하여 ATAC-seq 또는 snRNAseq와 같은 다른 다운스트림 응용 분야에는 이 프로토콜로 분리된 핵을 사용하지 않았지만, 여기에 사용된 유전자 발현 시약으로 얻은 데이터의 품질을 기반으로 하여 당사의 프로토콜이 추가 다운스트림 응용 분야와 호환되어야 한다고 생각합니다. 그러나 향후 작업에는 ATAC-seq와 같은 다른 다운스트림 애플리케이션과 함께 이 프로토콜을 테스트하는 작업이 포함됩니다.
결론적으로, 우리는 다양한 유형의 냉동 포유류 조직과 호환되는 것으로 입증된 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위한 빠르고 간단하며 부분적으로 자동화된 핵 분리 프로토콜을 개발했습니다.
Disclosures
모든 저자는 연구 수행 기간 동안 F. Hoffmann-La Roche의 직원이었습니다.
Acknowledgments
저자는 이 원고에서 분석한 동물 조직을 제공한 Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble, Matthias Selhausen에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 생물정보학을 지원해 주신 Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki, Martin Ebeling에게도 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
| 1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
| 30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
| 400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
| Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
| DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
| DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
| Dry ice | - | - | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
| Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
| Heatblock | |||
| High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Mini Centrifuge | - | - | |
| NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
| Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
| Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
| Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
| Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
| Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
| Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
| RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
| Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
| Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
| Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Singulator 100 System | S2 Genomics | - | Commercially available robotic tissue dissociator |
| Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
| Sterile tweezers | - | - | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
| ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
| Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | - |
References
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