Automatically Generated

Summary

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Abstract

Tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizilimi, sağladıkları transkriptomik bilgi zenginliği nedeniyle yaygın laboratuvar uygulamaları haline gelmiştir. Özellikle tek çekirdekli RNA dizilimi, ayrışması zor dokularda gen ekspresyonunu araştırmak için yararlıdır. Ayrıca, bu yaklaşım donmuş (arşiv) malzeme ile de uyumludur. Burada, ticari olarak temin edilebilen aletler ve reaktifler kullanılarak kısmen otomatik bir şekilde aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli tek çekirdekleri izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Spesifik olarak, doku homojenizasyonunu otomatikleştirmek ve standartlaştırmak için robotik bir ayrıştırıcı kullanılır, ardından çekirdekleri filtrelemek için optimize edilmiş bir kimyasal gradyan kullanılır. Son olarak, otomatik bir floresan hücre sayacı kullanarak çekirdekleri doğru ve otomatik olarak sayarız. Bu protokolün performansı fare beyni, sıçan böbreği ve sinomolgus karaciğer ve dalak dokusu üzerinde gösterilmiştir. Bu protokol basit, hızlıdır ve kapsamlı optimizasyon gerektirmeden çeşitli memeli dokularına kolayca uyarlanabilir ve aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için kaliteli çekirdekler sağlar.

Introduction

Tek hücreli (sc) ve tek çekirdekli (sn) RNA dizilimi, toplu RNA dizilimine kıyasla gen ekspresyonunun artan çözünürlüğü nedeniyle moleküler ve hücresel biyolojide yaygın olarak kullanılan protokoller haline gelmiştir. Bununla birlikte, katı dokulardan kaliteli tek hücreli ve tek çekirdekli preparatların izolasyonu bir zorluk olmaya devam etmektedir ve genellikle sc/sn-RNAseq deneylerinde hız sınırlayıcı adımdır. Gerçekten de, hücre/çekirdek süspansiyonlarını elde etmek için çeşitli kimyasal ve mekanik prosedürler kullanan çok sayıda protokol geliştirilmiştir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Ayrıca, bu tür preparatları döküntülerden/kümelerden vb. temizleme stratejileri, akış ayırmadan filtrelemeye ve yıkamaya kadar uzanır. Bu tür protokoller genellikle manueldir (kullanıcıyla ilgili değişkenliğe yol açar), zaman alıcı olabilir (hücre/çekirdek canlılığının azalmasına yol açar) ve/veya hücre/çekirdek sıralaması için bir akış sitometresine erişim gerektirebilir. Bu çalışma, aşağı akış RNA dizileme uygulamaları için donmuş memeli dokularından basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş tek çekirdekli bir izolasyon protokolü geliştirmeye odaklanmıştır. Dondurulmuş dokuların kullanımıyla uyumlu olduğu, numune toplamayı/işlemeyi daha pratik hale getirdiği ve özellikle zaman seyri deneylerinde numunelerin tarafsız bir şekilde harmanlanmasını sağladığı için hücre izolasyonunun aksine özellikle çekirdek izolasyonuna odaklandık. Ayrıca, nükleer transkriptom hücresel transkriptomu tam olarak yansıtmasa da, birkaç çalışma, hücre tiplerinin oranları değişebilse de, tek çekirdekli RNA dizileme verilerinin, hücre tipi tanımlaması için tek hücreli RNA dizileme verileriyle karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir 6,16,17,18,19.

Çekirdek izolasyonu birkaç adımdan oluşur: 1) çekirdekleri serbest bırakmak için dokunun mekanik veya kimyasal olarak bozulması, 2) döküntü ve kümelerin temizlenmesi ve 3) sonraki uygulamalara hazırlık için çekirdeklerin doğru sayımı. Bir dizi protokolde, adım 1, dokuyu ^3,20 bozmak için sıklıkla bir Dounce homojenizatörünün kullanılmasını içerir. Alternatif olarak, kimyasal yöntemler kullanılabilir, ancak bunların genellikle farklı dokular için optimize edilmesi gerekir ^2,5,6. Manuel bir doku bozma prosedürünün operatörle ilişkili değişkenliğe eğilimli olduğunu ve değişken kalite ve çekirdek verimine yol açtığını deneyimledik. Teknik değişkenliği en aza indirmek ve dokular arasında çalışan daha tutarlı ve tekrarlanabilir bir protokole sahip olmak için, ticari olarak temin edilebilen bir robotik doku ayrıştırıcısı kullanan bir protokol geliştirilmiştir²¹. Adım 2 için, tampon değişimi genellikle çekirdekleri yıkamak için en basit araç olsa da, döküntülerin daha kapsamlı bir şekilde uzaklaştırılması için nispeten kısa bir sükroz gradyan santrifüjleme adımının kullanımını benimsedik. Özellikle beyin dokusu için, daha etkili miyelin giderimi için sükroz gradyanı yerine silika kolloid gradyanı kullanıyoruz. Son olarak, sayım için, bir hemositometre kullanımı, çekirdekleri saymak ve görsel olarak incelemek için altın standarttır. Protokolümüzde bu adım, piyasada bulunan otomatik floresan hücre sayacı²² kullanılarak güvenilir bir şekilde otomatikleştirilebilir. Bu protokol test edilmiştir ve farklı memeli türlerinden (sıçan, fare ve insan olmayan primat) beyin, böbrek, dalak ve karaciğer dahil olmak üzere çeşitli donmuş memeli dokularıyla uyumludur ve damlacık tabanlı bir ticari platformla aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için kaliteli çekirdekler sağlar. Protokol, doku hazırlığından tek çekirdekli RNA dizileme iş akışının başlangıcına kadar yaklaşık 75 dakika sürer.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, Basel-Stadt kanton veterinerlik otoritesinin onayıyla, hayvanların korunmasına ilişkin İsviçre federal düzenlemelerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak veya Alman Hayvan Refahı Yasası’na uygun olarak Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’nin onayı ile gerçekleştirilmiştir. 1. Doku ve reaktif / alet hazırlama Temizlik ve cihaz hazırlamaTezgahları ve cımbızları etanol ve RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin. Santrifüjleri 4 °C’ye kadar önceden soğutun. Çekirdek izolasyon kartuşlarını buzdolabında 4 °C’de en az 30 dakika önceden soğutun. Robotik ayırıcıyı başlatın ve ekranın sağ üst köşesindeki kaydırıcıyı soğumaya ayarlayarak ve kaydırıcının turuncu görünmesi için soğutmayı başlatmak için üzerine tıklayarak soğutmayı açın. Takılı çekirdek depolama reaktifi (NSR) şişesinde ve çekirdek izolasyon tamponu (NIB) şişesinde yeterli sıvı kaldığını ve uygun şekilde soğutulduğunu kontrol edin. Kuru buzla dolu bir polistiren köpük kutu hazırlayın ve Petri kaplarını ve neşter bıçaklarını kuru buz üzerinde önceden soğutun. Tampon hazırlama1.5 M sükroz yastık çözeltisini (SCS) Tablo 1’de gösterildiği gibi hazırlayın. Numune başına dört adet 500 μL SCS alikotu elde etmek için SCS’yi 2 mL DNase/RNase tüplerinde 500 μL’lik alikotlara dağıtın. Daha fazla kullanana kadar alikotları buz üzerinde tutun. Beyin dokusunun işlenmesi durumunda, bunun yerine, NSR’de silika kolloid stok çözeltisini seyrelterek ve RNaz inhibitörü ekleyerek Tablo 2’de tarif edildiği gibi% 18’lik bir silika kolloid çözeltisi hazırlayın. Numune başına 3 mL% 18 silika kolloid çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde tutun. 2. Doku homojenizasyonu ve çekirdek izolasyonu Numuneyi -80 °C dondurucudan çıkarın ve hemen kuru buzun üzerine koyun. Numuneyi önceden soğutulmuş bir Petri kabı veya kuru buz üzerinde metal bir plaka üzerinde önceden soğutulmuş bir neşter ile 15-50 mg’lık bir parçaya kesin (zaten doğru boyutta değilse). Numuneyi doğru yönde kestiğinizden emin olun, böylece numune hala ilgilenilen organ yapılarını temsil eder.NOT: Bu protokolle, nükleer ekstraksiyon için en uygun numune boyutu 15-50 mg’dır. Temizlemeden sonra iyi bir verim elde etmek için en az 25 mg’lık bir numune boyutu önerilir. Daha küçük numuneler için, robotik ayrıştırıcı ile küçük girdileri işlemek için optimize edilmiş özel kartuşlar mevcuttur. Aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için yeterli verimle 4 mg ağırlığındaki doku örneklerini ayırmak için küçük giriş çekirdeği izolasyon kartuşları kullanıldı. Sıçan karaciğer dokusundan düşük girdili kartuş kullanılarak çekirdek verimine bir örnek Tablo 3’te gösterilmektedir. Çekirdek izolasyon kartuşunu buzdolabından çıkarın, ambalajından çıkarın, öğütücüyü çıkarın ve kartuşun altına 15 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL) pipetleyin.NOT: Çekirdek ekstraksiyonu sırasında, robotik ayrıştırıcı, kartuşa toplam 3 mL hacme kadar (düşük hacimli çekirdek ekstraksiyon protokolü ile) NIB ve NSR ekleyecektir. Ekstraksiyondan önce kartuşa 15 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL) eklenerek, süspansiyon 0.2 U/μL’lik istenen RNAse inhibitör konsantrasyonuna sahip olacaktır. Doku örneğini cımbız kullanarak kartuşun altına yerleştirin. Optimum bozulma verimliliğine sahip olmak için numuneyi tam olarak kartuşun ortasına yerleştirmeyin. Cihazda Protokol Çalıştır’ı seçin ve sol üst köşedeki Nuclei seçeneğine tıklayın.Menüden Düşük Hacimli Çekirdek İzolasyon protokolünü seçin ve Değiştir’e tıklayarak bozulma hızının hızlı olarak ayarlandığını doğrulayın. Kapağı açarak ve s’yi dışarı kaydırarak kartuşu cihaza yükleyin.tage kırmızı düğmeyi kaldırarak. Kartuşu belirlenen konuma yerleştirin, kartuş kilidini çevirin ve s’de kaydırıntage kırmızı düğme yerine oturana kadar. Kapıyı kapatın ve İleri’ye tıklayarak cihazda çekirdek çıkarma işlemini başlatın. Koşu yaklaşık 7 dakika sürer. Çalıştırma bittiğinde, kırmızı düğmeyi kaldırarak ve s’yi dışarı çekerek kartuşu cihazdan çıkarın.tage. Kartuşu hemen buzun üzerine yerleştirin. Beyin dışındaki tüm dokular için adım 3.1’e geçin. Beyin örnekleri için doğrudan adım 3.2’ye geçin. 3. Çekirdek temizleme Sükroz gradyan temizliğiNOT: Beyin dokusu için bu adımı atlayın ve doğrudan adım 3.2’ye gidin. RNA bozulmasını en aza indirmek için tüm temizleme adımları buz üzerinde gerçekleştirilir. Tamponlar ve tüplerin yanı sıra santrifüjlerin de önceden soğutulması gerekir. Girdaplama çekirdeklerin kalitesini ve bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden, tüm yeniden süspansiyon ve karıştırma adımları yalnızca dikkatli pipetleme ile gerçekleştirilir.Ayrıştırıcı kartuşundaki yuvarlak folyoyu bir pipet ucuyla dikkatlice delin.NOT: Ayrışmadan sonra, ortaya çıkan çekirdek süspansiyonu yaklaşık 2 mL’lik bir hacme sahiptir. Sükroz gradyan temizliğini kolaylaştırmak için, çekirdek süspansiyonunu iki adet 900 μL’lik alikotlara bölün, bu da temizleme sırasında toplam 1.8 mL çekirdek süspansiyonu hacminin kullanılmasına neden olur. Çekirdek süspansiyonunun ilk 900 μL’lik alikotunu kartuştan çıkarın ve daha önce 2 mL’lik bir tüpte hazırlanmış 500 μL’lik bir SCS alikotuna ekleyin. Karışım homojen olana kadar pipetleyerek iyice karıştırın. 1400 μL çekirdek süspansiyonu – SCS karışımını çıkarın ve tüpü bir açıyla tutarak ve karışımı damla damla ekleyerek açıkça görülebilen bir faz ayrımı oluşturarak dikkatlice yeni bir 500 μL SCS alikotu üzerine katmanlayın (bkz. Şekil 1A). Tüpü dikkatlice kapatın ve faz ayrımını bozmadan tekrar buzun üzerine yerleştirin. Gradyan santrifüjleme için açıkça görülebilen bir faz ayrımı ile numune başına iki adet 2 mL tüpe sahip olmak için ikinci 900 μL’lik süspansiyon alikotu ve yeni bir SCS alikotu ile 3.1.2-3.1.4 adımlarını tekrarlayın. Tüpleri dikkatlice önceden soğutulmuş bir santrifüje ekleyin ve 4 °C’de 15 dakika boyunca 13.000 x g’de döndürün. Bu arada, Tablo 4’te açıklanan NSR’yi, NSR’nin bir alikotuna RNaz inhibitörü ekleyerek hazırlayın. Numune başına 1 mL NSR hazırlayın.NOT: Bu noktada, tek hücreli gen ekspresyonu reaktifi jel boncukları -80 °C dondurucudan çıkarılabilir, bu da oda sıcaklığına (RT) dengelenmelerine izin verir ve şablon anahtarı oligo, düşük TE tamponunda yeniden süspanse edilebilir. Santrifüjlemeden sonra, peleti bozmadan süpernatanı her iki tüpten çıkarın ve üreticinin tavsiyesine göre peleti 50 μL buz gibi soğuk NSR’de dikkatlice yeniden süspanse edin. Aynı numunenin iki peletini 1,5 mL’lik yeni bir tüpte toplayın ve toplam 1 mL hacme 900 μL buz gibi soğuk NSR ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın. Numuneyi 500 x g’da 5 °C’de 4 dakika boyunca sallanan kovalı rotor santrifüjü ile santrifüjleyin.NOT: Çekirdek kaybını en aza indirmek için, özellikle çekirdek veriminin düşük olması beklendiğinde veya az miktarda doku ile başlarken, sallanan bir kova rotoru kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Bu arada, Tablo 5’te tarif edildiği gibi% 0.04 sığır serum albümini (BSA) ve 0.2 U / μL RNaz inhibitörü ile 1x PBS (Ca2+ ve Mg2 + olmadan) numunesi başına 500 μL hazırlayın. Peletleri atmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti yukarıda hazırlandığı gibi 100 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin (0.2 U / μL’de 1x PBS +% 0.04 BSA + RNaz inhibitörü).NOT: Küçük doku örnekleri için çekirdek konsantrasyonu düşük olabilir ve bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi için yeterince yüksek konsantrasyonlar sağlamak için peletin sadece 50 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edilmesi önerilir. Doğrudan 4. adıma geçin. Silika kolloid gradyan temizlemeNOT: Beyin dokusu için, bir silika kolloid gradyanı, miyelin ve kalıntıları çekirdek süspansiyonundan çıkarmak için bir sükroz gradyanından daha uygundur. RNA bozulmasını en aza indirmek için tüm temizleme adımları buz üzerinde gerçekleştirilir. Tamponlar ve tüplerin yanı sıra santrifüjlerin de önceden soğutulması gerekir. Girdaplama çekirdeklerin kalitesini ve bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden, tüm yeniden süspansiyon ve karıştırma adımları yalnızca dikkatli pipetleme ile gerçekleştirilir.Ayrıştırıcı kartuşundaki yuvarlak folyoyu bir pipet ucuyla dikkatlice delin. Çekirdek süspansiyonunu kartuştan çıkarın ve 5 mL’lik bir tüpe ekleyin. Önceden soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C’de 5 dakika boyunca 500 x g’da santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 1 mL buz gibi soğuk silika kolloid solüsyonunda yeniden süspanse edin. Toplam hacmi 3 mL olacak şekilde 2 mL ilave silika kolloid çözeltisi ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Numuneyi 700 x g’da 5 °C’de 4 dakika boyunca fren ayarlıyken sallanan kovalı bir rotorda santrifüjleyin. Bu arada, Tablo 4’te açıklanan NSR’yi, NSR’nin bir alikotuna RNaz inhibitörü ekleyerek hazırlayın. Numune başına 1 mL NSR hazırlayın.NOT: Bu noktada, tek hücreli gen ekspresyon reaktifi jel boncukları -80 °C dondurucudan çıkarılabilir, bu da RT’ye dengelenmesini sağlar ve şablon anahtarı oligosu düşük TE tamponunda yeniden süspanse edilebilir. Üstte yüzen miyelin tabakasını bozmadan numuneyi santrifüjden dikkatlice çıkarın. İlk olarak, miyelin tabakasını üstten çıkarın ve atın; Ardından, peleti bozmadan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın.NOT: Miyelin tabakası, 1-2 mL süpernatan ile birlikte miyelin tabakasını aspire etmek için 1 mL’lik bir pipet ucunun etrafına steril, tüy bırakmayan bir mendil sarılarak kolayca çıkarılabilir. Üreticinin tavsiyesine göre peleti 1 mL buz gibi soğuk NSR’de yeniden süspanse edin. Numuneyi 500 x g’da 5 °C’de 4 dakika boyunca sallanan kova rotorlu bir santrifüjde santrifüjleyin.NOT: Çekirdek kaybını en aza indirmek için, özellikle çekirdek veriminin düşük olması beklendiğinde veya az miktarda doku ile başlarken, sallanan bir kova rotoru kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Bu arada, Tablo 5’te tarif edildiği gibi% 0.04 sığır serum albümini (BSA) ve 0.2 U / μL RNaz inhibitörü ile 1x PBS (Ca2+ ve Mg2 + olmadan) numunesi başına 500 μL hazırlayın. Süpernatanı peleti bozmadan dikkatlice çıkarın ve numuneyi yukarıda hazırlandığı gibi 100 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin (0,2 U/μL’de 1x PBS + %0,04 BSA + RNaz inhibitörü).NOT: Küçük doku örnekleri için çekirdek konsantrasyonu düşük olabilir ve bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi için yeterince yüksek konsantrasyonlar sağlamak için peletin sadece 50 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edilmesi önerilir. 4. Sayma Sayılacak her numune için, 1:3 seyreltme elde etmek için 10 μL çekirdek süspansiyonunu 20 μL PBS çözeltisi içinde seyreltin. Sayım için, floresan sayaç sayma plakasının bir karıştırma kuyucuğuna 25 μL propidyum iyodür (PI) boyama çözeltisi ekleyin. 25 μL seyreltilmiş çekirdek süspansiyonu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. 50 μL boyanmış numuneyi karıştırma kuyusundan yükleme kuyusuna aktarın. Sayma plakasını hücre sayacına yükleyin ve sayımı başlatın.NOT: Çekirdek sayısı, 700 ms’lik bir maruz kalma süresi ile kırmızı floresan kanalından alınır. Bu kanal, mikroskop altında bir Neubauer Odası ve Tripan Mavisi boyama ile manuel sayım ile çapraz karşılaştırma yaparak doğru bir çekirdek sayımı elde etmek için optimize edilmiştir. Yüksek konsantrasyonlarda, çekirdekler birbirine çok yakındır ve bu da yazılımın onları ayırmasını zorlaştırır. Bu durumda, numunenin uygun bir seyreltmede yeniden sayılması önerilir. Çekirdeklerin bütünlüğü ve temizliği, parlak alan görüntüsünden veya mikroskop altında değerlendirilebilir. Numuneleri PBS (0.2 U/μL’de 1x PBS + %0.04 BSA + RNaz inhibitörü) ile tek çekirdekli RNA dizilimi için istenen konsantrasyona seyreltin.NOT: 700-1.200 çekirdek/μL arasındaki konsantrasyonlar, tek çekirdekli RNA dizilimi için optimal kabul edilir. 700 çekirdek/μL gibi daha düşük hücre konsantrasyonları, ortamdaki RNA’dan arka plan kontaminasyonunun azalmasına neden olabilir. 5. Kütüphane hazırlığı Numune başına 8000-10.000 çekirdekli bir çekirdek geri kazanımını hedefleyen üreticinin protokolünü kullanarak tek hücreli gen ekspresyon reaktifleri ile tek çekirdekli RNA dizilimi gerçekleştirin. 6. Sıralama Kitaplıkları eşleştirilmiş uç, çift indeksleme ve aşağıdaki sıralama okumaları ile istenen sıralama derinliğine sahip sıralayın: Okuma 1: 28 döngü, i7 İndeks: 10 döngü, i5 İndeks: 10 döngü ve Okuma 2: 90 döngü.

Representative Results

Bu protokolün performansı ve çok yönlülüğü, üç B6 faresinden alınan taze donmuş beyin oksipital korteks dokusu, üç Wistar sıçanından alınan taze donmuş enine kesilmiş böbrek dokusu, üç Mauritius Cynomolgus makakından alınan arşiv (11 yaşındaki) karaciğer ve dalak dokusu üzerinde tek çekirdekli RNA dizilimi gerçekleştirilerek gösterilmiştir. Tüm hayvanlar perfüze edilmemiştir. Şekil 1B,C’de gösterildiği gibi, kanama, döküntü ve topaklanma belirtileri olmayan kaliteli çekirdekler elde edildi. Sükroz gradyan tabanlı filtrasyon, farklı yoğunlukları, dönüş hızlarını ve süreleri test ederek ve nükleer saflığı/bütünlüğü mikroskop altında değerlendirerek ve ayrıca çekirdek boyutu dağılımını ve verimini değerlendirerek döküntülerin çoğunu gidermek için optimize edildi (Şekil 1D). Bu, 1,5 M’lik bir sükroz gradyan yoğunluğu seçmemize ve 15 dakikalık kısa bir sıkma süresi kullanmamıza izin verdi. Daha sonra, çekirdeklerin kalitesini daha fazla değerlendirmek için, veriler 10X Cell Ranger kullanılarak önceden işlendi ve Besca23 kullanılarak daha fazla aşağı akış veri analizi gerçekleştirildi. Yüzde >5 mitokondriyal içeriğe sahip çekirdekler (bunlar hasarlı/stresli çekirdekler olma eğiliminde olduğundan) filtrelendi ve 500-7.000 gen içeren çekirdekler (boş damlacıkları ve çoklukları en aza indirmek için) tutuldu. Sadece en az 30 çekirdekte bulunan genleri dahil ettik. Beyin korteks örneği başına 8,000 çekirdeği ve böbrek, karaciğer ve dalak örneği başına 10,000 çekirdeği hedefledik. Filtrasyondan sonra, üç beyin örneğinden 10.644 yüksek kaliteli çekirdek, üç böbrek örneğinden 14.960 yüksek kaliteli çekirdek, üç karaciğer örneğinden 18.795 yüksek kaliteli çekirdek ve üç dalak örneğinden 13.882 yüksek kaliteli çekirdek elde edildi. Şekil 2A,D,G,J, her numunedeki UMI sayılarının, gen sayımlarının ve mitokondriyal içeriğin dağılımını temsil eden keman grafiklerini göstermektedir. Tüm beyin örneklerinde medyan sayım sayısı 7.563 UMI / çekirdek ve 3.208 gen / çekirdek idi. Tüm böbrek örneklerinde medyan sayım sayısı 3.841 UMI / çekirdek ve 1.915 gen / çekirdek idi. Tüm karaciğer örneklerinde medyan sayım sayısı 2.649 UMI / çekirdek ve 1.676 gen / çekirdek idi. Tüm dalak örneklerinde medyan sayım sayısı 1.609 UMI / çekirdek ve 1.138 gen / çekirdek idi. Daha sonra oldukça değişken genler kullanarak kümeler oluşturduk ve bilinen işaretleyici genler 17,24,25,26’yı kullanarak bunları açıkladık. Şekil 2B,E,H,K’de görüldüğü gibi, her dokudan beklenen hücre tiplerini belirleyebildik. Ayrıca, Şekil 2B, E, H, K’de görüldüğü gibi, tüm hayvanlar tüm kümelere katkıda bulundu ve bu da protokol tarafından getirilen genel düşük teknik değişkenliği gösterdi. Ayrıca, hücresel oranlar, UMI ve gen sayıları gibi doku tipi başına her üç örnekte de karşılaştırılabilirdi (Şekil 2A, C, D, F, G, I, J, L). Dikkate değer bir istisna, üç karaciğer örneği arasındaki hepatosit popülasyonlarının oranlar ve profil bakımından farklı olduğu karaciğerdir. Bu büyük olasılıkla hayvanlar arasındaki biyolojik farklılıklardan (cinsiyet, yaş, metabolik durum) kaynaklanmaktadır. Şekil 1: Çekirdek kalitesinin değerlendirilmesi ve sükroz gradyan optimizasyonu. (A) Sükroz gradyan santrifüjlemesi sırasında beklenen faz ayrımı bir okla gösterilir. (B) Protokol ile elde edilen propidyum iyodür ile boyanmış sıçan böbreği (üstte) ve sinomolgus dalak (altta) çekirdeklerinin temsili floresan görüntüleri. (C) Fare karaciğerinden (üstte) ve fare beyninden (altta) izole edilen çekirdeklerin temsili parlak alan mikroskobu görüntüleri, ölçek çubuğu 500 μm. Çekirdeklerin düzenli pürüzsüz yüzeyine dikkat edin, bu da iyi nükleer kaliteyi gösterir. (D) Sükroz gradyan optimizasyonu. Birkaç sükroz yoğunluğu, sıkma hızı ve sıkma süresi test edildi. Her koşul için çekirdeklerin, çekirdek boyutu dağılımının ve çekirdek veriminin parlak alan mikroskobu görüntüleri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: snRNAseq’ten fare beyni oksipital korteksi, sıçan böbreği (korteks ve medulla) ve sinomolgus makak karaciğeri ve dalağı hakkındaki temsili veriler. (A) Beyin örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI’lerin/çekirdeğin ve mitokondriyal içeriğin yüzdesini gösteren keman grafikleri. (B) Sol panel: Her bir numunenin beyinde tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Beyin dokusundaki işaretleyici genlere dayalı olarak açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (C) 3 beyin örneğinde gözlenen hücresel oranlar. (D) Böbrek örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI’lerin/çekirdeğin ve yüzde mitokondriyal içeriğin dağılımını gösteren keman grafikleri. (E) Sol panel: Her bir numunenin böbrekte tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Böbrek dokusundaki belirteç genlerine göre açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (F) 3 böbrek örneğinde gözlenen hücresel oranlar. (G) Karaciğer örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI’lerin/çekirdeğin ve yüzde mitokondriyal içeriğin dağılımını gösteren keman grafikleri. (H) Sol panel: Her bir numunenin karaciğerde tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Karaciğer dokusundaki işaretleyici genlere dayalı olarak açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (I) 3 karaciğer örneğinde gözlenen hücresel oranlar. (J) Dalak örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI’lerin/çekirdeğin ve mitokondriyal içeriğin yüzdesini gösteren keman grafikleri. (K) Sol panel: Her bir numunenin dalakta tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Dalak dokusundaki işaretleyici genlere göre açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (L) 3 dalak örneğinde gözlenen hücresel oranlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Bileşen Stok konsantrasyonu Numune başına hacim Son Konsantrasyon Sükroz Yastık Çözümü 2 AYLIK 1500 μL 1,5 milyon Sükroz Yastık Tamponu – 500 μL – Ditiyotreitol (DTT) 1 AYLIK 2 μL 1 milyon RNAse inhibitörü 40 U/μL 10 μL 0,2 U/μL Tablo 1: 1.5 M sükroz yastık çözeltisinin (SCS) hazırlanması. Bu çözelti, adım 3.1’deki temizlik sırasında sükroz gradyan santrifüjlemesi için kullanılır ve protokole başlamadan önce her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Protokol sırasında SCS’yi her zaman buzda tutun. Bu tabloda belirtilen çözümlere Malzeme Tablosunda atıfta bulunulmaktadır. Bileşen Stok konsantrasyonu Numune başına hacim Son Konsantrasyon Silika kolloid stok çözeltisi 90% 600 μL 18% Çekirdek Depolama Reaktifi (S2 Genomik) – 2400 μL – RNAse inhibitörü 40 U/μL 15 μL 0,2 U/μL Tablo 2:% 18 silika kolloid çözeltisinin hazırlanması. Bu çözelti, adım 3.2’deki temizlik sırasında silika kolloid gradyan santrifüjlemesi için kullanılır ve protokole başlamadan önce her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Protokol sırasında her zaman% 18 silika kolloid çözeltisini buz üzerinde tutun. Doku Numune ağırlığı Fişek Rekolte Sıçan karaciğeri 25 mg Çekirdek İzolasyon Kartuşu mg doku başına 65.000 çekirdek Sıçan karaciğeri 4 mg Küçük Giriş Çekirdekleri İzolasyon Kartuşu mg doku başına 32.000 çekirdek Tablo 3: Sükroz gradyan temizleme sonrası düşük girişli çekirdek izolasyon kartuşundan çekirdek verimi, çekirdek izolasyon kartuşuna karşı. Bileşen Stok konsantrasyonu Numune başına hacim Son Konsantrasyon Çekirdek Depolama Reaktifi – 1000 μL – RNAse inhibitörü 40 U/μL 5 μL 0,2 U/μL Tablo 4: Çekirdek depolama reaktifinin (NSR) hazırlanması. Bu çözüm, 3-5. adımlardaki Çekirdek İzolasyonu sırasında ve 3.1.8. adımdaki temizleme sırasında kullanılır. 4 °C’de 4 aya kadar saklanabilir. Temizleme adımı 6’daki santrifüj adımı sırasında RNase inhibitörü ile taze bir alikot hazırlayın. Bu tabloda belirtilen çözümlere Malzeme Tablosunda atıfta bulunulmaktadır. 1x PBS + %0,04 BSA hisse senedi çözümü Bileşen Stok Konsantrasyonu Stok hacmi Son Konsantrasyon PBS (Ca2+ yok, Mg2 + yok) 1 adet 30 mL – Sığır Serum Albümini (BSA) 30% 40 μL 0.04% 1x PBS +% 0.04 BSA + 0.2 U / μL RNA inhibitörü Bileşen Stok Konsantrasyonu Numune başına hacim Son Konsantrasyon 1x PBS + %0,04 BSA Hisse Senedi Çözümü – 500 μL – RNAse inhibitörü 40 U/μL 2,5 μL 0,2 U/μL Tablo 5: PBS + %0.04 BSA’nın hazırlanması. Bu çözelti, adım 3.1.10’daki temizlemenin sonunda ve sayımdan sonra, 10X tek çekirdekli RNA dizilimi için çekirdek süspansiyonunu istenen konsantrasyona seyreltmek için kullanılır (sayım adımı 4.4). Stok çözelti 4 °C’de 1 aya kadar saklanabilir. Temizleme adımı 6’daki santrifüj adımı sırasında RNase inhibitörü ile taze bir alikot hazırlayın.

Discussion

Donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli tek çekirdekler elde etmek için çok yönlü ve kısmen otomatik bir protokol geliştirdik ve protokolü fare beyni, sıçan böbreği ve sinomolgus karaciğer ve dalak dokusu üzerinde gösterdik.

Bu protokolün performansını beyin, böbrek, dalak ve karaciğer dokusunda tek çekirdekli RNA dizilimi için yayınlanmış diğer protokollerle karşılaştırdığımızda 6,7,20,24,25,26^, çekirdek başına benzer sayıda gen ve UMI sayısını tespit edebildiğimizi ve beklenen hücre tiplerini geri kazanabildiğimizi gözlemliyoruz. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokolün çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, bu çalışmadaki protokol, doku homojenizasyonunu ve tek çekirdeklerin izolasyonunu otomatikleştirir. Bu, robotik bir doku bozucu²¹ kullanılarak elde edilir. Çoğu protokolde, tek çekirdekleri serbest bırakmak için doku bir Dounce homojenizatör ile homojenize edilir ^3,20. Bununla birlikte, bu manuel adımın, homojenizasyon sırasında uygulanan kuvvet miktarına bağlı olarak çekirdek veriminde ve bütünlüğünde deneysel değişkenliğe yol açabileceğini ve deneylerin tekrarlanabilirliğini tehlikeye atabileceğini fark ettik. Burada, sabit ayarlara sahip otomatik bir doku öğütücü kullanılarak, deneyler arasında daha tutarlı bir şekilde iyi çekirdek kalitesi ve verimi elde edildi. Ayrıca, bu adımın otomatikleştirilmesi, protokolün uygulama süresini de azaltır (doku bozulma adımı yaklaşık 7 dakika sürer) ve kullanıcının sonraki adımlara hazırlanmasına olanak tanır. İkincisi, bu çalışmada açıklanan protokol çok yönlüdür, yani farklı türlerden farklı dokularla uyumludur. Bu, örneğin farklı dokular için homojenizasyon tamponlarını/deterjanlarını tanımlamak gibi uzun protokol optimizasyonundan kaçınmamızı sağlar ^2,5,6. Üçüncüsü, bu protokol temiz çekirdekler elde etmek için bir akış sıralayıcıya erişime bağlı değildir, bu nedenle akış ayırma için gerekli ekipmana/uzmanlığa sahip olmayan laboratuvarlar için daha erişilebilir hale getirir. Bunun yerine, kalıntıların çoğunu temizlemek için sükroz gradyan tabanlı filtrelemeyi optimize ettik. Bununla birlikte, özellikle beyin dokusu için, daha verimli miyelin giderimi için sükroz gradyanı yerine silika kolloid gradyanı kullanılması önerilir. Ayrıca, sakaroz/silika kolloid gradyan santrifüjleme adımının sonunda sallanan kova rotorunun kullanılmasının çekirdek kaybını en aza indirdiğini bulduk. Bu nedenle, böyle bir rotorun kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Dördüncüsü, çekirdekleri saymak için birden fazla yöntemi test ettikten sonra (mikroskop altında manuel sayım, birkaç otomatik sayacın kullanımı), otomatik bir floresan hücre sayacının⁽²²) kullanılması önerilir. Promidyum iyodür gibi bir DNA ara ayırıcı boyanın kullanılması, çekirdek sayımının doğruluğunu artırır. Beşincisi, bu protokol başlangıçtan mikroakışkan çipin yüklenmesine kadar yaklaşık 75 dakika sürer. Bu, birden fazla numuneyi işlerken çekirdek bütünlüğünün yüksek kalmasını sağlamaya yardımcı olur. Son olarak, protokolün optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) gömülü doku ile de uyumlu olduğunu bulduk. Bu tür bir malzeme kullanılıyorsa, doku homojenizasyondan önce bir neşter kullanılarak OCT bloğundan çıkarılabilir.

Tek çekirdekli RNA dizileme veri kümelerinde sık karşılaşılan bir zorluk, nükleer olmayan (örneğin mitokondriyal) ve nükleer kaynaklı olabilen ortam RNA’sının varlığıdır^27,28. Protokolümüzde, mitokondriyal RNA (nükleer olmayan ortam RNA’sı için bir vekil) filtrelemeden önce bile düşüktür (gösterilen dokular için% 0.1-1.6). Bununla birlikte, diğer protokollere ve veri kümelerine benzer şekilde, bol hücre tiplerinin (karaciğerdeki hepatositler, beyinlerdeki nöronlar vb.) çekirdeklerinde yüksek oranda eksprese edilen genlerden ortam RNA kontaminasyonu hala mevcuttur²⁷. Hücre Bükücü, SoupX, vb. gibi çeşitli biyoinformatik araçlar, çekirdek açıklamasından^önce bu tür ortam RNA kontaminasyonunu ortadan kaldırabilir 29,30,31. Bu protokolün bir başka sınırlaması, doku bozulması ve çekirdek izolasyon adımlarının otomatikleştirilmesine rağmen, bir seferde yalnızca bir numune işlenebildiğinden bu adımın veriminin hala sınırlı olmasıdır. Bununla birlikte, bu adım doku parçası başına yalnızca yaklaşık 7 dakika sürdüğünden, birden fazla numune yine de bir partide işlenebilir. Genellikle parti başına dört numune işliyoruz, ancak parti başına altı numuneye kadar iyi sonuçlar elde ettik. İki numunenin aynı anda paralel işlenmesine izin vermek için robotik ayrıştırıcıdaki son gelişmeler, parti başına 8-12 numunenin işlenmesini sağlayacaktır, bu da tek çekirdekli kapsülleme için kullanılan mikroakışkan çipin verimi ile uyumludur.

Bu protokol tarafından izole edilen çekirdekleri, diğer platformları kullanan ATAC-seq veya snRNAseq gibi diğer aşağı akış uygulamaları için kullanmamış olsak da, burada kullanılan gen ekspresyon reaktifleri ile elde edilen verilerin kalitesine bağlı olarak, protokolümüzün ek aşağı akış uygulamalarıyla uyumlu olması gerektiğine inanıyoruz. Bununla birlikte, gelecekteki çalışmalar, bu protokolün ATAC-seq gibi diğer aşağı akış uygulamalarıyla test edilmesini içerecektir.

Sonuç olarak, farklı tipteki donmuş memeli dokularıyla uyumlu olduğu gösterilen, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için hızlı, basit ve kısmen otomatik bir çekirdek izolasyon protokolü geliştirdik.

Materials

1 M DTT	Thermo Fisher Scientific	P2325
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
10x Magnetic Separator	10x genomics	PN-120250
10x Vortex Adapter	10x genomics	PN-120251
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144	stored at 4°C
30% Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9576_50ML
400 mM Tris-HCl, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15568025
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019	Stored at -20 °C
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter	Nexcelom Bioscience	CELMXSYSF2	Automated fluorescent cell counter
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10x genomics	PN-1000127	Single cell gene expression reagent, stored at room temperature
Chromium Next GEM Secondary Holder	10x genomics	PN-1000195
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns	10x genomics	PN-1000129	Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns	10x genomics	PN-1000128	Single cell gene expression reagent
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns	10x genomics	PN-1000158	Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns	10x genomics	PN-1000130	Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Divided Polystyrene Reservoirs	VWR	41428-958
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf	Sigma-Aldrich	EP0030108051
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf	Sigma-Aldrich	EP0030108078
Dry ice	–	–
Dynabeads MyOne SILANE	10x genomics	PN-2000048	Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C
Ethanol Pure	Sigma-Aldrich	E7023
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)	Ricca Chemical Company	3290-16
Heatblock
High-Throughput Nexcelom Counting Plates	Nexcelom Bioscience	CHM24-A100-001	Cell counter counting plate
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)	Thermo Fisher Scientific	12090015
Mini Centrifuge	–	–
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles)	Illumina	2002840
Nuclei Isolation Buffer	S2 Genomics	100-063-396	Stored at 4 °C
Nuclei Isolation Cartridge	S2 Genomics	100-063-287	Precooled at 4 °C before use
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution	Sigma-Aldrich	NUC201-1KT	Sucrose cushion solution
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer	Sigma-Aldrich	NUC201-1KT
Nuclei Storage Reagent	S2 Genomics	100-063-405	Stored at 4 °C
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips	Eppendorf	30124359
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02	Silica colloid solution
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32854
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R)	Eppendorf	5805000010
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R)	Eppendorf	5811000015
RNAseZap	Ambion	AM9780	RNAse decontamination solution
Round cell culture petri dish	SPL	330005
Scalpel disposable	Aesculap AG	BA210	pre-cooled on dry ice before use
Single Index Kit T Set A, 96 rxns	10x genomics	PN-1000213	Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C
Singulator 100 System	S2 Genomics	–	Commercially available robotic tissue dissociator
Sodium Hydroxide 1M	Sigma-Aldrich	72068
SPRIselect Reagent Kit	Beckman Coulter	b23318
Sterile tweezers	–	–
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977049
ViaStain PI Staining Solution	Nexcelom Bioscience	CS1-0109-5mL	Propidium iodide staining solution
Vortex Mixer+A2:D44	VWR	–