Summary
药物干粉开发需要可靠的 体内 测试，通常使用小鼠模型。用于准确和可重复地将干粉气溶胶输送给小鼠的设备技术受到限制。本研究介绍了用于小鼠相关剂量的肺部药物递送的一次性给药器，有助于初步的概念验证研究。
Abstract
干粉吸入器在将药物输送到肺部方面具有许多优势，包括稳定的固态药物制剂、设备便携性、推注计量和剂量以及无推进剂的扩散机制。为了开发药用干粉气雾剂产品，稳健 的体内 测试至关重要。通常，初步研究涉及在对大型动物物种进行正式研究之前使用小鼠模型进行初步评估。然而，这种方法的一个重大局限性是缺乏合适的设备技术来准确和可重复地将干粉输送给小动物，从而阻碍了此类模型的实用性。为了应对这些挑战，一次性注射器给药器专门用于肺内给药，剂量适合小鼠。这些加料器装载并输送从均匀堆积密度粉末床中获得的预定量的粉末。这种离散控制是通过将钝针插入固定深度（夯实）到粉末床中来实现的，每次去除固定数量。值得注意的是，这种计量模式已被证明对一系列喷雾干燥粉末有效。在涉及四种不同型号喷雾干燥粉末的实验中，加药器证明了能够达到 30 至 1100 μg 范围内的剂量。达到的剂量受夯实剂数量、给药针头尺寸和所用特定配方等因素的影响。这些给药器的主要优点之一是易于制造，使其易于获得且具有成本效益，可在初始概念验证研究期间将干粉输送给小鼠。加料器的一次性特性便于在动物手术室中使用，在这些手术室中，清洁和重新填充可重复使用的系统和称重材料不方便。因此，开发一次性注射器给药器解决了小鼠干粉递送概念验证研究的重大障碍，使研究人员能够在用于肺部药物递送的小动物模型中进行更准确和可重复的初步研究。
Introduction
在过去三十年中，由于全球逐步淘汰氯氟烃推进剂1,2，使用干粉吸入器（DPI）进行肺部给药引起了人们的极大兴趣。与其他肺输送系统（如定量吸入器和雾化器）相比，DPI 具有许多优势，包括配方稳定性、便携性、易用性和无推进剂分散机制2。然而，在将DPI产品推向临床转化之前，必须进行几项临床前研究，其中许多研究最初是使用小鼠模型完成的。然而，用于准确和可重复地向小动物输送干粉的技术是有限的。
将干粉输送给小动物（如小鼠）的常用方法包括被动吸入3,4,5,6,7和直接给药8,9,10,11,12,13。被动吸入通常需要一个定制的腔室，该腔室利用大剂量的喷雾干燥粉末来制备足够的气溶胶云。由于小鼠是专性鼻呼吸器14，通过被动吸入输送需要粉末通过鼻子和喉咙到达肺部，因此需要维持具有足够颗粒空气动力学特性的气溶胶云7,8。虽然这是一种有用的技术，在生理上比正常呼吸导致的吸入直接给药更具生理相关性14，但它可能不适合粉末质量有限的初始研究。
或者，已经报道了许多用于直接干粉输送的气管内输送装置8、9、10、11、12、13。气管内装置绕过鼻子和喉咙，将粉末直接输送到肺部，并允许对输送的剂量进行更精细的控制14.此外，一些设备，特别是那些使用夯实加载程序9制备的器械，可以制备较少的量，这是初始概念验证研究的重要考虑因素。缺乏普遍可用的气管内给药装置阻碍了其使用潜力，限制了可用性并导致实验室间差异14.在这项研究中，我们提出了一种简单、廉价、一次性的气管内给药器，可用于开发干粉气溶胶的概念验证小鼠研究。
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Protocol
所有动物实验均按照《动物福利法》和《关于人道护理和使用实验动物的公共卫生服务政策》进行。该研究方案已获得田纳西大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的批准。~6-8周龄的健康雌性BALB / c小鼠通过肺内气溶胶递送给予一种给药剂的干粉含量，以使用大观霉酰胺1599干粉进行药代动力学研究9。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 配料器和灌装组件的准备
- 使用精密切片锯（参见材料表）或皮带砂光机修剪 2.54 厘米（1 英寸）钝不锈钢针 （21-25 G） 的塑料鲁尔部分，直到 2-3 毫米的塑料鲁尔剩余（图 1A 和图 2A）。
注意： 如果使用带式砂光机，可能需要使用较小的针或金属丝清洁不锈钢针，以清除可能产生的障碍物。 - 切掉 0.6 mL 锥形离心管的尖端 （1-1.5 cm）。用 30-35 毫克粉末填充管尖。
注：有关本研究使用的示例粉末的详细信息，请参阅代表性结果。在用于本应用之前，应按照 USP 通则第 <601 章>中描述的标准方法评估粉末气溶胶性能（参见 材料表）。 - 如果储存和/或运输粉末，请使用管盖（切断）关闭小瓶。在储存和/或运输时，用石蜡膜密封，以尽量减少粉末暴露于环境湿气。
2. 装药和组装加药器
- 根据需要多次将修剪好的不锈钢针头夯实到0.6mL锥形离心管尖端的粉末床中，以达到所需剂量（图2B）。用低绒擦拭器轻轻擦拭不锈钢针的侧面，以去除多余的粉末（图 3）。
- 轻轻地将加载的不锈钢针插入 3.81 厘米（1.5 英寸）聚丙烯或 5.08 厘米（2 英寸）聚四氟乙烯 （PTFE） 针（16-20 G）（参见 材料表）以避免任何粉末脱落（图 1B、C 和 图 2C）。
3. 驱动加药器
- 将一次性注射器回拉至所需体积，该体积可能因应用而异。
注意：对于小鼠的肺内给药，0.15-0.6 mL 通常是合适的 8,9。 - 将注射器连接到聚丙烯或PTFE针头上的鲁尔锁上（图2D）。
- 将加药器的针端插入所需的目标中。为了分析粉末含量和重现性，将针头穿过穿孔的橡胶隔膜或石蜡膜插入含有少量（例如，1-5 mL）水和/或有机溶剂（例如乙醇）的小瓶中，溶剂特性和体积取决于活性药物成分（API）的物理特性和定量方法。
- 为了给小鼠递送，按照既定的方案9,15将针头插入麻醉小鼠气管的第一个支气管分叉处。
- 用力按下注射器，将粉末从设备中排出到收集瓶中（图2E）。
注意：将粉末输送到小鼠肺部必须遵循相同的技术。 - 为了分析收集瓶的内容物和重现性，请对特定 API 使用适当的分析方法，例如紫外可见光 （UV-Vis） 分光光度法或高效液相色谱 （HPLC）。
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Representative Results
在用于本研究之前，已确定各种喷雾干燥粉末的气溶胶性能。空气动力学粒度分布 （APSD） 由质量中值空气动力学直径 （MMAD） 和几何标准差 （GSD） 描述，前者表示在第 50个百分位数 （d50） 处将分布一分为二的尺寸，后者反映了分布的广度。GSD 由第 80 个百分位数处的空气动力学直径的平方根除以第 16个百分位数 （d84/d16）1/2 处的平方根定义，其中百分位数代表质量相对于粒径的对数正态分布的平均值两侧的一个标准差。
考虑使用本文所述的加药器递送四种具有代表性的喷雾干燥粉末。喷雾干燥 （SD） 粉末，包括替加环素 （SD-1）3、硫酸卷曲霉素 （SD-2）16、大观霉素 1599 （SD-3）9 和含赋形剂的硫酸沙丁胺醇 （SD-4） API，代表了一系列抗菌和支气管扩张剂配方，专为各种应用而开发。在用于加药器之前，按照USP通则第<601>使用低阻力干粉吸入器和高性能级联撞击器确定四种粉末的空气动力学粒度分布（参见材料表）。SD-1、SD-2、SD-3 和 SD-4 的 MMAD 分别为 2.6 ± 0.1 μm （GSD = 2.1 ± 0.1）、1.7 ± 0.1 μm （GSD = 2.4 ± 0.1）、1.7 ± 0.4 μm （GSD = 2.7 ± 0.5） 和 2.2 ± 0.2 μm （GSD = 2.1 ± 0.3）。SD-1、SD-2、SD-3 和 SD-4 的微粒分数（<4.46 μm）分别为68%±1%±1%、77%±1%和68%±2%。使用图4中的扫描电子显微镜观察四种粉末。
将每种粉末制备成单独的30-35mg等分试样，并将加药器的不锈钢针（21G）夯实到粉末床中1至4次。将加液器（21 G 不锈钢内针和 16 G 聚丙烯外针）启动到装有 5 mL 水的密封小瓶中。轻轻混合后，通过紫外-可见分光光度法（SD-1、SD-2、SD-3 和 SD-4 的 λ = 351 nm、268 nm、271 nm 和 230 nm）分析溶液，以监测从加药器释放的粉末剂量。图5显示了作为粉末床中夯实剂数量的函数的递送剂量。值得注意的是，所有喷雾干燥粉末都显示出线性剂量反应 （R2 > 0.97），使用这些剂量器从 1 到 4 次夯实。对于SD-1，一次夯实导致209±99μg的粉末递送，随后每次夯实增加~130μg（图5A）。其他粉末也表现出类似的趋势，第一次夯实比随后的夯实产生更大的粉末剂量。对于SD-2（图5B）、SD-3（图5C）和SD-4（图5D），一次夯实导致268 ± 88 μg、332 ± 95 μg 和 412 ± 72 μg 的递送，随后每次夯实添加少量 170-230 μg。每种粉末的线性响应允许控制载药量，四种粉末（SD-1、SD-2、SD-3 和 SD-4）分别显示出 210-570 μg、270-780 μg、330-870 μg 和 410-1120 μg 的可实现范围。虽然都是线性的和可重复的，但从一种喷雾干燥粉末到另一种喷雾干燥粉末的差异突出了表征从计量器中释放的特定目标干粉的剂量的必要性。
还准备了较小直径的给药器来评估它们在较小/年轻小鼠中的使用。上一段中描述的初始设计是使用 16 G 聚丙烯外针（外径 = 1.7 mm）制备的。正如 Stewart 等人所报道的那样，这些加料器中使用的 21 G 不锈钢针头也与 20 G PTFE 外针（外径 = 1.2 mm）兼容9 图 6A 显示了 21 G 不锈钢/20 G PTFE 加料器与粉末配方 SD-1 的使用。与21 G不锈钢/ 16 G聚丙烯剂量器相比，观察到可实现的剂量略有减少，初始夯实导致剂量为111±62μg，随后每次夯实增加~96μg（图6A）。与聚丙烯针（3.81 cm）相比，PTFE针的长度（5.08 cm）增加，并且针的柔韧性可能导致粉末损失。还评估了较小直径的聚丙烯外针，但需要较小直径的不锈钢内针。18 G（外径 = 1.3 mm）和 20 G（外径 = 1.0 mm）聚丙烯针分别需要 22 G 和 25 G 不锈钢内针。正如预期的那样，减小内针直径会降低可实现的剂量。图 6B 所示的 22 G 不锈钢/18 G 聚丙烯加料器显示，SD-1 剂量为 82 ± 31 μg，一次夯实，随后每次夯实使剂量增加 ~41 μg。 图 6C 所示的 25 G 不锈钢/20 G 聚丙烯加料器显示出较小的 SD-1 剂量，为 29 ± 17 μg，额外的夯实物使递送剂量最小增加 （~4 μg/tamp）。图6D显示了使用4张粉末制剂SD-1时本文评估的四种加药器系统的比较，并强调加药器系统可以定制以满足动物的剂量需求和年龄/大小。
图1：改良的针头制备。 （A） 改良不锈钢针，塑料鲁尔锁部分修剪至 2-3 毫米。 （B-C） 将改性不锈钢针插入聚丙烯针中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：粉末装载和驱动示意图。 （A-E）粉末装载、加料器组装和从组装的加料器驱动示意图。空气被迫通过内部不锈钢针头，将粉末从计量器中分配出来。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：去除内针外部 的粉末残留物。 （A） 改性不锈钢针，粉末保留在针的外侧，然后捣固到粉末床中。（B） 用低绒擦拭器轻轻擦拭后表面清洁的改性不锈钢针。（C） 含有粉末的针头内部的可视化。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：喷雾干燥粉末。 由四种不同API制备的喷雾干燥粉末的代表性扫描电子显微镜图像。干粉包括 （A） SD-1、（B） SD-2、（C） SD-3 和 （D） SD-4。所有成像均以 10,000 倍放大倍率进行，比例尺等于 5 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：输送粉末的定量。 从加药器（21 G 不锈钢内针和 16 G 聚丙烯外针）输送到四种喷雾干燥粉末的粉末床中的粉末质量，包括 （A） SD-1、（B） SD-2、（C） SD-3 和 （D） SD-4（n ≥ 3，平均值±标准偏差）。包括斜率，表示每个装载夯实分散的粉末质量，以及与线性曲线的拟合优度 （R2）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：使用较小直径针头输送的粉末的定量分析。 从使用较小直径针头制备的加料器输送的 SD-1 粉末质量，包括 （A） 21 G 不锈钢内针和 20 G PTFE 外针，（B） 22 G 不锈钢内针和 18 G 聚丙烯外针，以及 （C） 25 G 不锈钢内针和 20 G 聚丙烯外针（n ≥ 3，平均值±标准偏差）。包括斜率，表示每个装载夯实分散的粉末质量，以及与线性曲线的拟合优度 （R2）。对 y 轴进行缩放以适合每个图中的数据。（D）中显示了在4次夯实到粉末床中后从所有剂量器类型输送的SD-1剂量的比较。缩写包括：SS，不锈钢;PP，聚丙烯;PTFE，聚四氟乙烯。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
由于小鼠是专性鼻呼吸器，通过被动吸入进行初步概念验证研究使效率和剂量估计具有挑战性，因为粉末必须以取决于颗粒特性和粉末分散效率的方式通过鼻子和喉咙7,8,14。本文开发的给药器的使用绕过鼻子和喉咙，将给药器插入第一支气管分叉处9，并将全剂量直接输送到小鼠的肺部，从而为初步研究提供更精确的剂量控制。这些给药器代表了一种可重复和可定制的给药方法，用于气管内给药给小鼠和体外评估粉末性能。
使用21 G不锈钢和16 G聚丙烯针头的给药器能够装载和输送200-1100μg，具体取决于配方和夯实数量，这通常是小鼠的合适剂量。对于某些配方，例如 SD-1 和 SD-2，可以超过 4 次夯实，这些配方可以保持至少 5 次夯实的粉末分散，但对于 SD-3 和 SD-4 等配方，超过 4 次夯实的负载变得具有挑战性。如果进一步捣固后粉末在内针中过于堆积，则 0.15-0.6 mL 的推注空气不足以使粉末脱落和分散。虽然 1-2 mL 的更大体积可能能够分散这些加载的粉末，但这些体积可能会对小鼠造成创伤，应避免 8,15。在所有情况下，都应轻柔地进行夯实，以尽量减少这种影响。因此，这种效果将负荷限制在 600-1100 mg 以上，具体取决于配方。虽然适用于小鼠，但对于需要更大剂量的动物，应使用更大的储液器型加药器10。还开发了较小直径的加料器（外径 1.0-1.3 mm），并使用 SD-1 进行了评估。当将 21 G 不锈钢内针与 20 G PTFE 外针组合时，观察到减小尺寸剂量器的最大剂量。Stewart等人以前曾使用该给药系统对小鼠进行过药代动力学研究，突出了其成功使用9。使用聚丙烯外针也可以使用更小的剂量器，但导致可实现的剂量较低，突出了系统的局限性。剂量受针头直径的强烈影响，并且报告的 21 G 不锈钢/16 G 聚丙烯剂量器的更大剂量可能无法用于太小/太年轻的小鼠。
经证实，加药器系统可在本文讨论的四种喷雾干燥粉末中工作。然而，本研究中的所有颗粒系统都是具有均匀堆积密度的低密度工程颗粒。在无法保证粉末床均匀性的其他颗粒系统中的功效尚未得到评估，并且可能无法产生可重复的输送。在使用加药系统之前，需要根据具体情况进行额外评估。
我们描述了使用精密切片锯来准备内部计量针，但可以使用带式砂光机。如果使用带式砂光机，重要的是将较小的针或金属丝滑过内部不锈钢针，以确保针是打开的并且在此过程中没有被遮挡。在使用精密切片锯时，这并没有被注意到是一个问题。
加料器成本低且易于制备，便于将其用作一次性给药设备，无需在两次使用之间重新装载设备并进行清洁/灭菌。干粉床可以根据API和配方储存要求进行预填充和储存，因此用户只需在组装和启动之前将针头夯实到粉末中即可。粉末床管的填充可以在有天平和罩的实验室环境中进行，需要动物程序实验室10中存在的最少设备。该给药器设计用于小鼠的初步概念验证研究，并展示了准确且可重复的加载。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
作者希望感谢美国国立卫生研究院（R01AI155922）的资助。显微镜在教堂山分析和纳米制造实验室 （CHANL） 进行，该实验室是北卡罗来纳州三角研究纳米技术网络 RTNN 的成员，该网络由美国国家科学基金会 Grant ECCS-1542015 支持，作为国家纳米技术协调基础设施 NNCI 的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AR1140 | Any analytical balance with sufficient range can be used |
| Blunt stainless-steel needle, 1 inch, 21 G | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Blunt stainless-steel needle, 1 inch, 22 G | McMaster-Carr | 75165A683 | |
| Blunt stainless-steel needle, 1 inch, 25 G | McMaster-Carr | 75165A687 | |
| Disposable syringe with luer lock (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-30 | 3-mL syringes can also be used |
| Female BALB/c mice | Charles River, Wilmington, MA, USA | ||
| High-performance cascade impactor | Next Generation Impactor | Apparatus 5 | |
| Lab film (e.g., Parafilm) | Fisher Scientific | S37440 | |
| Low-lint wiper (e.g., Kimwipes) | Kimberly-Clark Professional | 34133 | |
| Low-resistance dry powder inhaler | RS01 mod 7 | ||
| Polypropylene needle, 1.5 inch, 16 G | McMaster-Carr | 6934A111 | |
| Polypropylene needle, 1.5 inch, 18 G | McMaster-Carr | 6934A53 | |
| Polypropylene needle, 1.5 inch, 20 G | McMaster-Carr | 6934A55 | |
| Precision sectioning saw | TedPella | 812-300 | Belt sander can be used as an alternative |
| PTFE needle, 2 inch, 20 G | McMaster-Carr | 75175A694 | |
| USP General Chapter <601> | http://www.uspbpep.com/usp31/v31261/usp31nf26s1_c601.asp |
References
- Wu, X., Li, X., Mansour, H. M. Surface analytical techniques in solid-state particle characterization for predicting performance in dry powder inhalers. KONA Powder and Particle Journal. 28, 3-18 (2010).
- Maloney, S. E., Mecham, J. B., Hickey, A. J. Performance testing for dry powder inhaler products: towards clinical relevance. KONA Powder and Particle Journal. 40, 172-185 (2023).
- Maloney, S. E., et al. Spray dried tigecycline dry powder aerosols for the treatment of nontuberculous mycobacterial pulmonary infections. Tuberculosis. 139, 102306 (2023).
- Kaur, J., et al. A hand-held apparatus for "nose-only" exposure of mice to inhalable microparticles as a dry powder inhalation targeting lung and airway macrophages. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 34 (1), 56-65 (2008).
- Yi, J., et al. Whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposures. Journal of Visualized Experiments. (75), e50263 (2013).
- Chung, Y. H., Han, J. H., Lee, Y. -H. A study on subchronic inhalation toxicology of 1-chloropropane. Toxicological Research. 31 (4), 393-402 (2015).
- Kuehl, P. J., et al. Regional particle size dependent deposition of inhaled aerosols in rats and mice. Inhalation Toxicology. 24 (1), 27-35 (2012).
- Manser, M., et al. Design considerations for intratracheal delivery devices to achieve proof-of-concept dry powder biopharmaceutical delivery in mice. Pharmaceutical Research. 40, 1165-1176 (2023).
- Stewart, I. E., et al. Development and characterization of a dry powder formulation for anti-tuberculosis drug spectinamide 1599. Pharmaceutical Research. 36 (9), 136 (2019).
- Durham, P. G., et al. Disposable dosators for pulmonary insufflation of therapeutic agents to small animals. Journal of Visualized Experiments. (121), e55356 (2017).
- Miwata, K., et al. Intratracheal administration of siRNA dry powder targeting vascular endothelial growth factor inhibits lung tumor growth in mice. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 12, 698-706 (2018).
- Duret, C., et al. Pharmacokinetic evaulation in mice of amorphous itraconazole-based dry powder formulations for inhalation with high bioavailability and extended lung retention. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 46-54 (2014).
- Maloney, S. E., et al. Preparation strategies of the anti-mycobacterial drug bedaquiline for intrapulmonary routes of administration. Pharmaceuticals. 16 (5), 729 (2023).
- Price, D. N., Kunda, N. K., Muttil, P. Challenges associated with the pulmonary delivery of therapeutic dry powders for preclinical testing. KONA Powder and Particle Journal. 36, 129-144 (2019).
- Qiu, Y., Liao, Q., Chow, M. Y. T., Lam, J. K. W. Intratracheal administration of dry powder formulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61469 (2020).
- Fiegel, J., et al. Preparation and in vivo evaluation of a dry powder for inhalation of capreomycin. Pharmaceutical Research. 25 (4), 805-811 (2008).
