Summary
O desenvolvimento farmacêutico de pó seco requer testes in vivo confiáveis, muitas vezes usando um modelo murino. A tecnologia do dispositivo para fornecer aerossóis de pó seco com precisão e reprodutibilidade para camundongos é restrita. Este estudo apresenta dosadores descartáveis para liberação de drogas pulmonares em doses relevantes para camundongos, auxiliando na pesquisa inicial de prova de conceito.
Abstract
Os inaladores de pó seco oferecem inúmeras vantagens para a entrega de medicamentos aos pulmões, incluindo formulações estáveis de medicamentos em estado sólido, portabilidade do dispositivo, dosagem e dosagem em bolus e um mecanismo de dispersão livre de propelentes. Para desenvolver produtos farmacêuticos de aerossol em pó seco, testes robustos in vivo são essenciais. Normalmente, os estudos iniciais envolvem o uso de um modelo murino para avaliação preliminar antes da realização de estudos formais em espécies animais maiores. No entanto, uma limitação significativa nessa abordagem é a falta de tecnologia adequada para fornecer pós secos de forma precisa e reprodutível a pequenos animais, dificultando a utilidade desses modelos. Para enfrentar esses desafios, dosadores de seringas descartáveis foram desenvolvidos especificamente para administração intrapulmonar de pós secos em doses apropriadas para camundongos. Estes dosadores carregam e fornecem uma quantidade pré-determinada de pó obtido a partir de um leito de pó de densidade aparente uniforme. Esse controle discreto é obtido inserindo-se uma agulha romba a uma profundidade fixa (tamping) no leito de pó, retirando-se uma quantidade fixa a cada vez. Notavelmente, este padrão de dosagem provou ser eficaz para uma gama de pós secos por pulverização. Em experimentos envolvendo quatro diferentes modelos de pós secos por pulverização, os dosadores demonstraram a capacidade de atingir doses dentro da faixa de 30 a 1100 μg. A dose atingida foi influenciada por fatores como o número de tamponamentos, o tamanho da agulha dosadora e a formulação específica utilizada. Um dos principais benefícios desses dosadores é sua facilidade de fabricação, tornando-os acessíveis e econômicos para a entrega de pós secos a camundongos durante estudos iniciais de prova de conceito. A natureza descartável dos dosadores facilita o uso em salas de procedimentos de animais, onde a limpeza e recarga de sistemas reutilizáveis e materiais de pesagem é inconveniente. Assim, o desenvolvimento de dosadores de seringas descartáveis abordou um obstáculo significativo na entrega de pó seco murino para estudos de prova de conceito, permitindo que os pesquisadores conduzissem estudos preliminares mais precisos e reprodutíveis em modelos animais pequenos para liberação pulmonar de drogas.
Introduction
O uso de inaladores de pó seco (IPS) para liberação pulmonar de fármacos tem despertado interesse significativo nas últimas três décadas devido à eliminação global dos propelentes clorofluorcarbono 1,2. As IPPs oferecem inúmeros benefícios em relação a outros sistemas de liberação pulmonar, como inaladores dosimetrados e nebulizadores, incluindo estabilidade da formulação, portabilidade, facilidade de uso e mecanismos de dispersão sem propelente2. No entanto, antes de mover os produtos de DPI para a tradução clínica, vários estudos pré-clínicos devem ser conduzidos, muitos dos quais são inicialmente concluídos usando um modelo murino. No entanto, as tecnologias disponíveis para fornecer pós secos de forma precisa e reprodutível a pequenos animais são limitadas.
Métodos comuns para administração de pós secos a pequenos animais, como camundongos, incluem inalação passiva 3,4,5,6,7 e administração direta 8,9,10,11,12,13. A inalação passiva normalmente requer uma câmara personalizada que utiliza grandes doses de pó seco por pulverização para preparar uma nuvem de aerossol suficiente. Como camundongos são respiradores nasais obrigatórios14, a administração por inalação passiva requer que o pó percorra o nariz e a garganta para chegar aos pulmões, sendo necessária a manutenção de uma nuvem de aerossol com propriedades aerodinâmicas de partículas suficientes 7,8. Embora seja uma técnica útil e fisiologicamente mais relevante do que a administração direta devido à inalação como resultado da respiração normal14, ela pode não ser adequada para estudos iniciais em que a massa de pó é limitada.
Alternativamente, vários dispositivos de entrega intratraqueal para entrega direta de pó seco têm sido relatados 8,9,10,11,12,13. Os dispositivos intratraqueais contornam o nariz e a garganta, entregando o pó diretamente aos pulmões e permitindo um controle mais fino sobre a dose administrada14. Além disso, alguns dispositivos, especialmente aqueles preparados usando um procedimento de tamping loading9, podem ser preparados com quantidades menores, o que é uma consideração importante para estudos iniciais de prova de conceito. A falta de dispositivos de liberação intratraqueal universalmente disponíveis tem dificultado seu potencial de uso, limitando a disponibilidade e levando a diferenças interlaboratoriais14. Neste estudo, propomos um dosador simples, barato e descartável para entrega intratraqueal que pode ser utilizado para estudos murinos de prova de conceito no desenvolvimento de aerossóis de pó seco.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal e a Política de Serviços de Saúde Pública sobre Cuidados Humanizados e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee. Camundongos BALB/c fêmeas saudáveis, ~6-8 semanas de idade, receberam o conteúdo de pó seco de um dosador por aerossol intrapulmonar para um estudo farmacocinético usando pós secos de spectinamida 15999. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação do dosador e dos componentes de enchimento
- Corte a porção plástica luer de uma agulha de aço inoxidável rombo de 2,54 cm (1 polegada) (21-25 G) usando uma serra de seccionamento de precisão (ver Tabela de Materiais) ou uma lixadeira de correia até 2-3 mm dos restos plásticos (Figura 1A e Figura 2A).
NOTA: Se for utilizada uma lixadeira de correia, a agulha de aço inoxidável poderá ter de ser limpa utilizando uma agulha ou fio mais pequeno para remover as possíveis obstruções criadas. - Cortar a ponta (1-1,5 cm) de um tubo de centrífuga cônico de 0,6 mL. Encha a ponta do tubo com 30-35 mg de pó.
NOTA: Consulte Resultados Representativos para obter os detalhes dos pós de exemplo usados para o presente estudo. O desempenho do aerossol em pó deve ser avaliado antes do uso nesta aplicação seguindo a metodologia padrão, conforme descrito no Capítulo Geral da USP <601> (consulte a Tabela de Materiais). - Se armazenar e/ou transportar o pó, utilize a tampa do tubo (cortada) para fechar o frasco para injetáveis. Selagem com filme de parafina para minimizar a exposição do pó à umidade ambiente se estiver armazenando e/ou transportando.
2. Carregamento e montagem de dosadores
- Tampar a agulha de aço inoxidável aparada no leito de pó na ponta do tubo da centrífuga cônica de 0,6 mL quantas vezes forem necessárias para atingir a dose desejada (Figura 2B). Limpe suavemente as laterais da agulha de aço inoxidável com um limpador de fiapos baixo para remover qualquer excesso de pó (Figura 3).
- Insira delicadamente a agulha de aço inoxidável carregada em uma agulha de polipropileno de 3,81 cm (1,5 polegadas) ou politetrafluoretileno (PTFE) de 5,08 cm (2 polegadas) (16-20 G) (ver Tabela de Materiais) para evitar o deslocamento de qualquer pó (Figura 1B, C e Figura 2C).
3. Dosadores de acionamento
- Retire uma seringa descartável para o volume desejado, que pode variar de acordo com a aplicação.
NOTA: Para administração intrapulmonar em camundongos, 0,15-0,6 mL é tipicamente apropriado 8,9. - Fixe a seringa à trava luer da agulha de polipropileno ou PTFE (Figura 2D).
- Insira a extremidade da agulha do dosador no alvo desejado. Para analisar o teor e a reprodutibilidade do pó, insira a agulha através de um septo de borracha perfurado ou filme de parafina em um frasco contendo uma pequena quantidade (por exemplo, 1-5 mL) de água e/ou solvente orgânico (por exemplo, etanol), com identidade e volume do solvente dependentes das características físicas do ingrediente farmacêutico ativo (IFA) e do método de quantificação.
- Para o nascimento em camundongos, inserir a agulha até a primeira bifurcação brônquica da traqueia de camundongos anestesiados, seguindo protocolos estabelecidos 9,15.
- Pressione a seringa com força, expelindo o pó para fora do dispositivo para o frasco de coleta (Figura 2E).
NOTA: A mesma técnica deve ser seguida para entregar o pó aos pulmões murinos. - Para analisar o conteúdo e a reprodutibilidade do frasco de coleta, utilize um método analítico apropriado para o IFA específico, como espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis) ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
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Representative Results
O desempenho do aerossol de vários pós secos por pulverização foi estabelecido antes do uso neste estudo. A distribuição aerodinâmica granulométrica (APSD) foi descrita pelo diâmetro aerodinâmico mediano de massa (MMAD), representando o tamanho que divide a distribuição em doisno percentil 50 (d50), e o desvio padrão geométrico (GSD), refletindo a amplitude da distribuição. A GSD é definida pela raiz quadrada do diâmetro aerodinâmico no percentil 80 dividido pela raiz quadrada do percentil 16 (d84/d16)1/2, comos percentis representando um desvio padrão em cada lado da média para uma distribuição log-normal da massa em relação ao tamanho da partícula.
Quatro pós secos por atomização representativos foram considerados para entrega utilizando os dosadores aqui descritos. Os pós secos por pulverização (SD), incluindo tigeciclina (SD-1)3, sulfato de capreomicina (SD-2)16, espectinamida 1599 (SD-3)9 e sulfato de salbutamol (SD-4) com excipientes, representam uma gama de formulações antibacterianas e broncodilatadoras que foram desenvolvidas para uma variedade de aplicações. Antes do uso nos dosadores, a distribuição aerodinâmica do tamanho das partículas foi determinada para os quatro pós usando um inalador de pó seco de baixa resistência e um impactador em cascata de alto desempenho seguindo o Capítulo Geral da USP <601> (ver Tabela de Materiais). As MMADs de SD-1, SD-2, SD-3 e SD-4 foram 2,6 ± 0,1 μm (GSD = 2,1 ± 0,1), 1,7 ± 0,1 μm (GSD = 2,4 ± 0,1), 1,7 ± 0,4 μm (GSD = 2,7 ± 0,5) e 2,2 ± 0,2 μm (GSD = 2,1 ± 0,3), respectivamente. Os quatro pós exibiram frações de partículas finas (<4,46 μm), em relação à dose emitida, de 68% ± 1%, 82% ± 1%, 77% ± 1% e 68% ± 2% para SD-1, SD-2, SD-3 e SD-4, respectivamente. Os quatro pós são visualizados por microscopia eletrônica de varredura na Figura 4.
Cada pó foi preparado em alíquotas separadas de 30-35 mg, e a agulha de aço inoxidável (21 G) do dosador foi amortecida no leito de pó 1 a 4 vezes. O dosador (agulha interna de aço inoxidável 21 G e agulha externa de polipropileno 16 G) foi acionado em um frasco selado contendo 5 mL de água. Após mistura suave, a solução foi analisada por espectrofotometria UV-Visível (λ = 351 nm, 268 nm, 271 nm e 230 nm para SD-1, SD-2, SD-3 e SD-4, respectivamente) para monitorar a dose de pó liberada do dosador. A dose administrada em função do número de tampão no leito de pó é apresentada na Figura 5. Notavelmente, todos os pós secos por pulverização demonstraram uma dose-resposta linear (R2 > 0,97) de 1 a 4 tamps com esses dosadores. Para SD-1, um tampão levou a uma liberação de pó de 209 ± 99 μg, com cada tampão subsequente adicionando ~130 μg (Figura 5A). Os outros pós exibiram tendências semelhantes, com o primeiro tampão incorrendo em uma dose maior de pó do que os tampões subsequentes. Para SD-2 (Figura 5B), SD-3 (Figura 5C) e SD-4 (Figura 5D), um tampão levou a uma liberação de 268 ± 88 μg, 332 ± 95 μg e 412 ± 72 μg, com cada tampão subsequente adicionando uma quantidade menor de 170-230 μg. A resposta linear para cada pó permite o controle no carregamento do fármaco, com os quatro pós, SD-1, SD-2, SD-3 e SD-4, demonstrando faixas alcançáveis de 210-570 μg, 270-780 μg, 330-870 μg e 410-1120 μg, respectivamente. Embora lineares e reprodutíveis, as diferenças observadas de um pó seco por aspersão para outro evidenciam a necessidade de caracterizar a dose liberada dos dosadores para o pó seco específico de interesse.
Dosadores de menor diâmetro também foram preparados para avaliar seu uso em camundongos menores/mais jovens. O desenho inicial descrito no parágrafo anterior foi elaborado com agulha externa de polipropileno 16G (diâmetro externo = 1,7 mm). A agulha de aço inoxidável 21G utilizada nesses dosadores também é compatível com uma agulha externa de PTFE 20G (diâmetro externo = 1,2 mm), conforme relatado por Stewart et al.9 A Figura 6A mostra o uso de dosadores de 21 G de aço inoxidável/20 G de PTFE com formulação em pó SD-1. Observa-se uma ligeira diminuição na dose alcançável em comparação com os dosadores de polipropileno de aço inoxidável 21 G/16 G, com o tampão inicial resultando em uma dose de 111 ± 62 μg e cada tampão subsequente adicionando ~96 μg (Figura 6A). O aumento do comprimento da agulha de PTFE (5,08 cm) em relação à agulha de polipropileno (3,81 cm) e a flexibilidade da agulha podem levar à perda de pó. Agulhas externas de polipropileno de menor diâmetro também foram avaliadas, mas necessitaram de agulhas internas de aço inoxidável de menor diâmetro. As agulhas de polipropileno 18 G (diâmetro externo = 1,3 mm) e 20 G (diâmetro externo = 1,0 mm) exigiram agulhas internas de aço inoxidável de 22 G e 25 G, respectivamente. Como esperado, a diminuição do diâmetro interno da agulha diminuiu a dose alcançável. Os dosadores de polipropileno 22 G de aço inoxidável/18 G, exibidos na Figura 6B, demonstraram uma dose SD-1 de 82 ± 31 μg com um tampo, com cada tampão subsequente aumentando a dose em ~41 μg. Os dosadores de polipropileno 25 G de aço inoxidável/20 G, exibidos na Figura 6C, demonstraram uma dose menor de SD-1 de 29 ± 17 μg, com tampão adicional aumentando minimamente a dose liberada (~4 μg/tamp). A Figura 6D apresenta uma comparação dos quatro sistemas dosadores aqui avaliados ao utilizar 4 tampão de formulação em pó SD-1 e destaca que o sistema dosador pode ser personalizado para atender às necessidades de dosagem e idade/tamanho do animal.
Figura 1: Preparo modificado da agulha. (A) Agulha de aço inoxidável modificada com porção plástica luer lock aparada para 2-3 mm. (B-C) Inserção de agulha modificada de aço inoxidável na agulha de polipropileno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema de carregamento e acionamento do pó. (A-E) Esquema de carregamento de pó, montagem do dosador e acionamento do dosador montado. O ar é forçado através da agulha interna de aço inoxidável, dispensando o pó para fora do dosador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Remoção de resíduo de pó de fora da agulha interna. (A) Agulha de aço inoxidável modificada com pó retido na parte externa da agulha após tamping no leito de pó. (B) Agulha de aço inoxidável modificada com superfície limpa após limpeza suave com limpador de fiapos baixo. (C) Visualização do interior da agulha contendo pó. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Pós secos por pulverização. Imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura de pós secos por pulverização preparados a partir de quatro IFAs distintos. Os pós secos incluem (A) SD-1, (B) SD-2, (C) SD-3 e (D) SD-4. Todas as imagens foram realizadas em aumento de 10.000x, com barra de escala igual a 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação do pó entregue. Massa de pó liberada dos dosadores (agulha interna de aço inoxidável 21 G e agulha externa de polipropileno 16 G) em função de tampão em um leito de pó de quatro pós secos por pulverização, incluindo (A) SD-1, (B) SD-2, (C) SD-3 e (D) SD-4 (n ≥ 3, média ± desvio padrão). A inclinação, demonstrando a massa de pó dispersa por tampão de carga, e a bondade de ajuste (R2) a uma curva linear são incluídas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Quantificação do pó liberado com agulhas de menor diâmetro. Massa de pó SD-1 fornecida a partir de dosadores preparados com agulhas de menor diâmetro, incluindo (A) agulha interna de aço inoxidável 21 G com agulha externa de PTFE 20 G, (B) agulha interna de aço inoxidável 22 G com agulha externa de polipropileno 18 G e (C) agulha interna de aço inoxidável 25 G com agulha externa de polipropileno 20 G (n ≥ 3, média ± desvio padrão). A inclinação, demonstrando a massa de pó dispersa por tampão de carga, e a bondade de ajuste (R2) a uma curva linear são incluídas. O eixo y é dimensionado para se ajustar aos dados em cada figura. Uma comparação da dose de SD-1 liberada de todos os tipos de dosadores após 4 tamps no leito de pó é mostrada em (D). As abreviaturas incluem: SS, aço inoxidável; PP, polipropileno; PTFE, politetrafluoretileno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como camundongos são respiradores nasais obrigatórios, a administração via inalação passiva para estudos iniciais de prova de conceito torna a eficiência e a estimativa da dose desafiadoras, pois o pó deve passar pelo nariz e garganta de forma dependente das propriedades das partículas e da eficiência de dispersão do pó 7,8,14. O uso dos dosadores aqui desenvolvidos contorna o nariz e a garganta, com o dosador inserido na primeira bifurcação brônquica9, e administra a dose plena diretamente nos pulmões de camundongos, permitindo um controle de dose mais preciso para estudos iniciais. Estes dosadores representam um método de liberação reprodutível e personalizável para administração intratraqueal em camundongos e avaliação in vitro do desempenho do pó.
Os dosadores usando agulhas de aço inoxidável 21 G e polipropileno 16 G foram capazes de carregar e fornecer 200-1100 μg, dependendo da formulação e do número de absorventes, que é tipicamente uma dose adequada para camundongos. O carregamento além de 4 tampão foi possível para certas formulações, como SD-1 e SD-2, que retiveram a dispersão do pó até pelo menos 5 tamponamentos, mas o carregamento além de 4 tampão tornou-se desafiador para formulações como SD-3 e SD-4. Se o pó ficasse muito embalado na agulha interna após nova tamponamento, um bolus de 0,15-0,6 mL de ar era insuficiente para desalojar e dispersar o pó. Embora um volume maior de 1-2 mL possa ser capaz de dispersar esses pós carregados, esses volumes podem causar trauma em camundongos e devem ser evitados 8,15. Em todos os casos, a doma deve ser realizada suavemente para minimizar esse efeito. Como resultado, este efeito limita a carga acima de 600-1100 mg, dependendo da formulação. Embora adequado para camundongos, um dosador maior do tipo reservatório deve ser usado para animais que necessitam de uma dose maior10. Dosadores de menor diâmetro (1,0-1,3 mm de diâmetro externo) também foram desenvolvidos e avaliados com SD-1. A maior dose para um dosador de tamanho reduzido foi observada quando se combinou uma agulha interna de aço inoxidável 21 G com uma agulha externa de PTFE 20 G. Estudos farmacocinéticos em camundongos foram realizados anteriormente por Stewart e col. com esse sistema dosador, destacando seu uso bem-sucedido9. Dosadores menores também foram possíveis usando agulhas externas de polipropileno, mas resultaram em doses mais baixas alcançáveis, destacando uma limitação no sistema. A dose é fortemente influenciada pelo diâmetro da agulha, e as doses maiores relatadas para os dosadores de polipropileno 21 G aço inoxidável/16 G podem não ser possíveis para uso em camundongos muito pequenos/jovens.
Os sistemas de dosagem são confirmados para funcionar através dos quatro pós secos por pulverização discutidos aqui. No entanto, todos os sistemas de partículas neste estudo são partículas de engenharia de baixa densidade que são de densidade aparente uniforme. A eficácia em outros sistemas de partículas onde a uniformidade do leito de pó não pode ser garantida ainda não foi avaliada e pode não resultar em liberação reprodutível. Será necessária uma avaliação adicional caso a caso antes da utilização do sistema dosador.
Descrevemos o uso de uma serra seccionadora de precisão para o preparo das agulhas dosadoras internas, mas uma lixadeira de correia pode ser usada no local. Se for usada uma lixadeira de cinto, é importante deslizar uma agulha ou fio menor através da agulha interna de aço inoxidável para garantir que a agulha esteja aberta e não tenha sido ocluída no processo. Isso não foi notado como um problema ao usar a serra de seccionamento de precisão.
O baixo custo e a facilidade de preparo dos dosadores facilitam seu uso como descartáveis de uso único, onde não é necessário recarregar o dispositivo e limpar/esterilizar entre os usos. Os leitos do pó seco podem ser pré-preenchidos e armazenados com base nos requisitos de armazenamento API e formulação, exigindo que o usuário apenas coloque a agulha no pó antes da montagem e atuação. O enchimento do tubo do leito de pó pode ser realizado em um ambiente de laboratório onde uma balança e capuz estão disponíveis, exigindo o mínimo de equipamento para estar presente no laboratório de procedimentos com animais10. Os dosadores são projetados para estudos preliminares de prova de conceito em camundongos e demonstram carregamento preciso e reprodutível.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem o financiamento do National Institutes of Health (R01AI155922). A microscopia foi realizada no Chapel Hill Analytical and Nanofabrication Laboratory (CHANL), membro da North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network, RTNN, que é apoiada pela National Science Foundation, Grant ECCS-1542015, como parte da National Nanotechnology Coordinated Infrastructure, NNCI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AR1140 | Any analytical balance with sufficient range can be used |
| Blunt stainless-steel needle, 1 inch, 21 G | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Blunt stainless-steel needle, 1 inch, 22 G | McMaster-Carr | 75165A683 | |
| Blunt stainless-steel needle, 1 inch, 25 G | McMaster-Carr | 75165A687 | |
| Disposable syringe with luer lock (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-30 | 3-mL syringes can also be used |
| Female BALB/c mice | Charles River, Wilmington, MA, USA | ||
| High-performance cascade impactor | Next Generation Impactor | Apparatus 5 | |
| Lab film (e.g., Parafilm) | Fisher Scientific | S37440 | |
| Low-lint wiper (e.g., Kimwipes) | Kimberly-Clark Professional | 34133 | |
| Low-resistance dry powder inhaler | RS01 mod 7 | ||
| Polypropylene needle, 1.5 inch, 16 G | McMaster-Carr | 6934A111 | |
| Polypropylene needle, 1.5 inch, 18 G | McMaster-Carr | 6934A53 | |
| Polypropylene needle, 1.5 inch, 20 G | McMaster-Carr | 6934A55 | |
| Precision sectioning saw | TedPella | 812-300 | Belt sander can be used as an alternative |
| PTFE needle, 2 inch, 20 G | McMaster-Carr | 75175A694 | |
| USP General Chapter <601> | http://www.uspbpep.com/usp31/v31261/usp31nf26s1_c601.asp |
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