Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성
Summary
우리는 Xenopus laevis 올챙이의 망막 손상 또는 망막 변성을 유도하기 위한 몇 가지 프로토콜을 개발했습니다. 이 모델은 망막 재생 메커니즘을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다.
Abstract
망막 신경 퇴행성 질환은 실명의 주요 원인입니다. 연구되고 있는 수많은 치료 전략 중에서, 자가 회복을 자극하는 것이 최근 특히 매력적인 것으로 떠올랐다. 망막 복구를 위한 세포의 관심 원천은 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)로, 줄기세포의 잠재력과 아남니오트의 놀라운 재생 능력을 가지고 있습니다. 그러나 이 잠재력은 포유류에서 매우 제한적입니다. 재생 능력이 있는 동물 모델에서 망막 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 연구하면 포유류 뮐러 세포의 망막 재생 잠재 능력을 잠금 해제하는 방법에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이는 재생 의학의 치료 전략 개발을 위한 핵심 단계입니다. 이를 위해 우리는 Xenopus에서 기계적 망막 손상, 니트로환원효소 매개 광수용체 조건부 절제를 허용하는 형질전환 라인, CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃을 기반으로 하는 색소성 망막염 모델, 안구 내 CoCl2 주입에 의한 세포독성 모델 등 여러 망막 손상 패러다임을 개발했습니다. 장점과 단점을 강조하면서 다양한 퇴행성 조건을 생성하고 Xenopus의 망막 재생을 연구할 수 있는 이 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.
Introduction
전 세계 수백만 명의 사람들이 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성(AMD)과 같은 실명으로 이어지는 다양한 망막 퇴행성 질환으로 고통받고 있습니다. 현재까지 이러한 질환은 대부분 치료가 불가능한 상태로 남아 있습니다. 현재 평가 중인 치료 접근법에는 유전자 치료, 세포 또는 조직 이식, 신경 보호 치료, 광유전학 및 보철 장치가 포함됩니다. 또 다른 새로운 전략은 줄기 세포 잠재력을 가진 내인성 세포의 활성화를 통한 자가 재생을 기반으로 합니다. 망막의 주요 신경교세포(glial cell) 유형인 뮐러(Müller) 신경교세포(glial cell)는 이러한 맥락에서 관심의 세포 공급원 중 하나입니다. 손상을 입으면 분화, 증식 및 뉴런 1,2,3을 생성할 수 있습니다. 이 과정은 제브라피시나 제노푸스에서는 매우 효과적이지만 포유류에서는 대체로 비효율적입니다.
그럼에도 불구하고, 유사분열 단백질을 사용한 적절한 치료 또는 다양한 요인의 과발현이 포유류 뮐러 신경교세포 세포 주기 재진입을 유도할 수 있고, 어떤 경우에는 후속 신경 발생 헌신 1,2,3,4,5를 유발할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이것은 치료에 크게 불충분하다. 따라서 재생의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 지식을 늘리는 것은 Müller 줄기 유사 세포 특성을 새로운 세포 치료 전략으로 효율적으로 전환할 수 있는 분자를 식별하는 데 필요합니다.
이 목표를 가지고 우리는 Xenopus에서 망막 세포 퇴화를 유발하는 몇 가지 손상 패러다임을 개발했습니다. 여기서는 (1) 세포 유형에 특이적이지 않은 기계적 망막 손상, (2) 간상 세포를 표적으로 하는 NTR-MTZ 시스템을 이용한 조건부 및 가역적 세포 절제 모델, (3) 진행성 간상 세포 퇴화를 유발하는 색소성 망막염 모델인 CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃, (4) CoCl2를 제시합니다-용량에 따라 원추세포를 특이적으로 표적으로 삼거나 더 넓은 망막 세포 변성을 유발할 수 있는 유도 세포독성 모델. 각 패러다임의 특징, 장점 및 단점을 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus 올챙이의 다양한 망막 손상 패러다임의 장점과 단점
기계적 망막 손상
신경 망막의 다양한 외과적 손상은 Xenopus 올챙이에서 발생했습니다. 신경 망막은 완전히 제거되거나 15,16 부분적으로만 절제될 수 있다16,17. 여기에 제시된 기계적 손상?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé)과 협력하여 Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) 및 UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels)의 M.P. 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
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