Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

نهج البلازما الحرارية للتحقيق في إصلاح غشاء البلازما في الخلايا الحية والأغشية النموذجية

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65776
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1The Niels Bohr Institute, University of Copenhagen, 2Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

Summary

تدمج طريقة البزل الحراري المجهري متحد البؤر والملاقط البصرية والجسيمات النانوية الذهبية لدراسة استجابات البروتين أثناء إصلاح غشاء البلازما في الخلايا والحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة. تتيح هذه التقنية ثقب الغشاء السريع والموضعي ، مما يسمح بتحديد البروتينات الرئيسية وأدوارها الوظيفية في آلية إصلاح غشاء البلازما المعقدة.

Abstract

غشاء الخلية أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلية ، وضمان سلامتها أمر ضروري لأن الخلية تعاني من إصابات طوال دورة حياتها بأكملها. لمنع تلف الغشاء ، طورت الخلايا آليات فعالة لإصلاح غشاء البلازما. يمكن دراسة آليات الإصلاح هذه من خلال الجمع بين المجهر متحد البؤر والبلازمونات الحرارية النانوية لتحديد والتحقيق في دور البروتينات الرئيسية ، مثل الملحقات ، المشاركة في إصلاح السطح في الخلايا الحية وأنظمة نماذج الغشاء.

تستخدم طريقة الثقب الليزر للحث على تسخين موضعي للغاية عند تشعيع الجسيمات النانوية. يقلل استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة من السمية الضوئية في العينة البيولوجية ، بينما يحدث غالبية الامتصاص في الجسيمات النانوية الرنانة القريبة من الأشعة تحت الحمراء. تم استغلال هذه الطريقة الحرارية في البحوث الحرارية الضوئية والفيزيائية الحيوية المحتملة لتعزيز فهم الآليات داخل الخلايا والاستجابات الخلوية من خلال دراسات الحويصلة واندماج الخلايا. وقد أظهر هذا النهج أنه مكمل للطرق الحالية لتعطيل الغشاء ، مثل الإصابات المستحثة ميكانيكيا أو كيميائيا أو بصريا ، ويوفر مستوى عال من التحكم عن طريق إلحاق إصابات موضعية للغاية. يقتصر مدى الإصابة على محيط الجسيمات النانوية الكروية ، ولا يحدث أي ضرر ضار على طول مسار الحزمة على عكس الليزر النبضي باستخدام أطوال موجية مختلفة. على الرغم من بعض القيود ، مثل تكوين الفقاعات النانوية ، توفر طريقة البلازما الحرارية أداة فريدة للتحقيق في الاستجابات الخلوية في إصلاح غشاء البلازما في بيئة أصلية تقريبا دون المساس بصلاحية الخلية.

عند دمجها مع الفحص المجهري متحد البؤر ، يمكن أن توفر طريقة الثقب فهما ميكانيكيا لديناميكيات الغشاء في أنظمة الأغشية النموذجية بالإضافة إلى معلومات كمية عن استجابات البروتين لتلف الغشاء ، بما في ذلك تجنيد البروتين ووظيفتها الفيزيائية الحيوية. بشكل عام ، يمكن أن يؤدي تطبيق هذه الطريقة على أنظمة النماذج المخفضة إلى تعزيز فهمنا لآلات إصلاح غشاء البلازما المعقدة في الخلايا الحية.

Introduction

غشاء الخلية ، الذي يعمل كحاجز مادي ومنصة إشارات ، أمر حيوي لبقاء الخلية1. طوال دورة الخلية بأكملها ، يتعرض غشاء البلازما (PM) للتلف ، مثل الإصاباتالميكانيكية 2،3،4،5 والكيميائية6 الناجمة عن الإجهاد. للحفاظ على سلامة الغشاء وضمان بقاء الخلية ، طورت الخلية آليات قوية لإصلاح غشاء البلازما (PMR). تعتمد هذه الآليات على استراتيجيات مختلفة ، مثل إعادة تنظيم الهيكل الخلوي ، واندماج الغشاء ، واستراتيجيات استبدال الغشاء7،8،9،10،11 ، وكلها تعتمد على تجنيد بروتينات معينة. والجدير بالذكر أنه تم تحديد أعضاء عائلة بروتين الملحق كبروتينات رئيسية مرتبطة بعمليات PMR1،9،12،13،14،15،16. بعد إصابة PM ، تتعرض الخلية لتدفق أيونات الكالسيوم (Ca2+) ، مما يشكل تهديدا مباشرا لبقاء الخلية17. استجابة لتدفق الكالسيوم2+ ، ترتبط بروتينات الملحق ، التي تقع في الغالب في العصارة الخلوية ، بالنشرة الداخلية لغشاء البلازما التالف كجزء من استراتيجيات PMR18. كان Annexin A2 (ANXA2) من أوائل أفراد عائلة Annexin الذين ارتبطوا ب PMR في ضمور العضلات الذي يعاني من نقص dysferlin واقترح التوسط في الإصلاح عن طريق دمج الحويصلات داخل الخلايا إلى PM بالقرب من موقع الإصابة5،19،20،21. وفي وقت لاحق، نسبت عدة وظائف إلى المرفقات22، وحظي دورها في استعراض الأداء والإصلاح باهتمام متزايد على مدى السنوات العشرين الماضية. ومع ذلك ، فإن الدور الدقيق للملاحق في PMR لا يزال غير مفهوم تماما15،18،21،22.

تقترح هذه المقالة طريقة للتحقيق في تفاعل غشاء البروتين وديناميكيات الغشاء بطريقة خاضعة للرقابة وموضعية للغاية ، باستخدام مزيج من الفحص المجهري متحد البؤر والملاقط البصرية وجسيمات الذهب النانوية (AuNPs). تتيح هذه الطريقة الدراسة الكمية لتفاعلات البروتين والدهون والجزيئات الصغيرة استجابة لتلف الغشاء وتدفق الكالسيوم2+ . على الرغم من تعقيد وتعدد المكونات المشاركة في عملية إصلاح الغشاء ، فقد تم استخدام أنظمة الأغشية المبسطة التي تحاكي غشاء البلازما لاكتساب فهم ميكانيكي أعمق لديناميكيات الغشاء واستجابة بروتينات الملحق لاضطراب الغشاء16. تم اختيار الحويصلات الدهنية أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كنظام غشاء نموذجي بتركيبة دهنية محددة. تم إنشاء GUVs باستخدام طريقة الترطيب بمساعدة الهلام ، وتحديدا ترطيب هلام كحول البولي فينيل ، كما وصفه Weinberger et al.23 ، والذي سمح بتغليف فعال للملحقات في GUVs.

يؤدي استخدام تشعيع الليزر القريب من الأشعة تحت الحمراء (NIR) على الجسيمات النانوية المعدنية (NPs) إلى تسخين كبير ل NP ، مما يجعلها طريقة فعالة لإنشاء مصدر حرارة محلي يتم استغلاله في التطبيقات الطبية الحيوية24. تم استخدام الطريقة في البداية لقياس درجة الحرارة المحيطة ب AuNP واحد مباشرة في كل من مقايسات المحاكاة الحيوية 2D و 3D. في هذه المقايسات25,26 ، تم تشعيع الجسيمات النانوية البلازمونية على طبقة ثنائية دهنية مدعومة أو محاصرة بصريا بالقرب من GUVs التي تمر بانتقال طور حراري محلي عند التسخين المحلي ، مما يتيح القياس الكمي والتحكم في ملف تعريف درجة الحرارة الدقيق حول الجسيم. تم استخدام ملف تعريف درجة الحرارة المرجعي هذا عند فحص العينات البيولوجية أو معالجتها. سهلت التطورات الإضافية في الطريقة تحريض المسام النانوية في الأغشية27 ، مما يسمح للحويصلة واندماج الخلايا28,29. بحثت دراسات أخرى في سلوك بروتينات الغشاء المحيطي في GUVs29 والبروتينات عبر الغشاء30 عن طريق إنشاء حويصلات هجينة جديدة ، في حين تم أيضا استكشاف توصيل الأدوية الخاصة بالخلايا للتحكم في الاستجابات الخلوية أو التعبير الجيني28،29،31،32،33 ودراستها. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام الطريقة للتحقيق في استجابات البروتين لتلف الغشاء32،34،35.

توجد عدة طرق لتعطيل غشاء البلازما لاستكشاف الاستجابات الخلوية وإصلاح الغشاء. وتشمل هذه ثقوب الإبر الدقيقة ، واهتزاز الميكروبيدات ، وكشط الخلايا ، وكلها يمكن أن تعطل غشاء الخلية ميكانيكيا14،36،37. يمكن تحقيق الضرر الناجم كيميائيا عن طريق إضافة المنظفات5،38 أو السموم البكتيرية39،40 التي تزعزع استقرار الطبقة المزدوجة الدهنية وتولد مسام الغشاء عبر غشاء البلازما. علاوة على ذلك ، تم استخدام الإصابات المستحثة بصريا بواسطة الموجات المستمرة والليزر النبضي لدراسة مكونات PMR ، مثل بروتينات الملحق5،14،21،41 ، بالاشتراك مع الجسيمات النانوية البلازمونية42،43،44،45. على الرغم من كفاءة الليزر النبضي عالي الطاقة ، إلا أنه يمكن أن يسبب إصابات كبيرة وأضرارا داخل الخلية على طول مسار الحزمة. علاوة على ذلك ، فإن التغييرات التفصيلية التي تحدث في المادة البيولوجية عند تشعيع الليزر النبضي وما إذا كانت تخلق مسام محددة جيدا لا تزال بحاجة إلى مزيد من البحث. يتم تقديم طريقة بديلة في هذه المقالة ، باستخدام البلازمونات الحرارية لإحداث ثقوب نانوية في PM بطريقة خاضعة للرقابة34,35 دون التسبب في ضرر كبير للهياكل الداخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض NPs البلازمونية لليزر NIR عالي التركيز ، مما يؤدي إلى زيادة درجة الحرارة المحلية للغاية التي يمكن أن تصل بسهولة إلى درجات حرارة تتجاوز 200 درجة مئوية ، مما قد يؤدي إلى انفجارات نانوية صغيرة25،46،47. يمكن التحكم في هذه العملية عن طريق ضبط شدة الليزر بالإضافة إلى حجم وشكل وتكوين NPs48. من خلال استخدام هذه التقنية ، يمكن للباحثين استكشاف دور البروتينات في إصلاح الجسيمات في الخلايا الحية ، والتي يمكن أن تساعد في معالجة بعض الأسئلة التي لم تتم الإجابة عليها فيما يتعلق بمشاركة بروتينات الملحق في إصلاح الغشاء دون المساس بصلاحية الخلية.

تم تأسيس الاصطياد البصري للجسيمات النانوية البلازمونية بشكل جيد من خلال الدراسات السابقة25،49،50،51،52 ؛ ومع ذلك ، يمكن الحصول على رؤى إضافية بشأن الخصائص البلازمونية الحرارية للجسيماتالنانوية 53،54،55 في المواد التكميلية (الملف التكميلي 1). يمكن استخدام طريقة البلازما الحرارية لإنشاء ثقوب نانوية في الجسيمات لغرض دراسة الاستجابة الخلوية وآليات الإصلاح. بتعبير أدق ، يمكن تحقيق الثقب من خلال التسخين البصري ل AuNPs على مقربة من الغشاء ، كما هو موضح في الشكلين 1A و B. يسمح هذا الثقب الموضعي بتدفق الكالسيوم2+ ، والذي تم التحقق منه بواسطة مستشعر الكالسيوم ، وبالتالي تنشيط آلية PMR. بالنسبة لتجارب الخلايا الحية ، تم تجميد AuNPs التي يبلغ قطرها 200 نانومتر على السطح أسفل الخلية لمراقبة دور ANXA2 في PMR عبر الفحص المجهري متحد البؤر. يقوم ليزر NIR (الشكل 1A ، B) ، بطول موجي يبلغ 1064 نانومتر ، بتشعيع AuNP ، مستغلا خصائصه البلازمونية (الشكل 1C) ، مما يؤدي إلى تسخين محلي كبير (الشكل 1D) في نافذة الشفافية البيولوجية49 مع التسبب في الحد الأدنى من الضرر للخلية نفسها. تنخفض منطقة درجة الحرارة المرتفعة المحيطة ب AuNP بسرعة بنسبة 30-40٪ على مسافة تتوافق مع نصف قطر NP ، كما هو موضح في الشكل 1E ، مما يسمح بإصابة محصورة للغاية في جميع الأبعاد الثلاثة.

الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تخطيطي للطريقة التجريبية. (أ) تقع الخلايا المنقولة ب ANXA فوق جسيمات الذهب النانوية المجمدة (AuNPs) على السطح ، أو (ب) الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) مع ANXA المغلفة معلقة في وسط يحتوي على AuNPs. (ج) يتم تشعيع AuNP واحد بواسطة المصيدة الضوئية NIR ، حيث يؤدي التفاعل بين المجال الكهرومغناطيسي الوارد وإلكترونات التوصيل إلى التذبذب الجماعي للإلكترونات داخل NP. (د) ينتج عن هذه العملية زيادة محصورة للغاية ولكنها كبيرة في درجة الحرارة. لتقدير درجة الحرارة على سطح NP ، يتم استخدام نظرية Mie ، ويتم حساب ملف تعريف درجة الحرارة (E) ل AuNP بقطر 200 نانومتر وشدة الليزر I = 6.36 × 108 واط / سم2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتقليل التأثير الحراري على غشاء الخلية ، يتم تشعيع AuNPs فقط لمدة ~ 1 ثانية. يؤدي هذا إلى انفجار عابر ومحلي للتدفئة ، مما يقلل من تلف البروتينات التي تتطلب عادة مزيدا من الوقت لتكشف. عند ثقب الغشاء ، يتم تجنيد بروتينات الملحق في جزء من الثانية ، وفي غضون ثوان قليلة ، يتم تشكيل سقالة تشبه حلقة الملحق حول موقع الإصابة (الشكل 2). تم تطبيق هذا النهج أيضا لاستكشاف مشاركة ANXA5 في كل من الخلايا الحية والأغشية النموذجية16 في محاولة لإلقاء الضوء على المخطط الكامل لعمليات الإصلاح. وفي حين أن التركيز الأساسي كان على الربط بين توظيف مختلف بروتينات الملحقات، فإن الجوانب الفيزيائية الحيوية لآلية الإصلاح لم توضح بعد.

لتنفيذ الطريقة المقترحة بالكامل ، هناك حاجة إلى ثلاثة مكونات رئيسية: الفحص المجهري متحد البؤر ، والملاقط البصرية ، والجسيمات النانوية المعدنية. تستخدم الملقط البصري لاحتجاز AuNPs ، ويمكن تحقيق بنائها باتباع الإجراء الذي حدده Neuman et al.49. ومع ذلك ، إذا ثبت أن بناء ملقط بصري يمثل تحديا كبيرا ، فيمكن استخدام ليزر NIR شديد التركيز لتشعيع AuNPs المثبتة أسفل الخلايا. في حين تم اختيار AuNPs الكروية لهذا البروتوكول ، يمكن أيضا استخدام مجموعة متنوعة من الجسيمات البلازمونية ذات أطياف الامتصاص القابلة للضبط لتحقيق تدرج درجة حرارة موضعي للغاية داخل منطقة NIR48.

يعد التصوير الفلوري ضروريا لمراقبة دور البروتينات ذات العلامات الفلورية ، وبالتالي ، يمكن اعتبار الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) 56 بديلا للتصوير متحد البؤر. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تسمح فقط بالتصوير السطحي ولن تكون متوافقة مع تجارب حويصلة الغشاء النموذجية. وبالتالي ، فإن كلا من الملقط البصري والمجهر متحد البؤر ضروريان لتحديد الموقع الدقيق للجسيمات النانوية والتحقيق التفصيلي للمنطقة المحلية المحيطة بإصابة الخلية. لإشعاع الجسيمات النانوية بشكل فعال بتركيز ليزر محدود الحيود ، من الضروري تصور الجسيمات النانوية. يمكن تحقيق ذلك على النحو الأمثل عن طريق الفحص المجهري للانعكاس ، وهو ميزة تصوير قياسية لمجاهر Leica متحدة البؤر. ومع ذلك ، إذا لم يكن التصوير الانعكاسي أو التشتت متاحا ، فيمكن النظر في طرق بديلة ، مثل وضع العلامات الفلورية AuNP الأقل كفاءة.

باختصار ، فإن الطريقة الحرارية المنطقية التي يمكن التحكم فيها بشكل كبير والمحلية المقدمة في هذه الدراسة لديها القدرة على أن تكون بمثابة منصة ممتازة للتحقيق في المكونات الجزيئية المشاركة في الاستجابات الخلوية وآليات إصلاح الجسيمات في الخلايا الحية. بالإضافة إلى دراسة استجابة البروتين عند تلف الجسيمات ، يمكن أيضا استخدام هذا النهج لثقب الحويصلات محليا ، مما يتيح التحقيق في استجابة البروتين في كل من ديناميكيات البروتين البروتيني وغشاء البروتين. علاوة على ذلك ، تسمح هذه الطريقة بإجراء تحليل كمي للتفاعلات بين البروتينات والدهون والجزيئات الصغيرة عند تعطل الأغشية. بشكل جماعي ، هذه التطورات لديها القدرة على إلقاء الضوء على بعض الأسئلة التي لم يتم حلها فيما يتعلق بآلات إصلاح غشاء البلازما المعقدة والمعقدة.

Protocol

1. إعداد ثقب غشاء الخلية

  1. بذر الخلايا (اليوم 1)
    1. زراعة خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293T) في وسط الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب CO2 بنسبة 5٪ حتى تصل إلى التقاء 70٪.
    2. افصل الخلايا عن السطح باستخدام 500 ميكرولتر من التربسين ، وعد 200000 خلية HEK293T ، وزرعها في طبق استزراع بحجم إجمالي قدره 3 مل من وسط الاستزراع. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب CO2 بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: لمنع تجمع الخلايا في وسط الطبق ، انشر الخلايا بالتساوي وتجنب تحريك الطبق ، لأن ذلك يمكن أن يقلل من كفاءة النقل.
  2. نقل الخلايا (اليوم 2)
    ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا المنقولة حتى 48 ساعة بعد النقل.
    1. ماصة البلازميد من الفائدة وكاشف transfection لمدة 5 ثوان قبل الاستخدام.
    2. في أنبوب معقم سعة 2 مل ، امزج ما يلي بالترتيب المحدد: 500 ميكرولتر من وسط المصل المختزل ، و 5 ميكرولتر من كاشف النقل (4 مرات أكثر من البلازميد) ، و 1.25 ميكرولتر من البلازميد (1 ميكروغرام / ميكرولتر).
      ملاحظة: للتحقيق في تدفق الكالسيوم عند تمزق الغشاء ، اتبع نفس الإجراء ولكن استخدم مسبار مستشعر الكالسيوم المرتبط بالغشاء GCaMP6-CAAX (1 ميكروغرام / ميكرولتر).
    3. قم بسحب خليط النقل برفق ولكن بدقة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة قبل إضافته بالتنقيط إلى الخلايا.
    4. قبل إضافة خليط النقل ، قم بإزالة الوسط من طبق الاستزراع ، واغسل الخلايا برفق ب 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، وأضف 2000 ميكرولتر من وسط المصل المختزل إلى الطبق.
    5. احتضان الخلايا مع خليط النقل عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب CO2 بنسبة 5٪ لمدة ساعتين و 45 دقيقة قبل تغيير الوسط إلى 3 مل من وسط الاستزراع.
  3. تحضير محلول جسيمات الذهب النانوية (AuNP) (اليوم 2)
    1. دوامة حل مخزون AuNP 200 نانومتر لمدة 10 ثوان عند المستوى 10 (انظر جدول المواد لمزيد من مواصفات الجهاز) ، صوتنة لمدة 5 دقائق (السعة القصوى) ، ودوامة مرة أخرى لمدة 10 ثوان.
    2. امزج 150 ميكرولتر من AuNPs مع 850 ميكرولتر من الماء المقطر إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول AuNP المخفف في الثلاجة وإعادة استخدامه لمدة تصل إلى 1 شهر.
  4. تحضير الطبق التجريبي (اليوم 2)
    1. قم بتغطية طبق microwell ب 150 ميكرولتر من محلول مرفق الخلية 0.01٪ -0.1٪ واحتضانه لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. اغسل سطح الزجاج مرتين ب 500 ميكرولتر من الماء المقطر واتركه يجف في الهواء لمدة ~ 10 دقائق.
    3. أضف 80 ميكرولتر من محلول AuNP بالتنقيط إلى السطح الجاف.
      ملاحظة: دوامة (10 ثوان) ، سونيكات (5 دقائق) ، ودوامة (10 ثوان) محلول AuNP المخفف قبل إضافته إلى سطح الزجاج المطلي لتقليل مجاميع AuNP.
    4. انتظر ~ 10 دقائق قبل إدخال 1.5 مل من وسط الثقافة. دع الطبق يحتضن على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
  5. إعداد الغرفة التجريبية (اليوم 3)
    ملاحظة: يمكن تحضير الغرفة التجريبية في اليوم 3 أو 4 ؛ ومع ذلك ، تأكد من إجراء الاستعدادات التالية في نفس يوم التجربة.
    1. قم بإزالة الوسط من الخلايا الموجودة في طبق الاستزراع واغسل الخلايا ب 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة أي وسيط متبقي وحطام يمكن أن يتداخل مع الخطوات اللاحقة.
    2. أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا القائم على الإنزيم إلى البئر واحتضانه لمدة 1-3 دقائق حتى تنفصل الخلايا عن طبق الاستزراع.
    3. أضف 1.5 مل من وسط الاستزراع الطازج وماصة محلول الخلية للحصول على محلول خلوي متجانس لتقليل احتمالية وجود مجموعات الخلايا.
    4. قم بإزالة الوسط بعناية من AuNPs في البئر الصغير التجريبي.
    5. أضف محلول الخلية (2 مل) إلى البئر الصغير واتركه يحتضن لمدة 5 ساعات على الأقل قبل إجراء التجربة.
      ملاحظة: للحصول على الظروف التجريبية المثلى ، تجنب تحريك الحجرة ، فقد يتسبب ذلك في تجمع الخلايا في منتصف الغرفة.

2. تجربة ثقب غشاء الخلية

  1. الإعدادات البصرية للتجربة
    1. قم بإجراء التجارب باستخدام مجهر مسح متحد البؤر مع ليزر محاصرة 1064 نانومتر57.
    2. نفذ المحاصرة البصرية في المستوى البؤري باستخدام هدف غمر بالماء 63x مع فتحة رقمية (NA) تبلغ 1.2.
    3. افترض أن التركيز هو حجم قرص Airy وأن عرض الحزمة البؤرية لليزر التشعيع هو ~ 540 نانومتر في نصف القطر.
    4. قم بتحويل طاقة الليزر (P) إلى شدة الليزر المقابلة (I) عن طريق حساب طاقة الليزر لكل منطقة (W / cm2).
    5. استخدم مقسم الحزمة الضوئية الصوتية (AOBS) لتصور إشارات الفلورسنت المتعددة المكتشفة باستخدام أنابيب المضاعف الضوئي والكشف المتزامن عن NPs المعدنية عبر إشارة التشتت الخاصة بها.
      ملاحظة: ليست كل الأنظمة متحدة البؤر مجهزة ب AOBS ، مما يسمح بتصوير انعكاس NPs المعدنية. هنا ، يجب تنفيذ أشكال أخرى من الكشف ، أو يمكن محاولة إجراء مسح متسلسل لليزر NIR في المنطقة الموجودة أسفل الخلية.
    6. خلال الجلسات التجريبية ، قم بتركيب غرفة مفتوحة ذات قاع زجاجي تحتوي على خلايا وتحقيقات فلورية جزيئية وجسيمات نانوية ذهبية على المجهر.
    7. حرك المصيدة بالنسبة للخلايا عن طريق ترجمة العينة المركبة على مرحلة كهرضغطية ، مما يتيح حركات جانبية دقيقة نانومتر16.
      ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالمصيدة الضوئية ثابتة.
  2. الإعدادات التجريبية لثقب غشاء الخلية
    1. ضع خلايا HEK293T ، منقولة ببلازميدات ملحقة مقترنة ببروتين فلوري ، فوق AuNPs المعزولة التي يتم تجميدها على السطح الزجاجي (الشكل 1 أ).
    2. استخدم ليزر الأرجون 488 نانومتر لتصور إشارة مضان GFP وليزر HeNe 633 نانومتر لمراقبة انعكاس AuNP في مجهر المسح متحد البؤر.
    3. استخدم الملقط البصري ، الذي يعمل بليزر 1064 نانومتر NIR ، لتشعيع AuNP واحد لمدة ~ 1 ثانية ، مما يؤدي إلى زيادة محلية كبيرة في درجة الحرارة التي تعطل غشاء البلازما.
    4. تطبيق التشعيع بين 200-295 ميغاواط على الجسيمات المركزة، مما يؤدي إلى زيادة كبيرة في درجة الحرارة.
      ملاحظة: هناك فقدان كبير للطاقة داخل البصريات ، حيث تصل طاقة الليزر في النقطة البؤرية إلى حوالي 20٪ من الملي واط المذكور ، اعتمادا على الإعداد المحدد. تعتمد الكثافة المحددة (المقاسة ب W / cm2) على المحاذاة الدقيقة للنظام ، وتحديدا الحجم البؤري. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التوصيل الحراري للزجاج أعلى من توصيل الخلية والماء ، وبالتالي تقليل كمية الحرارة المنبعثة إلى غشاء البلازما بشكل طفيف48,58.
    5. تحقيق إصابة فعالة وموضعية PM واستجابة إصلاح البروتين اللاحقة عن طريق معايرة توطين بقعة تركيز الليزر NIR بشكل صحيح. يتم تحقيق ذلك من خلال التقاط AuNP واحد معلق في نفس وسيط التصوير والتأكد من أن AuNP المحدد في التركيز قبل التشعيع.
      ملاحظة: يعتبر الجسيم النانوي في بؤرة التركيز عندما تظهر إشارة تشتته أكثر حدة ، أي تظهر حواف واضحة وغياب هالة حول الجسيم ، عند مراقبته في المجهر متحد البؤر (الشكل 2C (ii)).
  3. شروط كثافة الخلية و AuNP
    1. اختر خلايا مفردة بدلا من مجموعات الخلايا لمنع تداخل أغشية البلازما.
      ملاحظة: يجب أن تلتصق الخلايا بالسطح ، وتظهر مورفولوجيا مسطحة (الشكل التكميلي 1) ، مما يسمح بثقب محيط الخلية مع منع تلف الغشاء النووي (الشكل التكميلي 2).
    2. احتضان الخلايا وفقا للبروتوكول أو حتى تستقر وتسويتها لمنع امتصاص الخلايا AuNP. تجنب وقت الحضانة المفرط وقلل من احتمالية الإصابة ب AuNP endocytosis باستخدام PEGylated AuNPs.
    3. تأكد من أن AuNPs المجمدة موجودة كجسيمات مفردة ، متباعدة بشكل كاف عن بعضها البعض لمنع الركام. يمكن أن يؤدي الركام إلى زيادة كبيرة في التدرج الحراري ، مما يؤدي إلى ارتفاع درجات الحرارة التي قد تعطل جزءا كبيرا من الخلية.
    4. استبدل العينة كل 1-2 ساعة للحفاظ على صحة الخلايا.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي التعرض المطول إلى تدهور صحة الخلايا ، مما يضر بقدرتها على الاستجابة بدقة للإصابة من حيث إصلاح الغشاء. عادة ما يلاحظ هذا الانخفاض في صحة الخلية من خلال تغيير في شكل الخلية ، حيث تبدو الخلايا أكثر كروية وأكثر صلابة ، وتبلغ ذروتها في النهاية بموت الخلايا.

معلومات تكميلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

3. إعداد الحويصلة العملاقة أحادية الصفيحة (GUV)

  1. تحضير خليط الدهون
    1. اصنع تركيبة الدهون GUV عن طريق الجمع بين الدهون 1،2-ديوليويل-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) و 1،2-ديوليويل-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) في نسبة مولية تبلغ 4: 1 (انظر الجدول 1). قم بقسمة مخزون الدهون في قوارير زجاجية سعة 1.5 مل وفقا للاحتياجات التجريبية وقم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: للحفاظ على الدهون لفترة طويلة ولمنع أكسدة الدهون غير المشبعة ، استبدل الهواء بالأرجون في القوارير المقتبسة.
    2. قبل خلط الدهون ، قم بتنظيف 50 ميكرولتر و 500 ميكرولتر تماما من الزجاج أو المحقنة المعدنية مع الكلوروفورم خمس مرات للتأكد من خلوها من الملوثات للدهون المذابة بالكلوروفورم.
      تنبيه: تعامل مع الكلوروفورم في غطاء دخان بسبب سميته.
      1. نقل الحجم المحسوب من الكلوروفورم إلى قنينة زجاجية كهرمانية نظيفة ، متبوعة بالكمية المحددة من كل دهون (انظر الجدول 1).
        ملاحظة: لتجنب التلوث المتبادل بين مخزون الدهون ، تأكد من تنظيف المحاقن بالكلوروفورم.
      2. أخيرا ، أضف صبغة الغشاء واخلط الدهون جيدا عن طريق الماصة. تخزين خليط الدهون المحضر في -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام ؛ يبقى الخليط قابلا للحياة لمدة 2-3 أسابيع دون أي ضرر كبير للدهون.
        ملاحظة: يجب أن يتم الخلط باستخدام حقنة معدنية أو زجاجية. احتفظ دائما بالدهون على الثلج عندما تكون خارج الفريزر.
  2. تحضير جل كحول البولي فينيل (PVA)
    1. قم بإعداد GUVs باستخدام طريقة الترطيب بمساعدة الهلام التي وصفها Weinberger et al.23مع تعديلات طفيفة.
      1. تحضير هلام PVA عن طريق إذابة 5 غرام من PVA في 100 مل من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 mM السكروز ، 25 mM كلوريد الصوديوم ، و 25 mM Tris (درجة الحموضة 7.4).
      2. سخني محلول PVA إلى 85 درجة مئوية وحركيه حتى يصبح شفافا. اتركه ليبرد إلى RT وقم بتخزينه في الثلاجة لمزيد من الاستخدام.
        ملاحظة: لا يتم إذابة PVA بشكل صحيح في المخزن المؤقت ، وبالتالي ، من الضروري تسخين حتى 85 درجة مئوية.
  3. إعداد الشرائح الزجاجية
    1. نظف شرائح الزجاج بالإيثانول واتركها تجف في الهواء. بعد ذلك ، عالج الشرائح بمنظف بلازما الهواء لإزالة أي تلوث متبقي من سطح الزجاج.
    2. إعداد الشرائح الزجاجية المطلية ب PVA
      1. قم بتسخين جل PVA (5٪) حتى 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لزيادة سيولته. ضع 90 ميكرولتر من PVA الدافئ على الشريحة الزجاجية ، وانشرها بشكل موحد ، واتركها تجف في خزانة تسخين على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
      2. بمجرد أن تصبح شريحة PVA الزجاجية جاهزة ، أضف 30 ميكرولتر من خليط الدهون المحضر باستخدام حقنة زجاجية أو معدنية وانشرها في طبقة رقيقة باستخدام حافة الإبرة.
      3. جفف خليط الدهون عن طريق تبخير محتواه من الكلوروفورم تحت ضغط النيتروجين اللطيف. علاوة على ذلك ، قم بتجفيف الشرائح الزجاجية تحت فراغ لمدة تتراوح بين 1.5 و 2 ساعة.
  4. تزايد GUVs في غرفة
    1. قم بتجميع الغرفة الداخلية ، المشابهة في التصميم لتقرير59 المنشور مسبقا ، باستخدام الشريحة الزجاجية المعدة.
    2. في أنبوب منفصل سعة 2 مل ، قم بتخفيف البروتين المؤتلف محل الاهتمام (في هذه الحالة ، ANXA5 أو ANXA4) إلى تركيز نهائي يبلغ 500 نانومتر مع مخزن مؤقت متزايد (GB) يتكون من 80 mM سكروز و 70 mM NaCl و 25 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 7.4).
    3. أضف 400 ميكرولتر من محلول البروتين المؤتلف المخفف إلى الغرفة. احتضان الغرفة في RT لمدة 1 ساعة للسماح ل GUVs بالنمو من طبقة الدهون المودعة. استخدم نفس المخزن المؤقت ، باستثناء البروتين ، كعنصر تحكم سلبي.
      ملاحظة: لف الحجرة في فيلم البولي أوليفين لمنع تبخر المخزن المؤقت.
    4. جمع GUVs عن طريق نقل 400 ميكرولتر من محتوى الغرفة إلى أنبوب 2 مل.
    5. قم بإزالة البروتينات غير المغلفة خارج GUVs عن طريق إضافة 1 مل من محلول المراقبة (OB) الذي يحتوي على 55 مللي مول من الجلوكوز و 70 مللي مول كلوريد الصوديوم و 50 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 7.4) إلى المحلول الذي تم جمعه. ثم ، الطرد المركزي الحل في 600 × غرام لمدة 10 دقائق عند 13 درجة مئوية.
    6. بعد الطرد المركزي ، استبدل 1 مل من المادة الطافية بحجم متساو من المخزن المؤقت للمراقبة. قم بتفريق GUVs من خلال ماصة لطيفة وتخزينها في الثلاجة حتى يتم استخدامها في تجارب GUV.

4. تجربة ثقب GUV

  1. إعداد الغرفة
    1. استخدم طبقا ذو قاع زجاجي مقاس 35 مم للتجربة. لمنع GUVs من الالتصاق بالسطح والانفجار ، قم بتغطية السطح ب β-casein (5 مجم / مل) لمدة 15-30 دقيقة.
      1. بالنسبة لمحلول β-كازين ، قم بإذابة 0.1 جم من البروتين في مخزن مؤقت سعة 20 مل من 20 مللي متر تريس (PH 7.5) و 100 مللي مول كلوريد الصوديوم. قم بتصفية محلول البروتين ، وقم بقسمته في قوارير صغيرة ، وقم بتجميده لمزيد من الاستخدام.
    2. اغسل الحجرة مرتين باستخدام عازل المراقبة لإزالة أي β كازين حر زائد من السطح واتركه يجف في RT.
    3. في أنبوب منفصل سعة 2 مل ، امزج GUVs المجمعة مع OB. أضف CaCl2 إلى الخليط للتركيز النهائي المطلوب (في هذه الحالة ، 200 ميكرومتر).
    4. أدخل قذائف نانوية من الذهب 150 نانومتر (AuNSs) إلى الخليط بنسبة 1: 100. يتكون الخليط النهائي من 250 ميكرولتر من GUVs ، و 225 ميكرولتر من OB ، و 20 ميكرولتر من CaCl2 (5 mM) ، و 5 ميكرولتر من AuNSs المحددة.
  2. الإعداد التجريبي
    1. نقل الخليط إلى الغرفة وتثبيته على مرحلة المجهر. اعتمادا على حجم الغرفة ، أضف الخليط بأكمله أو جزءا من الخليط.
      ملاحظة: التوقيت أمر بالغ الأهمية لأن أيونات الكالسيوم يمكن أن تمر عبر الغشاء وتتوسط في ربط الملحقات بالنشرة الداخلية للغشاء.
    2. استخدم نفس الإعداد البصري المستخدم في تجارب ثقب الخلية.
    3. استخدم الملقط البصري لاحتجاز AuNS فردي على مقربة من أو على سطح GUV عن طريق تطبيق قوة ليزر ~ 125 ميجاوات.
    4. بعد ذلك ، قم بزيادة طاقة الليزر إلى ~ 300 ميجاوات. ينتج عن ذلك زيادة موضعية للغاية في درجة الحرارة ، مما يؤدي إلى تعطيل وثقب الغشاء في الموقع المستهدف.
      ملاحظة: تفضل AuNSs لتجارب GUV نظرا لقدرتها على توليد زيادة أعلى في درجة الحرارة العابرة مع الحفاظ على حجم أصغر مقارنة ب AuNPs الصلبة.

Table 1
الجدول 1: جدول لتحديد تكوين GUV. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

5. قياسات وتحليل بيانات استجابة ANXA في تجارب ثقب الخلية

  1. استخدم MATLAB لتحليل الصور ولحساب ورسم ملف تعريف درجة حرارة AuNP (الشكل 1D ، E) بناء على معادلات Mie60,61.
  2. بالإضافة إلى ذلك ، قم بمعالجة جميع الصور متحدة البؤر باستخدام توزيع FIJI ImageJ62,63.
  3. حساب نصف قطر حلقة ANXA
    1. قم بقص المنطقة المهمة التي تحتوي على المنطقة المثقوبة من البيانات الأولية قبل تحليل إصابة الغشاء.
    2. استخدم سير عمل MATLAB الداخلي لمعالجة كل صورة عن طريق وضع علامة يدويا على مركز حلقة ANXA ومحيطها الخارجي.
      1. استخدم هذه العلامات لتعيين حدود المعالجة لمنطقة الاهتمام.
        ملاحظة: تتم معالجة المنطقة لاحقا شعاعيا ضمن الحدود المحددة ، وشدة التألق على مسافة معينة من المركز هي المتوسط على الدائرة الكاملة بنفس مسافة المركز. يتم تخزين هذا الرقم لكل خطوة نصف قطر.
      2. استخدم سير العمل لملاءمة متوسط الشدة على نطاق المسح بأكمله مع منحنى غاوسي أحادي البعد لتحديد الحد الأقصى (Rp) والعرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) المقابل ل Rext و Rint ، على التوالي ، كما هو موضح في الشكل 3A.
    3. أخيرا ، حدد نصف قطر حلقة ANXA بالمسافة من مركز الحلقة إلىR ext المعطاة بواسطة المخطط الناتج عن سير عمل MATLAB.
  4. حساب نصف قطر حلقة ANXA ثلاثية الأبعاد
    1. تتبع التغيير في نصف قطر حلقة ANXA في الاتجاه z باستخدام نفس سير عمل تحليل MATLAB كما في الخطوة 5.1. قم بتطبيق سير العمل على العديد من المقاطع z متحدة البؤر عبر جرح الغشاء ، كما هو موضح في الشكل 3C ، E.
    2. احسب ميل كل جرح بناء على التغير في أنصاف الأقطار فوق المقاطع z ، كما هو موضح في الشكل 3F.
  5. التطور الزمني لنصف قطر حلقة ANXA
    1. وبالمثل ، تتبع تطور حلقة ANXA لحلقة ANXA بعد ثقب الغشاء الحراري باستخدام سير عمل تحليل MATLAB من الخطوة 5.1. تحليل النقاط الزمنية المتتالية لمراقبة التغييرات بمرور الوقت ، كما هو موضح في الشكل 3D ، G ، H.

Representative Results

في هذه الدراسة ، يتم استخدام طريقة البلازما الحرارية للتحقيق في استجابة بروتين الملحق لاضطراب غشاء البلازما. ومع ذلك ، يمكن فحص أي بروتين يمكن تجنيده عند إصابة الغشاء باستخدام هذا الفحص ، بالنظر إلى أن البروتين المعني يحمل علامة الفلورسنت. تتم مراقبة توظيف البروتين ووظيفته عن طريق التصوير متحد البؤر في كل من خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293T) والحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs). للتوضيح ، يوضح الشكل 2 الظروف التجريبية التي يتم فيها استخدام شعاع ليزر NIR مركز عند 1064 نانومتر لتشعيع AuNP واحد (الشكل 2A) ، مما يؤدي إلى إصابة الغشاء وتدفق Ca2+ إلى الخلية ، وتنشيط آلية PMR. بعد ذلك ، يتم تجنيد المرفقات بسرعة إلى موقع الإصابة ، حيث ترتبط بالفوسفوليبيدات سالبة الشحنة في محيط الجرح ، وتشكل بنية تشبه الحلقة في غضون ثوان (الشكل 2B ، i-iv). أظهرت تجارب الأغشية النموذجية ، باستخدام GUVs ، أن ثقوب الغشاء قد أعيد إغلاقها بسرعة في غياب ANXA ، كما هو موضح في الشكل 2C. ومع ذلك ، في وجود ANXA ، لوحظ تراكم سريع ل ANXA في موقع الإصابة بعد ثقب الغشاء (الشكل 2D). والجدير بالذكر أن ANXA استمرت في لف الحواف المكشوفة ، مما أدى في النهاية إلى انفجار GUV. يعتقد أن آلية التدحرج هذه تنشأ من قدرة ANXA على إحداث انحناء وثني الأغشية الدهنية20.

Figure 2
الشكل 2: استجابة المرفقات (ANXAs) لاضطراب الغشاء الناجم عن البلازما الحرارية. في البداية ، (أ) يعمل غشاء البلازما كحاجز بين البيئة خارج الخلية التي تحتوي على مستويات عالية من أيونات الكالسيوم2+ والبيئة داخل الخلايا مع ANXAs المغلفة. عند التشعيع باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) ، يولد AuNP حرارة كبيرة ، مما يتسبب في تمزق الغشاء ويؤدي إلى تدفق أيونات Ca2+. وبالتالي ، يتم تنشيط آلية إصلاح غشاء البلازما (PMR) ، والتي تنطوي على تجنيد ANXAs إلى موقع الإصابة ، حيث ترتبط بالفوسفوليبيدات سالبة الشحنة. (ب-د) توضح صور الفحص المجهري متحد البؤر لخلية تحتوي على ANXA2 و GUV تحتوي على ANXA4 هذه العملية. (ط) قبل التشعيع، تظهر الصور خلية سليمة، أو GUV، مع مواقع التشعيع المشار إليها بالأسهم البيضاء. (ii) عند تشعيع الجسيمات النانوية ، (B) يتم تجنيد ANXAs بسرعة إلى موقع الإصابة ، وتشكيل بنية تشبه الحلقة حول جرح الغشاء (B [ii-iv]). تظهر اللوحة (C) GUV ملطخا بالغشاء بدون ANXA ، والذي ، عند الثقب ، يعاد إغلاقه بسرعة دون إعادة تشكيل الغشاء بشكل ملحوظ. من ناحية أخرى ، تظهر اللوحة (D) GUV يحتوي على ANXA4 المؤتلف ، والذي يرتبط بالفعل بالغشاء قبل (i) التشعيع بسبب تسرب Ca2+ عبر الغشاء. (ii) عند الثقب ، يرتبط ANXA4 بالحواف الحرة ، مما يتسبب في انهيار GUV حيث يتدحرج الغشاء بعيدا عن الحافة. تقيس أشرطة المقياس 10 ميكرومتر للشكل (B) ، و 2 ميكرومتر للشكل B (i) ، و 10 ميكرومتر ل (C) ، و 15 ميكرومتر للشكل (D). هذا الرقم مستنسخ من مورينو بيسكادور وآخرون. al16 بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوفر تحليل الهياكل الكاملة الشبيهة بحلقة ANXA (الشكل 2B والشكل التكميلي 1) رؤى مفيدة حول حجم الجرح والتشكل. يمكن تحديد نصف قطر بنية حلقة ANXA بمرور الوقت والمكان ، كما هو موضح في القسم 5. حلل مورينو وآخرون 16 أكثر من 135 إصابة في غشاء البلازما في الخلايا الحية ، حيث تم تصوير تحليل هياكل حلقة ANXA5 في الشكل 3. تم تحديد نصف القطر عن طريق قياس المسافة من مركز الحلقة إلى نصف القطر الخارجي للمنحنى بناء على العرض الكامل نصف الحد الأقصى لملف تعريف الكثافة المنهار (الشكل 3 أ). أوضحت النتائج توزيعا غير متجانس لأحجام حلقات ANXA5 (الشكل 3B) ، والتي ظلت ثابتة بمرور الوقت (الشكل 3D ، G ، H) والفضاء (الشكل 3C ، E ، F). تشير هذه النتائج إلى تراكم ANXA5 حول مواقع الإصابة ، مما يدل على وجود استراتيجية PMR بديلة بوساطة ANXA5 في الخلايا الحية إلى التبرعم الداخلي المفترض الذي يشبه القمع للغشاءالتالف 5.

Figure 3
الشكل 3: تحليل تراكيب حلقات ANXA5 المحيطة بموقع الإصابة في الخلايا الحية. (أ) يوضح التمثيل التخطيطي النهج التحليلي ، الذي يعتمد على الحد الأقصى للعرض الكامل للنصف لملف تعريف خط شدة ANXA. (ب) يوضح الرسم البياني 135 نصف قطر حلقة ANXA5 مقاسة. (C) ملامح خط شدة التألق عبر حلقة ANXA5-GFP لكل مقطع z من مكدس z. (د) توضح الصور متحدة البؤر التطور الزمني للجرح ، حيث يتراكم ANXA5-GFP في محيط الجرح مباشرة بعد الإصابة ، يليه تثبيت الجرح. تم التقاط الأطر الزمنية المسماة 1-6 على فترات 0.66 ثانية لكل إطار. شريط المقياس هو 2 ميكرومتر. (ه) تم تحديد أنصاف أقطار الجروح كدالة لعمق الجرح بناء على الطريقة المعروضة في اللوحة A. (F) تم تحليل ميل الجرح على أنه أنصاف أقطار حلقة ANXA5 كدالة لارتفاع z بناء على البيانات المستخرجة من اللوحة E. (G) تم قياس ملامح خط شدة التألق عبر حلقة ANXA5-GFP من اللوحة D ، حيث يشار إلى كل فاصل زمني 1-6 على أنه شريحة 1-6. أخيرا ، (H) يتم تقديم التطور الزمني لأنصاف أقطار حلقة ANXA5-GFP كدالة للوقت المحسوب من البيانات الموجودة في اللوحة G. هذا الرقم مستنسخ من مورينو بيسكادور وآخرون. al16 بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالمقارنة مع الهياكل الشبيهة بالحلقة التي تشكلت عن طريق تعطيل PM وحده (الشكل التكميلي 1) ، قد تؤثر الإصابات القريبة من النواة (الشكل التكميلي 2A) على تطور الجرح وهندسته. في بعض الأحيان ، كان جزء صغير فقط من حلقات ANXA واضحا (الشكل التكميلي 2B ، C) ، والذي يمكن تحليله أيضا باستخدام سير عمل تحليل MATLAB الداخلي (انظر القسم 5) ، على الرغم من احتمال فقد بيانات إضافية. عادة ، تقع تكوينات حلقة ANXA التي لوحظت في الخلايا غير الملتصقة (الشكل التكميلي 2C) بالقرب من كل من النواة ومحيط الخلية. نتيجة لذلك ، يمكن ملاحظة بنية حلقة أكثر استطالة ، وهو دون المستوى الأمثل لتحليل البيانات المقدمة. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن الخلايا غير الملتصقة أكثر عرضة لموت الخلايا بعد إصابة PM. علاوة على ذلك ، عند النظر في الإصابات الناتجة عن تشعيع مجاميع AuNP ، من المهم ملاحظة أن هذه الإصابات قد تكون أكثر حدة وأقل قابلية للسيطرة. ويرجع ذلك إلى الزيادة الكبيرة في التسخين البلازموني ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بجزء كبير من الخلية. نتيجة لذلك ، لم يتم دمج هذه الإصابات في تحليل حلقة ANXA5.

علاوة على ذلك ، تشير النتائج الأولية إلى أن اضطراب غشاء البلازما باستخدام البلازمونات الحرارية يؤدي إلى ارتفاع مستويات الكالسيوم2+ داخل الخلايا. وقد لوحظ هذا حتى عند التشعيع منخفض الكثافة ل AuNPs المفردة ، مما يشير إلى نفاذية PM35 ، كما هو موضح في الشكل 4. لوحظ تدفق الكالسيوم2+ في الخلايا التي تعبر عن مسبار الكالسيوم المرتبط بالغشاء ، GCaMP6s-CAAX ، والذي يخضع لتغيير مطابق عند تدفق Ca2+ ، وبالتالي ، يمكن ملاحظة زيادة في شدته64. تم تحديد كثافة الكالسيوم لكامل بصمة الخلية بمرور الوقت. للتخلص من ضوضاء الخلفية ، تم طرح مستوى الخلفية Ca2+ قبل تعطيل الغشاء وإصلاح ما بعد الغشاء. تم تحديد الحد الأقصى للشدة عن طريق تطبيع متوسط شدة Ca2+ داخل الخلية ، مما أدى إلى منحنى شدة يظهر زيادة أولية سريعة في شدة Ca2+ متبوعة بانخفاض أبطأ ، كما هو موضح في الشكل 4B.

وصلت الخلية إلى أقصى كثافة للكالسيوم عند ~ 6.6 ثانية ، وهو ما يتوافق مع نتائج Klenow et al.64 ، الذي اقترح أن وقت ذروة شدة الكالسيوم (t = tc) يتوافق مع الوقت اللازم لإغلاق الجرح. ومع ذلك ، في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات لتحديد الآلية الأساسية لإصلاح الغشاء والتئام الجروح ، أظهرت النتائج الأولية أن عملية Ca2+ هذه لوحظت حصريا في الخلية المصابة وليس في الخلية غير المصابة المستخدمة كعنصر تحكم إيجابي. هذا يؤكد أن الخلية شهدت تدفق Ca2+ عند اضطراب الغشاء الحراري ، حيث يتم ضخ الكالسيوم الزائد داخل الخلايا بنشاط بعد PMR الناجح حيث لم يعد مستوى الكالسيوم داخل الخلايا في منافسة مع تدفق Ca2+ ، مما أدى في النهاية إلى تحقيق توازن الخلية64.

Figure 4
الشكل 4: يحدث تدفق الكالسيوم عندما يتمزق الغشاء البلازمي للخلية HEK293T بواسطة البلازمونات الحرارية. تظهر سلسلة من الصور متحدة البؤر خليتين (الخلية محل الاهتمام وخلية غير مصابة تستخدم كعنصر تحكم إيجابي) تعبر عن مسبار الكالسيوم المرتبط بالغشاء ، GCaMP6s-CAAX. يبلغ قياس شريط المقياس 10 ميكرومتر. (أ) قبل التشعيع، عند الساعة 00:00 ث، يرسم الخط الرمادي المنقط بصمة الخليتين، ويرمز إلى موقع التشعيع بالدائرة الصفراء. عند تشعيع الليزر ، لوحظ تدفق سريع ل Ca2+ ، ليصل إلى أقصى كثافة عند ~ 6.6 ثانية ، يشار إليه بالخط البرتقالي المتقطع ، وهي نقطة زمنية يفترض أنها تتوافق مع وقت إغلاق الجرح64. (ب) تمت مقارنة ملف تعريف كثافة الكالسيوم الذي تم الحصول عليه من مسبار GCaMP6s-CAAX في الخلية المصابة (الخط الأزرق) بكثافة الكالسيوم2+ في خلية مجاورة غير مصابة (خط منقط رمادي) ، مما يدل على تدفق Ca2+ واضح حصريا عند اضطراب PM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تسلط الدراسة الضوء على النهج الحراري كتقنية واعدة لاستكشاف استجابات البروتين في الخلايا الحية والأغشية النموذجية بعد تعطل الغشاء. لا توفر هذه الطريقة معلومات شاملة عن تجنيد البروتين فحسب ، بل توفر أيضا عن الوظيفة الفيزيائية الحيوية للبروتينات المشاركة في ديناميكيات غشاء البروتين. وبالتالي ، فإنه يسهل تحديد المكونات الجزيئية المسؤولة عن إصلاح السطح ويعزز فهم الآلية المعقدة والحيوية لإصلاح غشاء البلازما. على الرغم من وجود طرق مختلفة لإحداث اضطراب في الغشاء ، مثل التقنيات الميكانيكية والكيميائية والبصرية ، إلا أن هذه الطرق تعاني من قيود ، مثل كونها غير خاصة بالخلايا ، أو تولد إصابات متعددة لغشاء الخلية ، أو تسبب أضرارا كبيرة للغشاء وتزيل المواد الخلوية الداخلية على طول مسار الليزر عند استخدام الليزر النبضي عالي الطاقة. في حين أن دمج المجهر متحد البؤر والملاقط البصرية يوفر المعلومات الأكثر شمولا ، يمكن أيضا استخدام طرق التصوير البديلة. على سبيل المثال ، نظرا لأن تصوير الجسيمات النانوية البلازمونية يتم تحقيقه باستخدام المجهر الانعكاسي ، فإن وضع التصوير المدمج في مجاهر Leica متحدة البؤر ، يمكن استخدام تقنيات تصوير إضافية ، مثل المجهر المظلم65,66 ، وطرق التشتت الأخرى مثل iSCAT67,68 ، أو وضع العلامات الفلورية للجسيم النانوي ، لتصور AuNP ، على الرغم من أن هذا قد يحد من قابلية تطبيق الطريقة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطريقة المقدمة قادرة على إحداث ثقوب نانوية في الأغشية النموذجية ، مما يتيح التحقيق في تأثيرات التآزر بين الملحقات المختلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تغليف المرفقات المؤتلفة ذات العلامات المختلفة ، على سبيل المثال ، RFP و GFP ، على التوالي ، متبوعة بثقب بالحرارة. يوفر هذا النظام النموذجي نظرة ثاقبة حول كيفية تفاعل الملحقات مع الأغشية بالقرب من الحواف الحرة ، كما هو موضح في الشكل 2D. ومع ذلك ، على عكس الخلايا ، تستمر الثقوب التي لحقت ب GUVs في التوسع ، يليها زعزعة استقرار الحويصلة. يمكن أن يكون تصوير تطور الثقب باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر أمرا صعبا بسبب التوسع السريع لقطر الثقب ، ولكن يمكن تحقيقه عن طريق التقاط العديد من مداخن z بمرور الوقت. قد تكون الطريقة البديلة هي استخدام قرص دوار متحد البؤر للتصوير بشكل أسرع. علاوة على ذلك ، فإن النهج الحراري البلازموني عادة ما ينتج عنه عدد محدود من النتائج المثلى في الساعة عند تطبيقه على الخلايا المفردة أو تجارب GUV ، عادة من اثنين إلى ثلاثة ، في درجات حرارة العينة بين 20 درجة مئوية و 30 درجة مئوية. للحصول على أدق ملاحظة لديناميكيات غشاء البروتين ، يوصى بإبقاء الخلايا في مخزن مؤقت يحتوي على HEPES واستبدال العينة كل ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن توسيع النافذة التجريبية عن طريق إجراء التجارب في غرفة حضانة الخلية ، أي عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين هذا النهج وتقنيات التصوير الأخرى ، مثل الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، يمكن أن يوفر فهما أعمق للوظيفة الفيزيائية الحيوية وتفاعل البروتينات الرئيسية المشاركة في إصلاح الغشاء على مستوى جزيء واحد. يمكن أن يوفر هذا معلومات مفصلة عن موقع الإصابة ، بما في ذلك هندسة الجرح وموقع بروتينات الملحق ، بالإضافة إلى تحديد اللاعبين الرئيسيين الآخرين المشاركين في إصلاح سطح الغشاء.

من أجل تحقيق أقصى قدر من الفعالية والدقة في إحداث إصابة الغشاء ، من الضروري التحقق من موقع تركيز الليزر قبل كل تجربة والتأكد من أن الموضع المحوري لتركيز الليزر يتزامن مع التركيز البؤري. تعمل هذه المحاذاة على تحسين الكثافة أثناء تصوير AuNP ، مما يؤدي إلى زيادة قصوى في درجة الحرارة المحلية وما يترتب على ذلك من إصابة الغشاء عند انخفاض طاقة الليزر. يتم تنفيذ هذه العملية يدويا وبالتالي فهي عرضة للتغير في كفاءة تمزق الغشاء حيث يتم ترجمة التركيز يدويا إلى موضع يتزامن مع موقع الجسيم. في المجاهر التي تفتقر إلى وضع الانعكاس ، كما هو الحال في بعض الأنظمة التجارية ، يمكن أن يكون التوطين المشترك لتركيز الليزر والجسيمات أمرا صعبا. في مثل هذه الحالات، يمكن استخدام أوضاع تصوير بديلة (على سبيل المثال، المجال الساطع)، ويمكن إجراء مسح نقطي بطيء حول موضع الجسيمات المتوقع. وتجدر الإشارة إلى أن طاقة الليزر المنخفضة من المحتمل أن تحفز نفاذية الغشاء فقط ، في حين أن طاقة الليزر العالية يمكن أن تولد درجات حرارة حول NP تتجاوز نقطة غليان الماء ، حتى لو كان لسطح الزجاج تأثير تبريد. تشير التقديرات إلى أن تكوين الفقاعات النانوية المحيطة ب NPs يحدث بين 200 °C و 300 °C25,48 ، حيث قد تؤدي الحرارة المتفجرة إما إلى إزاحة الجسيمات من تركيز الليزر أو تجزئة الجسيمات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تكوين نانو أو فقاعات دقيقة أثناء التسخين يشكل تحديا لهذه الطريقة. نظرا لأن واجهات الهواء تزيل الأغشية الرطبة ويمكن أن تسبب زعزعة استقرار البروتين ، وهو أمر غير مرغوب فيه ، فمن الضروري الحد من التسخين عند التحقيق في إصلاح الغشاء. والجدير بالذكر أن الأصداف النانوية الذهبية لا تتحمل درجات الحرارة المرتفعة وسوف تتحلل في ظل هذه الظروف ، كما يتضح من الفحص المجهريعالي الدقة 58.

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لاستخدام البلازمونات الحرارية لإجراء ثقوب موضعية للغاية في الأغشية ، والتي تنطبق على كل من الخلايا والأغشية النموذجية. لتقليل مدى التسخين بشكل أكبر ، يمكن استخدام رنين الجسيمات النانوية الأصغر مع ضوء NIR ، مما يتيح الثقوب داخل الخلايا في الإندوسومات والشبكة الإندوبلازمية والغلاف النووي. يمكن استخدام هذه الجسيمات النانوية ، بما في ذلك القضبان و nanomatryoshkas48 ، للتحقيق في إصلاح الغلاف النووي من خلال استهداف جسيمات الذهب النانوية الداخلية التي يتم امتصاصها بسهولة على سطح الخلية وتهريبها نحو النواة69. بشكل عام ، تتيح هذه التقنية تحديد وفحص المكونات الجزيئية الرئيسية المشاركة في PMR ، وتوضيح وظيفتها الفيزيائية الحيوية ودورها مع الحفاظ على صلاحية الخلايا.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر Jesper Nylandsted لتزويدنا ببروتينات الملحق المؤتلف وترميز البلازميدات للملحقات. تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المجلس الدنماركي للبحوث المستقلة والعلوم الطبيعية (DFF-4181-00196) ، من قبل برنامج التآزر متعدد التخصصات لمؤسسة نوفو نورديسك 2018 (NNF18OC0034936) ، واللجنة العلمية جمعية السرطان الدنماركية (R90-A5847-14-S2) ، ومؤسسة Lundbeck (R218-2016-534) ، ومركز التميز التابع لمؤسسة Lundbeck (الأغشية الحيوية في الطب النانوي).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1064 nm trapping laser Spectra Physics N/A Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold Nanoshells NanoComposix NCXGSIR150
200 nm Gold Nanoparticles BBI Solutions EM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwell MATTEK P35G-1.5-14-C
Amber-glass vials Supelco Sigma Aldrich 243438
Annexin A2 plasmids N/A N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-casein Sigma Life Science C6905-1G
CaCl2 Suprlco (sigma Aldrich) 10035-04-8
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702
Chloroform VWR Chemicals 67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface) Thermo scientific 150460
DID cell-labelling Solution Invitrogen  7757
Distilled water Gibco 15230-089
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Dissolved in chloroform 
DOPS Avanti Polar Lipids 840035C Dissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's Medium Thermo Fisher Scientific 11995065
FIJI ImageJ distribution ImageJ2 N/A
GCaMP6s-CAAX N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 11573397 10% of the culture medium
Glucose PROLABO 24 374.297
Hamilton syringes Hamilton Company N/A 50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 Harrick Plasma N/A
HEK293T cells N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) Leica N/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 Leica N/A
Leica SP5 confocal scanning microscope Leica N/A
Lipofectamine Fisher Scientific 15338030
MatLab The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States N/A
NaCl VWR Chemicals 7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum Medium Thermo Fisher Scientific 11058021
Parafilm Bemis PM-992
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 1% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20)  Physik Instrumente (Germany) N/A
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920-100ML 0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich 363065-25G
round glass slide 25 mm Ø VWR 631-1584
Sonicator Brandson 2800 Brandson N/A
sucrose Sigma Life Science 57-50-1
T25 tissue culture flask Falcon 353108 Blue Vented cap
Tris-HCl Invitrogen  15567-027
TrypLE Thermo Fisher Scientific A1285901
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 11590626
 VWR Mixer mini vortex 230V EU VWR  12620-84  ECN: 444-2790, SN: 150713022

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendix, P. M., et al. Interdisciplinary synergy to reveal mechanisms of annexin-mediated plasma membrane shaping and repair. Cells. 9 (4), 1029 (2020).
  2. Gajic, O., Lee, J., Doerr, C. H., Berrios, J. C., Myers, J. L., Hubmayr, R. D. Ventilator-induced Cell Wounding and Repair in the Intact Lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 1057-1063 (2003).
  3. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. The American Journal of Pathology. 140 (5), 1097-1109 (1992).
  4. Yu, Q. C., McNeil, P. L. Transient disruptions of aortic endothelial cell plasma membranes. The American Journal of Pathology. 141 (6), 1349-1360 (1992).
  5. Boye, T. L., et al. Annexin A4 and A6 induce membrane curvature and constriction during cell membrane repair. Nature Communications. 8, 1623 (2017).
  6. Bischofberger, M., Gonzalez, M. R., van der Goot, F. G. Membrane injury by pore-forming proteins. Current Opinion in Cell Biology. 21, 589-595 (2009).
  7. Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells. Science (New York, N.Y.). 356, 1022-1025 (2017).
  8. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair: Dealing with life's little traumas. Bioarchitecture. 1, 114-121 (2011).
  9. Sønder, S. L., et al. Annexin A7 is required for ESCRT III-mediated plasma membrane repair. Scientific Reports. 9, 6726 (2019).
  10. Andrews, N. W., Almeida, P. E., Corrotte, M. Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 24 (12), 734-742 (2014).
  11. Idone, V., Tam, C., Goss, J. W., Toomre, D., Pypaert, M., Andrews, N. W. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. The Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  12. Lauritzen, S. P., Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins are instrumental for efficient plasma membrane repair in cancer cells. Seminars in Cell & Developmental Biology. 45, 32-38 (2015).
  13. Häger, S. C., Nylandsted, J. Annexins: players of single cell wound healing and regeneration. Communicative & Integrative Biology. 12 (1), 162-165 (2019).
  14. Jaiswal, J. K., et al. S100A11 is required for efficient plasma membrane repair and survival of invasive cancer cells. Nature Communications. 5, 3795 (2014).
  15. Draeger, A., Monastyrskaya, K., Babiychuk, E. B. Plasma membrane repair and cellular damage control: The annexin survival kit. Biochemical Pharmacology. 81 (6), 703-712 (2011).
  16. Moreno-Pescador, G. S., et al. Thermoplasmonic nano-rupture of cells reveals annexin V function in plasma membrane repair. Nanoscale. 14 (21), 7778-7787 (2022).
  17. Zhivotovsky, B., Orrenius, S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective from the cell death community. Cell Calcium. 50 (3), 211-221 (2011).
  18. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: From structure to function. Physiological Reviews. 82 (2), 331-371 (2002).
  19. Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. Two-way traffic on the road to plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 18 (11), 552-559 (2008).
  20. Boye, T. L., et al. Annexins induce curvature on free-edge membranes displaying distinct morphologies. Scientific Reports. 8, 10309 (2018).
  21. Bouter, A., et al. Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair. Nature Communications. 2, 270 (2011).
  22. Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins in plasma membrane repair. Biological Chemistry. 397 (10), 961-969 (2016).
  23. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  24. Numata, T., Tatsuta, H., Morita, Y., Otani, Y., Umeda, N. Localized thermal processing with a laser-trapped and heated metal nanoparticle. IEEJ Transactions on Electrical and Electronic Engineering. 2, 398-401 (2007).
  25. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  26. Kyrsting, A., Bendix, P. M., Stamou, D. G., Oddershede, L. B. Heat profiling of three-dimensionally optically trapped gold nanoparticles using vesicle cargo release. Nano Letters. 11 (2), 888-892 (2011).
  27. Andersen, T., Kyrsting, A., Bendix, P. M. Local and transient permeation events are associated with local melting of giant liposomes. Soft Matter. 10 (24), 4268-4274 (2014).
  28. Bahadori, A., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Hot-nanoparticle-mediated fusion of selected cells. Nano Research. 10, 2034-2045 (2017).
  29. Rørvig-Lund, A., Bahadori, A., Semsey, S., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Vesicle fusion triggered by optically heated gold nanoparticles. Nano Letters. 15 (6), 4183-4188 (2015).
  30. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Ruhoff, V. T., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic vesicle fusion reveals membrane phase segregation of influenza spike proteins. Nano Letters. 23 (8), 3377-3384 (2023).
  31. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. SPIE Proceedings. SPIE 9922, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 992211, (2016).
  32. Bahadori, A., Moreno-Pescador, G., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Remotely controlled fusion of selected vesicles and living cells: a key issue review. Reports on Progress in Physics. 81 (3), 32602 (2018).
  33. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic induced vesicle fusion for investigating membrane protein phase affinity. bioRxiv. , (2022).
  34. Pescador, G. S. M., et al. Investigating plasma-membrane repair employing thermoplasmonics. Biophysical Journal. 120 (3), 45A (2021).
  35. Moreno-Pescador, G. S., Qoqaj, I., Thusgaard Ruhoff, V., Iversen, J., Nylandsted, J., Bendix, P. M. Effect of local thermoplasmonic heating on biological membranes. SPIE 11083, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XVI. 110830M, (2019).
  36. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current Biology. 9 (11), 579-587 (1999).
  37. Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 4 (139), 139ra85 (2012).
  38. Sudji, I. R., Subburaj, Y., Frenkel, N., García-Sáez, A. J., Wink, M. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 20 (11), 20146-20160 (2015).
  39. Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Intracellular Ca2+ operates a switch between repair and lysis of streptolysin O-perforated cells. Cell Death & Differentiation. 16, 1126-1134 (2009).
  40. Nygård Skalman, L., Holst, M. R., Larsson, E., Lundmark, R. Plasma membrane damage caused by listeriolysin O is not repaired through endocytosis of the membrane pore. Biology Open. 7 (10), bio035287 (2018).
  41. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6004-6009 (2014).
  42. Yeheskely-Hayon, D., Minai, L., Golan, L., Dann, E. J., Yelin, D. Optically induced cell fusion using bispecific nanoparticles. Small. 9 (22), 3771-3777 (2013).
  43. Minai, L., Yeheskely-Hayon, D., Golan, L., Bisker, G., Dann, E. J., Yelin, D. Optical nanomanipulations of malignant cells: Controlled cell damage and fusion. Small. 8 (11), 1732-1739 (2012).
  44. Lukianova-Hleb, E., et al. Plasmonic nanobubbles as transient vapor nanobubbles generated around plasmonic nanoparticles. ACS Nano. 4 (4), 2109-2123 (2010).
  45. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81, 1015-1047 (2005).
  46. Baffou, G., Polleux, J., Rigneault, H., Monneret, S. Super-heating and micro-bubble generation around plasmonic nanoparticles under cw illumination. Journal of Physical Chemistry C. 118 (9), 4890-4898 (2014).
  47. Sasikumar, K., Liang, Z., Cahill, D. G., Keblinski, P. Curvature induced phase stability of an intensely heated liquid. Journal of Chemical Physics. 140 (23), 234506 (2014).
  48. Jauffred, L., Samadi, A., Klingberg, H., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Plasmonic heating of nanostructures. Chemical Reviews. 119 (13), 8087-8130 (2019).
  49. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  50. Bendix, P. M., Jauffred, L., Norregaard, K., Oddershede, L. B. Optical trapping of nanoparticles and quantum dots. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 20, 15-26 (2014).
  51. Samadi, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Optical manipulation of individual strongly absorbing platinum nanoparticles. Nanoscale. 46, 18449-18455 (2017).
  52. Jørgensen, J. T., Norregaard, K., Tian, P., Bendix, P. M., Kjaer, A., Oddershede, L. B. Single particle and PET-based platform for identifying optimal plasmonic nano-heaters for photothermal cancer therapy. Scientific Reports. 6, 30076 (2016).
  53. Goldenberg, H., Tranter, C. J. Heat flow in an infinite medium heated by a sphere. British Journal of Applied Physics. 3 (9), 296-298 (1952).
  54. Eustis, S., El-Sayed, M. A. Why gold nanoparticles are more precious than pretty gold: Noble metal surface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Society Reviews. 35, 209-217 (2006).
  55. Landau, L. D., Lifshitz, E. M. Fluid Mechanics: Landau and Lifshitz: Course of Theoretical Physics. 6, Elsevier. (2013).
  56. Niederauer, C., Seynen, M., Zomerdijk, J., Kamp, M., Ganzinger, K. A. The K2: Open-source simultaneous triple-color TIRF microscope for live-cell and single-molecule imaging. HardwareX. 13, e00404 (2023).
  57. Richardson, A. C., Reihani, N., Oddershede, L. B. Combining confocal microscopy with precise force-scope optical tweezers. SPIE Proceedings:SPIE 6326, Optical Trapping and Optical Micromanipulation III. 632628, (2006).
  58. Samadi, A., Klingberg, H., Jauffred, L., Kjær, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Platinum nanoparticles: a non-toxic, effective and thermally stable alternative plasmonic material for cancer therapy and bioengineering. Nanoscale. 10 (19), 9097-9107 (2018).
  59. ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber for microscopy. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A7816 (2023).
  60. Kreibig, U., Vollmer, M. Theoretical considerations. In: Optical Properties of Metal Clusters. 25, Springer, Berlin, Heidelberg. (1995).
  61. Mie, G. Beiträge zur Optik trüber Medien, speziell kolloidaler Metallösungen. Annalen der Physik. 330 (3), 377-445 (1908).
  62. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  63. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  64. Klenow, M. B., Heitmann, A. S. B., Nylandsted, J., Simonsen, A. C. Timescale of hole closure during plasma membrane repair estimated by calcium imaging and numerical modeling. Scientific Reports. 11, 4226 (2021).
  65. Li, T., Wu, X., Liu, F., Li, N. Analytical methods based on the light-scattering of plasmonic nanoparticles at the single particle level with dark-field microscopy imaging. Analyst. 142 (2), 248-256 (2017).
  66. Gibbs-Flournoy, E. A., Bromberg, P. A., Hofer, T. P. J., Samet, J. M., Zucker, R. M. Darkfield-Confocal Microscopy detection of nanoscale particle internalization by human lung cells. Particle and Fibre Toxicology. 8 (1), 2 (2011).
  67. Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering microscopy: Seeing single nanoparticles and molecules via Rayleigh scattering. Nano Letters. 19 (8), 4827-4835 (2019).
  68. Wu, Y., Ali, M. R. K., Chen, K., Fang, N., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles in biological optical imaging. Nano Today. 24, 120-140 (2019).
  69. Klingberg, H., Oddershede, L. B., Loeschner, K., Larsen, E. H., Loft, S., Møller, P. Uptake of gold nanoparticles in primary human endothelial cells. Toxicology Research. 4 (3), 566-666 (2015).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 203 ، الفيزياء الحيوية ، إصلاح غشاء البلازما ، ملاقط بصرية ، ملحقات ، حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة ، بلازمونات حرارية ، تسرب الغشاء
نهج البلازما الحرارية للتحقيق في إصلاح غشاء البلازما في الخلايا الحية والأغشية النموذجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., … More

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., Moreno-Pescador, G., Bendix, P. M. A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes. J. Vis. Exp. (203), e65776, doi:10.3791/65776 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter