Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En termoplasmonisk tilgang til undersøgelse af plasmamembranreparation i levende celler og modelmembraner

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65776
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1The Niels Bohr Institute, University of Copenhagen, 2Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

Summary

Den termoplasmoniske punkteringsmetode integrerer konfokal mikroskopi, optisk pincet og guldnanopartikler for at studere proteinresponser under plasmamembranreparation i celler og gigantiske unilamellære vesikler. Teknikken muliggør hurtig og lokaliseret membranpunktering, hvilket gør det muligt at identificere nøgleproteiner og deres funktionelle roller i det indviklede plasmamembranreparationsmaskineri.

Abstract

Cellemembranen er afgørende for cellens overlevelse, og det er vigtigt at sikre dens integritet, da cellen oplever skader gennem hele sin livscyklus. For at forhindre beskadigelse af membranen har celler udviklet effektive plasmamembranreparationsmekanismer. Disse reparationsmekanismer kan studeres ved at kombinere konfokal mikroskopi og nanoskala termoplasmonik for at identificere og undersøge rollen som nøgleproteiner, såsom annexiner, involveret i overfladereparation i levende celler og membranmodelsystemer.

Punkteringsmetoden anvender en laser til at inducere meget lokaliseret opvarmning ved nanopartikelbestråling. Brugen af nær-infrarødt lys minimerer fototoksicitet i den biologiske prøve, mens størstedelen af absorptionen finder sted i den nær-infrarøde resonans plasmoniske nanopartikel. Denne termoplasmoniske metode er blevet udnyttet til potentiel fototermisk og biofysisk forskning for at forbedre forståelsen af intracellulære mekanismer og cellulære reaktioner gennem vesikel- og cellefusionsundersøgelser. Tilgangen har vist sig at være komplementær til eksisterende metoder til membranforstyrrelser, såsom mekanisk, kemisk eller optisk induceret skade, og giver et højt niveau af kontrol ved at påføre ekstremt lokaliserede skader. Omfanget af skaden er begrænset til nærheden af den sfæriske nanopartikel, og der opstår ingen skadelig skade langs strålebanen i modsætning til pulserende lasere, der bruger forskellige bølgelængder. På trods af visse begrænsninger, såsom dannelsen af nanobobler, tilbyder den termoplasmoniske metode et unikt værktøj til at undersøge cellulære reaktioner i plasmamembranreparation i et næsten naturligt miljø uden at gå på kompromis med cellelevedygtigheden.

Når den integreres med konfokal mikroskopi, kan punkteringsmetoden give en mekanistisk forståelse af membrandynamikken i modelmembransystemer samt kvantitativ information om proteinresponser på membranskader, herunder proteinrekruttering og deres biofysiske funktion. Samlet set kan anvendelsen af denne metode på reducerede modelsystemer forbedre vores forståelse af de indviklede plasmamembranreparationsmaskiner i levende celler.

Introduction

Cellemembranen, der tjener både som en fysisk barriere og en signalplatform, er afgørende for celleoverlevelse1. Gennem hele sin cellecyklus udsættes plasmamembranen (PM) for skader, såsom mekaniske 2,3,4,5 og kemiske6 stressinducerede skader. For at opretholde membranintegritet og sikre celleoverlevelse har cellen udviklet robuste plasmamembranreparationsmekanismer (PMR). Disse mekanismer afhænger af forskellige strategier, såsom cytoskelet reorganisering, membranfusion og membranudskiftningsstrategier 7,8,9,10,11, som alle er afhængige af rekruttering af specifikke proteiner. Især er medlemmer af annexinproteinfamilien blevet identificeret som nøgleproteiner forbundet med processerne i PMR 1,9,12,13,14,15,16. Efter PM-skade oplever cellen en tilstrømning af calciumioner (Ca2+), som udgør en umiddelbar trussel mod cellens overlevelse17. Som reaktion på Ca2+ tilstrømning binder annexinproteiner, som overvejende er placeret i cytosolen, til den indre folder af den beskadigede plasmamembran som en del af PMR-strategierne18. Annexin A2 (ANXA2) var et af de første medlemmer af annexin-familien, der blev forbundet med PMR i dysferlin-mangelfuld muskeldystrofi og blev foreslået at formidle reparation ved at fusionere intracellulære vesikler til PM nær skadestedet 5,19,20,21. Efterfølgende er flere funktioner blevet tilskrevet annexins22, og deres rolle i PMR har fået øget opmærksomhed i løbet af de sidste 20 år. Imidlertid er bilagenes nøjagtige rolle i PMR stadig ikke fuldt ud forstået 15,18,21,22.

Denne artikel foreslår en metode til at undersøge protein-membraninteraktion og membrandynamik på en kontrolleret og meget lokaliseret måde ved hjælp af en kombination af konfokal mikroskopi, optisk pincet og guldnanopartikler (AuNP'er). Denne metode muliggør kvantitativ undersøgelse af protein-, lipid- og små molekyleinteraktioner som reaktion på membranskader og Ca2+ tilstrømning. På trods af kompleksiteten og mangfoldigheden af komponenter, der er involveret i membranreparationsprocessen, er forenklede membransystemer, der efterligner plasmamembranen, blevet anvendt til at opnå en dybere mekanistisk forståelse af membrandynamik og annexinproteiners respons på membranforstyrrelser16. Gigantiske unilamellære lipidvesikler (GUV'er) blev valgt som modelmembransystem med en specificeret lipidsammensætning. GUV'erne blev genereret ved hjælp af gelassisteret hydreringsmetode, specifikt polyvinylalkoholgelhydrering, som beskrevet af Weinberger et al.23, hvilket muliggjorde effektiv indkapsling af annexiner i GUV'er.

Anvendelsen af nærinfrarød (NIR) laserbestråling på metalliske nanopartikler (NP'er) inducerer betydelig opvarmning af NP, hvilket gør det til en effektiv metode til at etablere en lokal varmekilde, der udnyttes i biomedicinske applikationer24. Metoden blev oprindeligt brugt til direkte at måle temperaturen omkring en enkelt AuNP i både 2D og 3D biomimetiske assays. I disse assays 25,26 blev de plasmoniske nanopartikler bestrålet på et understøttet lipiddobbeltlag eller optisk fanget nær GUV'er, der gennemgik en lokal termisk faseovergang ved lokal opvarmning, hvilket muliggjorde kvantificering og kontrol af den nøjagtige temperaturprofil omkring partiklen. Denne referencetemperaturprofil er blevet anvendt ved undersøgelse eller manipulation af biologiske prøver. Yderligere fremskridt i metoden har lettet induktionen af nanoskopiske porer i membraner27, hvilket muliggør vesikel og cellefusion 28,29. Andre undersøgelser har undersøgt opførsel af perifere membranproteiner i GUV'er29 og transmembranproteiner30 ved at skabe nye hybridvesikler, mens cellespecifik lægemiddellevering også er blevet undersøgt for at kontrollere og studere cellulære reaktioner eller genekspression 28,29,31,32,33. For nylig er metoden blevet brugt til at undersøge proteinresponser på membranskader 32,34,35.

Der findes flere metoder til at forstyrre plasmamembranen for at udforske cellulære reaktioner og membranreparation. Disse omfatter mikronålepunkteringer, mikroperlerystelser og celleskrabning, som alle kan forstyrre cellemembranen mekanisk 14,36,37. Kemisk induceret skade kan opnås ved at tilføje vaskemidler 5,38 eller bakterielle toksiner39,40, der destabiliserer lipiddobbeltlaget og genererer membranporer over plasmamembranen. Desuden er optisk inducerede skader ved kontinuerlige bølge- og pulserende lasere blevet anvendt til at studere PMR-komponenter, såsom annexinproteiner 5,14,21,41, i kombination med plasmoniske nanopartikler 42,43,44,45. På trods af effektiviteten af pulserende lasere med høj effekt kan de forårsage betydelige skader og skader på cellens indre langs strålebanen. Desuden mangler de detaljerede ændringer, der sker i det biologiske stof ved pulserende laserbestråling, og om det skaber en veldefineret pore, at blive undersøgt yderligere. En alternativ metode præsenteres i denne artikel, der anvender termoplasmonik til at inducere nanoskopiske huller i PM på en kontrolleret måde34,35 uden at forårsage væsentlig skade på de interne strukturer. Dette opnås ved at udsætte plasmoniske NP'er for en meget fokuseret NIR-laser, hvilket resulterer i en ekstremt lokaliseret temperaturstigning, der let kan nå temperaturer over 200 ° C, hvilket kan føre til små nanoskopiske eksplosioner 25,46,47. Denne proces kan styres ved at justere laserintensiteten samt størrelsen, formen og sammensætningen af NP'erne48. Ved at anvende denne teknik kan forskere undersøge proteiners rolle i PM-reparation i levende celler, hvilket kan hjælpe med at løse nogle af de ubesvarede spørgsmål vedrørende involvering af annexinproteiner i membranreparation uden at gå på kompromis med cellelevedygtigheden.

Den optiske fangst af plasmoniske nanopartikler er blevet veletableret af tidligere undersøgelser 25,49,50,51,52; yderligere indsigt i nanopartiklernes termoplasmoniske egenskaber 53,54,55 kan dog opnås i de supplerende materialer (supplerende fil 1). Den termoplasmoniske metode kan bruges til at skabe nanoskopiske huller i PM med det formål at studere de cellulære respons- og reparationsmekanismer. Mere præcist kan punkteringen opnås gennem optisk opvarmning af AuNP'er tæt på membranen, som vist i figur 1A og B. Denne lokaliserede punktering muliggør Ca2+ tilstrømning, som blev verificeret af en calciumsensor, hvilket aktiverede PMR-maskineriet. Til levende celleeksperimenter blev AuNP'er med en diameter på 200 nm immobiliseret på overfladen under cellen for at overvåge ANXA2's rolle i PMR via konfokal mikroskopi. NIR-laseren (figur 1A, B) med en bølgelængde på 1064 nm bestråler AuNP og udnytter dens plasmoniske egenskaber (figur 1C), hvilket resulterer i betydelig lokal opvarmning (figur 1D) i det biologiske gennemsigtighedsvindue49, samtidig med at den forårsager minimal skade på selve cellen. Højtemperaturområdet omkring AuNP falder hurtigt med 30-40% i en afstand svarende til NP's radius, som vist i figur 1E, hvilket giver mulighed for en ekstremt begrænset skade i alle tre dimensioner.

Supplerende dossier 1. Klik her for at downloade denne fil.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over forsøgsmetoden. (A) ANXA-transfekterede celler er placeret oven på immobiliserede guldnanopartikler (AuNP'er) på overfladen, eller (B) gigantiske unilamellære vesikler (GUV'er) med indkapslet ANXA suspenderes i et medium indeholdende AuNP'er. C) En enkelt AuNP bestråles af den optiske NIR-fælde, hvor vekselvirkningen mellem det indkommende elektromagnetiske felt og ledningselektronerne fører til kollektiv svingning af elektroner i NP. (D) Denne proces resulterer i en meget begrænset, men signifikant temperaturstigning. For at estimere temperaturen på NP-overfladen anvendes Mie-teori, og en (E) temperaturprofil beregnes for en AuNP med en diameter på 200 nm og laserintensitet I = 6,36 x 108 W/cm2. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at minimere den termiske effekt på cellemembranen bestråles AuNP'erne kun i ~ 1 sekund. Dette forårsager en forbigående og lokal udbrud af opvarmning, hvilket reducerer skaderne på proteiner, der typisk kræver mere tid at udfolde sig. Ved membranpunktering rekrutteres annexinproteiner i en brøkdel af et sekund, og inden for få sekunder dannes et annexinringlignende stillads omkring skadestedet (figur 2). Denne tilgang er også blevet anvendt til at undersøge involveringen af ANXA5 i både levende celler og modelmembraner16 i et forsøg på at kaste lys over hele reparationsprocessernes plan. Mens det primære fokus har været på den korrelerende rekruttering af forskellige annexinproteiner, er de biofysiske aspekter af reparationsmekanismen endnu ikke belyst.

For fuldt ud at gennemføre den foreslåede metode kræves tre nøglekomponenter: konfokal mikroskopi, optisk pincet og metal nanopartikler. Optisk pincet bruges til at fange AuNP'er, og deres konstruktion kan opnås ved at følge proceduren skitseret af Neuman et al.49. Men hvis opbygning af en optisk pincet viser sig at være for udfordrende, kan en tæt fokuseret NIR-laser bruges til at bestråle AuNP'er, der er immobiliseret under cellerne. Mens sfæriske AuNP'er blev valgt til denne protokol, kunne en række plasmoniske partikler med justerbare absorptionsspektre også anvendes til at opnå en meget lokaliseret temperaturgradient inden for NIR-regionen48.

Fluorescensbilleddannelse er nødvendig for at observere de fluorescerende mærkede proteiners rolle, og derfor kan total intern refleksionsmikroskopi (TIRF)56 betragtes som et alternativ til konfokal billeddannelse. Denne teknik tillader dog kun overfladebilleddannelse og ville ikke være kompatibel med modelmembranvesikeleksperimenterne. Derfor er både den optiske pincet og konfokalmikroskopet afgørende for den præcise lokalisering af nanopartiklen og detaljeret undersøgelse af lokalområdet omkring celleskaden. For effektivt at bestråle nanopartiklen med et diffraktionsbegrænset laserfokus er det nødvendigt at visualisere nanopartiklen. Dette kan opnås optimalt ved refleksionsmikroskopi, som er en standardbilleddannelsesfunktion i Leica konfokale mikroskoper. Men hvis refleksion eller spredningsbilleddannelse ikke er tilgængelig, kan alternative metoder, såsom den mindre effektive fluorescerende AuNP-mærkning, overvejes.

Sammenfattende har den meget kontrollerbare og lokaliserede termoplasmoniske metode, der præsenteres i denne undersøgelse, potentialet til at tjene som en fremragende platform til at undersøge de molekylære komponenter, der er involveret i cellulære reaktioner og PM-reparationsmekanismer i levende celler. Ud over at studere proteinresponset ved PM-skader kan denne tilgang også bruges til lokalt punktering af vesikler, hvilket muliggør en undersøgelse af proteinresponset i både protein-protein og protein-membrandynamik. Desuden giver denne metode mulighed for en kvantitativ analyse af interaktionerne mellem proteiner, lipider og små molekyler, når membraner forstyrres. Samlet set har disse fremskridt potentialet til at kaste lys over nogle af de uløste spørgsmål vedrørende de indviklede og komplekse plasmamembranreparationsmaskiner.

Protocol

1. Forberedelse af cellemembranpunktur

  1. Cellesåning (dag 1)
    1. Kulturér humane embryonale nyreceller (HEK293T) i dyrkningsmedium ved 37 °C i en 5% CO2 luftfugterinkubator, indtil de når 70% sammenløb.
    2. Fjern cellerne fra overfladen ved hjælp af 500 μL trypsin, tæl 200.000 HEK293T celler, og frø dem i en kulturskål med et samlet volumen på 3 ml dyrkningsmedium. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 luftfugter inkubator i 24 timer.
      BEMÆRK: For at forhindre celleklynger i midten af skålen skal du sprede cellerne jævnt og undgå at hvirvle skålen, da dette kan reducere transfektionseffektiviteten.
  2. Celletransfektion (dag 2)
    BEMÆRK: De transfekterede celler kan bruges op til 48 timer efter transfektion.
    1. Pipet plasmidet af interesse og transfektionsreagenset i 5 s før brug.
    2. I et sterilt 2 ml glas blandes følgende i den specifikke rækkefølge: 500 μL reduceret serummedium, 5 μL transfektionsreagens (4 gange mere end plasmidet) og 1,25 μL plasmid (1 μg / μL).
      BEMÆRK: For at undersøge calciumtilstrømning ved membranbrud skal du følge samme procedure, men bruge den membranbundne calciumsensorsonde GCaMP6-CAAX (1 μg / μL).
    3. Afpipetter forsigtigt men grundigt transfektionsblandingen og inkuber den ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter, før den tilsættes dråbevis til cellerne.
    4. Før transfektionsblandingen tilsættes, fjernes mediet fra kulturskålen, cellerne vaskes forsigtigt med 2 ml fosfatbufret saltvand og tilsættes 2000 μL reduceret serummedium til skålen.
    5. Cellerne inkuberes sammen med transfektionsblandingen ved 37 °C i en 5% CO2 luftfugterinkubator i 2 timer og 45 minutter, før substratet skiftes til 3 ml dyrkningsmedium.
  3. Fremstilling af guldnanopartikel (AuNP) opløsning (dag 2)
    1. Vortex 200 nm AuNP-stamopløsningen til 10 s på niveau 10 (se materialetabel for yderligere specifikation af apparater), sonikat i 5 minutter (maks. amplitude) og hvirvel igen i 10 s.
    2. Bland 150 μL AuNP'er med 850 μL destilleret vand til et samlet volumen på 1 ml.
      BEMÆRK: Den fortyndede AuNP-opløsning kan opbevares i køleskabet og genbruges i op til 1 måned.
  4. Tilberedning af forsøgsretten (dag 2)
    1. Overtræk mikrobrøndskålen med 150 μL 0,01% -0,1% cellefastgørelsesopløsning og inkuber i 15 minutter ved RT.
    2. Vask glasoverfladen to gange med 500 μL destilleret vand og lad den lufttørre i ~10 min.
    3. Tilsæt 80 μL AuNP-opløsning dråbevis til den tørre overflade.
      BEMÆRK: Vortex (10 s), sonikat (5 min) og hvirvel (10 s) den fortyndede AuNP-opløsning, før den tilsættes til den belagte glasoverflade for at minimere AuNP-aggregater.
    4. Vent i ~ 10 minutter, før du introducerer 1,5 ml kulturmedium. Lad retten inkubere ved 37 °C natten over.
  5. Forberedelse af forsøgskammeret (dag 3)
    BEMÆRK: Forsøgskammeret kan fremstilles på enten dag 3 eller 4; Sørg dog for, at følgende præparater udføres samme dag som eksperimentet.
    1. Fjern mediet fra cellerne i dyrkningsskålen og vask cellerne med 2 ml fosfatbufret saltvand.
      BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at fjerne eventuelt resterende medium og snavs, der kan forstyrre de efterfølgende trin.
    2. Tilsæt 500 μL enzymbaseret celleløsrivelsesopløsning til brønden og inkuber i 1-3 minutter, indtil cellerne har løsnet sig fra dyrkningsskålen.
    3. Tilsæt 1,5 ml frisk dyrkningsmedium og pipette celleopløsningen for at få en homogen celleopløsning for at minimere sandsynligheden for celleklynger.
    4. Fjern forsigtigt mediet fra AuNP'erne i den eksperimentelle mikrobrønd.
    5. Celleopløsningen (2 ml) tilsættes mikrobrønden, og den får lov til at inkubere i mindst 5 timer, før eksperimentet udføres.
      BEMÆRK: For optimale eksperimentelle forhold skal du undgå at hvirvle kammeret, da dette kan få celler til at klynge sig i midten af kammeret.

2. Cellemembran punkteringseksperiment

  1. Optiske indstillinger af eksperimentet
    1. Udfør eksperimenterne ved hjælp af et konfokal scanningsmikroskop kombineret med en 1064 nm fældelaser57.
    2. Udfør den optiske fangst på brændplanet ved hjælp af et 63x vandnedsænkningsmål med en numerisk blænde (NA) på 1,2.
    3. Antag, at fokus er på størrelse med en Airy-skive, og at bestrålingslaserens brændvidde er ~ 540 nm i radius.
    4. Konverter lasereffekten (P) til den tilsvarende laserintensitet (I) ved at beregne lasereffekten pr. område (W/cm2).
    5. Brug en acousto optisk strålesplitter (AOBS) til at visualisere flere fluorescerende signaler, der registreres ved hjælp af fotomultiplikatorrør og samtidig detektion af metalliske NP'er via deres spredningssignal.
      BEMÆRK: Ikke alle konfokale systemer er udstyret med AOBS, som tillader refleksionsbilleddannelse af metalliske NP'er. Her skal andre former for detektion implementeres, eller en sekventiel scanning af NIR-laseren i området under cellen kan forsøges.
    6. Under de eksperimentelle sessioner monteres et åbent kammer med glasbund, der indeholder celler, molekylære fluorescerende sonder og guldnanopartikler på mikroskopet.
    7. Flyt fælden i forhold til cellerne ved at oversætte prøven monteret på et piezoelektrisk trin, hvilket muliggør nanometerpræcise laterale bevægelser16.
      BEMÆRK: Den optiske fælde holdes stille.
  2. Eksperimentelle indstillinger for cellemembranpunktur
    1. Anbring HEK293T celler, transfekteret med annexinplasmider kombineret med et fluorescerende protein, oven på isolerede AuNP'er, der er immobiliseret på glasoverfladen (figur 1A).
    2. Brug en Argon 488 nm laser til at visualisere GFP-fluorescenssignalet og en HeNe 633 nm laser til observation af AuNP-refleksion i scanningskonfokalmikroskopet.
    3. Anvend den optiske pincet, der fungerer med en 1064 nm NIR-laser, til at bestråle en enkelt AuNP i ~ 1 s, hvilket inducerer en signifikant lokal temperaturstigning, der forstyrrer plasmamembranen.
    4. Bestråling mellem 200-295 mW påføres den fokuserede partikel, hvilket resulterer i en væsentlig temperaturstigning.
      BEMÆRK: Der er et betydeligt tab af strøm i optikken, hvor lasereffekten ved brændpunktet når omkring 20% af den angivne milliwatt, afhængigt af den specifikke opsætning. Den specifikke intensitet (målt i W/cm2) afhænger af systemets nøjagtige justering, specifikt brændvidden. Derudover er varmeledningen af glas højere end for celle og vand, og følgelig reduceres mængden af varme, der frigives til plasmamembranen, lidt48,58.
    5. Opnå effektiv og lokaliseret PM-skade og efterfølgende proteinreparationsrespons ved korrekt kalibrering af lokaliseringen af NIR-laserfokuspunktet. Dette opnås ved at fange en enkelt AuNP suspenderet i det samme billedmedium og sikre, at den valgte AuNP er i fokus inden bestråling.
      BEMÆRK: Nanopartiklen anses for at være i fokus, når dens spredningssignal ser skarpest ud, dvs. udviser klare kanter og fraværet af en glorie omkring partiklen, når den observeres i konfokalmikroskopi (figur 2C (ii)).
  3. Celle- og AuNP-tæthedsbetingelser
    1. Vælg enkeltceller i stedet for celleklynger for at forhindre overlapning af plasmamembraner.
      BEMÆRK: Cellerne skal klæbes til overfladen og udvise en flad morfologi (supplerende figur 1), som tillader punktering af celleperiferien og samtidig forhindrer beskadigelse af kernemembranen (supplerende figur 2).
    2. Inkuber cellerne i henhold til protokollen, eller indtil de har bundfældet sig og fladt ud for at forhindre AuNP-cellulær optagelse. Undgå overdreven inkubationstid og reducer sandsynligheden for AuNP-endocytose ved anvendelse af PEGylerede AuNP'er.
    3. Sørg for, at de immobiliserede AuNP'er er til stede som enkeltpartikler, tilstrækkeligt adskilt fra hinanden for at forhindre aggregater. Aggregater kan føre til en betydelig stigning i den termiske gradient, hvilket resulterer i forhøjede temperaturer, der kan forstyrre en betydelig del af cellen.
    4. Udskift prøven hver 1-2 time for at opretholde cellesundheden.
      BEMÆRK: Langvarig eksponering kan føre til en forringelse af cellesundheden, hvilket kompromitterer deres evne til at reagere nøjagtigt på skader med hensyn til membranreparation. Dette fald i cellesundhed observeres typisk ved en ændring i celleform, da celler ser mere sfæriske og mere stive ud og til sidst kulminerer i celledød.

Supplerende oplysninger. Klik her for at downloade denne fil.

3. Forberedelse af kæmpe unilamellær vesikel (GUV)

  1. Fremstilling af lipidblandingen
    1. GUV-lipidsammensætningen fremstilles ved at kombinere 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (DOPS) lipider i et molært forhold på 4:1 (se tabel 1). Lipidstammen alikvote i 1,5 ml hætteglas med glas i henhold til forsøgsbehovene og opbevar dem ved -20 °C.
      BEMÆRK: For langvarig lipidkonservering og for at forhindre oxidation af umættede lipider, skal luften erstattes med argon i de aliquoterede hætteglas.
    2. Før du blander lipiderne, skal du rengøre en 50 μL og en 500 μL glas- eller metalsprøjte grundigt med chloroform fem gange for at sikre, at de er fri for forurenende stoffer til de chloroformopløste lipider.
      FORSIGTIG: Håndter chloroform i en damphætte på grund af dets toksicitet.
      1. Det beregnede volumen chloroform overføres til et rent hætteglas af ravfarvet glas efterfulgt af den specificerede mængde af hvert lipid (se tabel 1).
        BEMÆRK: For at undgå krydskontaminering mellem lipidstammer skal du sørge for, at sprøjterne rengøres med chloroform.
      2. Til sidst tilsættes membranfarvestoffet og blandes lipiderne grundigt ved pipettering. Den tilberedte lipidblanding opbevares ved -20 °C til videre anvendelse; Blandingen forbliver levedygtig i 2-3 uger uden væsentlig lipidskade.
        BEMÆRK: Blandingen skal udføres med en metal- eller glassprøjte. Hold altid lipiderne på is, når de er ude af fryseren.
  2. Fremstilling af polyvinylalkohol (PVA) gel
    1. Forbered GUV'erne ved hjælp af gelassisteret hydreringsmetode beskrevet af Weinberger et al.23med mindre ændringer.
      1. Forbered PVA-gelen ved at opløse 5 g PVA i 100 ml buffer indeholdende 50 mM saccharose, 25 mM NaCl og 25 mM Tris (pH 7,4).
      2. PVA-opløsningen opvarmes til 85 °C og omrøres, indtil den bliver gennemsigtig. Lad det køle af til RT og opbevar det i køleskab til videre brug.
        BEMÆRK: PVA er ikke korrekt opløst i bufferen, og det er derfor nødvendigt at opvarme op til 85 °C.
  3. Forberedelse af glasglas
    1. Rengør glasrutsjebanerne med ethanol og lad dem lufttørre. Behandl derefter objektglassene med en luftplasmarenser for at fjerne eventuel resterende forurening fra glasoverfladen.
    2. Fremstilling af PVA-belagte glasglas
      1. PVA-gelen (5%) opvarmes til 60 °C i 30 minutter for at øge dens fluiditet. Påfør 90 μL af den varme PVA på glasglasset, fordel det ensartet, og lad det tørre i et varmeskab ved 50 °C i 50 minutter.
      2. Når PVA-glasglasset er klar, tilsættes 30 μL af den tilberedte lipidblanding ved hjælp af en glas- eller metalsprøjte og spredes i en tynd film ved hjælp af kanylens kant.
      3. Tør lipidblandingen ved at fordampe dens chloroformindhold under let nitrogentryk. Tør endvidere glasset gliderne under vakuum i 1,5-2 timer.
  4. Dyrkning af GUV'er i et kammer
    1. Saml det interne kammer, der ligner en tidligere offentliggjort rapport59, ved hjælp af det forberedte glasglas.
    2. I et separat 2 ml rør fortyndes det rekombinante protein af interesse (i dette tilfælde ANXA5 eller ANXA4) til en slutkoncentration på 500 nM med en voksende buffer (GB) bestående af 80 mM saccharose, 70 mM NaCl og 25 mM Tris-HCl (pH 7,4).
    3. Der tilsættes 400 μL af den fortyndede rekombinante proteinopløsning til kammeret. Inkuber kammeret ved RT i 1 time for at tillade GUV'er at vokse fra det aflejrede lipidlag. Brug den samme buffer, undtagen proteinet, som en negativ kontrol.
      BEMÆRK: Pak kammeret ind i polyolefinfilm for at forhindre bufferfordampning.
    4. GUV'erne opsamles ved at overføre 400 μL af kammerindholdet til et 2 ml rør.
    5. Ikke-indkapslede proteiner fjernes uden for GUV'erne ved at tilsætte 1 ml observationsbuffer (OB) indeholdende 55 mM glucose, 70 mM NaCl og 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) til den opsamlede opløsning. Derefter centrifugeres opløsningen ved 600 x g i 10 minutter ved 13 °C.
    6. Efter centrifugering erstattes 1 ml supernatant med et tilsvarende volumen observationsbuffer. Fordel GUV'erne gennem blid pipettering og opbevar dem i køleskabet, indtil de bruges i GUV-eksperimenter.

4. GUV punkteringseksperiment

  1. Forberedelse af kammeret
    1. Brug en 35 mm skål med glasbund til eksperimentet. For at forhindre GUV'er i at klæbe til overfladen og sprænge, skal du belægge overfladen med β-kasein (5 mg / ml) i 15-30 minutter.
      1. Til β-kaseinopløsningen opløses 0,1 g af proteinet i en buffer på 20 ml på 20 mM Tris (PH 7,5) og 100 mM NaCl. Filtrer proteinopløsningen, alikvote den i små hætteglas, og frys den til videre brug.
    2. Kammeret vaskes to gange med observationsbuffer for at fjerne overskydende frie β-kaseiner fra overfladen og lad det tørre ved RT.
    3. I et separat 2 ml rør blandes de opsamlede GUV'er med OB.CaCl2 tilsættes til blandingen for den ønskede slutkoncentration (i dette tilfælde 200 μM).
    4. Indfør 150 nm guld nanoskaller (AuNS'er) til blandingen i et forhold på 1:100. Den endelige blanding består af 250 μL GUV'er, 225 μL OB, 20 μLCaCl2 (5 mM) og 5 μL af de specificerede AuN'er.
  2. Eksperimentel opsætning
    1. Overfør blandingen til kammeret og monter den på mikroskoptrinnet. Afhængigt af kammerets størrelse tilsættes enten hele blandingen eller en del af blandingen.
      BEMÆRK: Timing er kritisk, da calciumioner kan passere gennem membranen og formidle bindingen af annexinerne til membranens indre folder.
    2. Brug den samme optiske opsætning, der bruges til cellepunkteringseksperimenterne.
    3. Brug den optiske pincet til at fange en individuel AuNS i nærheden af eller på overfladen af en GUV ved at anvende en lasereffekt på ~ 125 mW.
    4. Forøg derefter lasereffekten til ~ 300 mW. Dette giver en meget lokaliseret temperaturstigning, som forstyrrer og punkterer membranen på målstedet.
      BEMÆRK: AuNS'er foretrækkes til GUV-eksperimenterne på grund af deres evne til at generere en højere forbigående temperaturstigning, samtidig med at de opretholder en mindre størrelse sammenlignet med faste AuNP'er.

Table 1
Tabel 1: Tabel til bestemmelse af GUV-sammensætningen. Klik her for at downloade denne tabel.

5. Målinger og dataanalyse af ANXA-respons i cellepunkteringseksperimenter

  1. Brug MATLAB til at analysere billederne og til at beregne og plotte AuNP-temperaturprofilen (figur 1D, E) baseret på Mies ligninger60,61.
  2. Derudover behandles alle konfokale billeder ved hjælp af FIJI ImageJ-distributionen62,63.
  3. Beregning af ANXA-ringradius
    1. Beskær det interesseområde, der indeholder det punkterede område fra rådataene før membranskadeanalysen.
    2. Anvend den interne MATLAB-arbejdsgang til behandling af hvert billede ved manuelt at markere midten af ANXA-ringen og dens ydre omkreds.
      1. Brug disse markeringer til at angive behandlingsgrænserne for det interesseområde, der er af interesse.
        BEMÆRK: Området behandles efterfølgende radialt inden for de indstillede grænser, og fluorescensintensiteten i en bestemt afstand til centrum er gennemsnittet over hele cirklen med samme centerafstand. Dette nummer gemmes for hvert radiustrin.
      2. Brug arbejdsgangen til at tilpasse de gennemsnitlige intensiteter over hele scanningsområdet til en endimensionel gaussisk kurve for at identificere maksimum (Rp) og fuld bredde ved halv maksimum (FWHM) svarende til henholdsvis Rext og Rint som vist i figur 3A.
    3. Til sidst bestemmes ANXA-ringens radius ved afstanden fra ringens centrum til Rext givet af plottet genereret af MATLAB-arbejdsgangen.
  4. Tredimensionel beregning af ANXA-ringradius
    1. Spor ændringen i ANXA-ringradius i z-retningen ved hjælp af den samme MATLAB-analysearbejdsgang som i trin 5.1. Anvend arbejdsgangen på flere konfokale z-sektioner på tværs af membranviklet, som illustreret i figur 3C, E.
    2. Beregn hældningen for hvert sår baseret på ændringen i radier over z-sektionerne, som vist i figur 3F.
  5. Tidsudvikling af ANXA-ringradius
    1. På samme måde skal du spore ANXA-ringens udvikling af ANXA-ringen efter termoplasmonisk membranpunktering ved hjælp af MATLAB-analysearbejdsgangen fra trin 5.1. Analysér fortløbende tidspunkter for at overvåge ændringer over tid, som vist i figur 3D, G, H.

Representative Results

I denne undersøgelse anvendes den termoplasmoniske metode til at undersøge annexinproteinresponset på plasmamembranforstyrrelser; Imidlertid kan ethvert protein, der kan rekrutteres ved membranskade, undersøges ved hjælp af dette assay, da det respektive protein er fluorescerende mærket. Proteinrekruttering og funktion overvåges ved konfokal billeddannelse i både humane embryonale nyreceller (HEK293T) og gigantiske unilamellære vesikler (GUV'er). For at uddybe illustrerer figur 2 de eksperimentelle betingelser, hvor en fokuseret NIR-laserstråle ved 1064 nm bruges til at bestråle en enkelt AuNP (figur 2A), hvilket resulterer i membranskade og en tilstrømning af Ca2+ ind i cellen, hvilket aktiverer PMR-maskineriet. Derefter rekrutteres annexiner hurtigt til skadestedet, hvor de binder til de negativt ladede fosfolipider ved såromkredsen og danner en ringlignende struktur inden for få sekunder (figur 2B, i-iv). Modelmembraneksperimenterne ved hjælp af GUV'er viste, at membranpunkteringer hurtigt blev forseglet igen i fravær af ANXA, som afbildet i figur 2C. Ved tilstedeværelse af ANXA blev der imidlertid observeret en hurtig ophobning af ANXA på skadestedet efter membranpunktering (figur 2D). Især fortsatte ANXA med at rulle de udsatte kanter, hvilket i sidste ende førte til sprængning af GUV. Denne rullemekanisme menes at stamme fra ANXAs evne til at inducere krumning og bøje lipidmembraner20.

Figure 2
Figur 2: Annexins (ANXA'er) respons på termoplasmonisk induceret membranforstyrrelse. Indledningsvis fungerer (A) plasmamembranen som en barriere mellem det ekstracellulære miljø, der indeholder høje niveauer af Ca2+ ioner, og det intracellulære miljø med indkapslede ANXA'er. Ved bestråling med en nær-infrarød (NIR) laser genererer AuNP betydelig varme, hvilket får membranen til at briste og resulterer i en tilstrømning af Ca2+ ioner. Derfor aktiveres plasmamembranreparationsmaskineriet (PMR), hvilket involverer rekruttering af ANXA'er til skadestedet, hvor de binder til negativt ladede fosfolipider. (B-D) Konfokale mikroskopibilleder af en celle indeholdende ANXA2 og en GUV indeholdende ANXA4 demonstrerer denne proces. (i) Før bestrålingen viser billederne en intakt celle eller GUV, hvor bestrålingsstederne er angivet med de hvide pile. ii) Ved nanopartikelbestråling rekrutteres (B) ANXA'er hurtigt til skadestedet og danner en ringlignende struktur omkring membransåret (B [ii-iv]). Panel (C) viser en membranfarvet GUV uden ANXA, som ved punktering hurtigt forsegles igen uden observerbar membranombygning. På den anden side viser panel (D) en GUV indeholdende rekombinant ANXA4, som allerede er bundet til membranen før (i) bestråling på grund af Ca2+ lækage over membranen. (ii) Ved punktering binder ANXA4 sig til de frie kanter, hvilket får GUV'en til at kollapse, når membranen ruller væk fra kanten. Skalabjælkerne måler 10 μm for figur (B), 2 μm for B (i), 10 μm for (C) og 15 μm for (D). Denne figur er gengivet fra Moreno-Pescador et. al16 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Klik her for at se en større version af denne figur.

Analysen af komplette ANXA-ringlignende strukturer (figur 2B og supplerende figur 1) giver nyttig indsigt i sårstørrelse og morfologi. ANXA-ringstrukturens radius kan bestemmes over tid og rum som beskrevet i afsnit 5. Moreno et al.16 analyserede over 135 plasmamembranskader i levende celler, hvor analysen af ANXA5-ringstrukturer er afbildet i figur 3. Radius blev bestemt ved at måle afstanden fra ringens centrum til kurvens udvendige radius baseret på halvmaksimum i fuld bredde af den kollapsede intensitetsprofil (figur 3A). Resultaterne illustrerede en heterogen fordeling af ANXA5-ringstørrelser (figur 3B), som forblev konstant over tid (figur 3D, G, H) og rum (figur 3C, E, F). Disse resultater tyder på en akkumulering af ANXA5 omkring skadestederne, hvilket indikerer en alternativ ANXA5-medieret PMR-strategi i levende celler til den hypotetiske tragtlignende indadgående spirende af den beskadigede membran5.

Figure 3
Figur 3: Analyse af ANXA5-ringstrukturer omkring et skadested i levende celler. (A) Den skematiske gengivelse illustrerer den analytiske tilgang, som er baseret på maksimum i fuld bredde og halv længde af ANXA-intensitetslinjeprofilen. (B) Histogrammet illustrerer 135 målte ANXA5-ringradier. (C) Fluorescensintensitetslinjeprofiler over en ANXA5-GFP-ring for hver z-sektion af z-stakken. (D) De konfokale billeder illustrerer tidsudviklingen af et sår, hvor ANXA5-GFP akkumuleres ved såromkredsen umiddelbart efter skaden, efterfulgt af sårstabilisering. Tidsrammerne mærket 1-6 blev fanget med 0,66 s intervaller pr. Ramme. Skalabjælken er 2 μm. (E) Sårets radier blev bestemt som en funktion af sårdybden baseret på metoden præsenteret i panel A. (F) Sårets hældning blev analyseret som ANXA5-ringradier som en funktion af z-højde baseret på data ekstraheret fra panel E. (G) Fluorescensintensitetslinjeprofilerne blev målt over ANXA5-GFP-ringen fra panel D. hvor hvert tidsinterval 1-6 betegnes som skive 1-6. Endelig præsenteres (H) tidsudviklingen for ANXA5-GFP-ringradierne som en funktion af tiden beregnet ud fra dataene i panel G. Denne figur er gengivet fra Moreno-Pescador et. al16 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Klik her for at se en større version af denne figur.

Sammenlignet med de ringlignende strukturer, der dannes ved at forstyrre PM alene (supplerende figur 1), kan skader i nærheden af kernen (supplerende figur 2A) påvirke sårets udvikling og geometri. Lejlighedsvis var kun en brøkdel af ANXA-ringene tydelige (supplerende figur 2B, C), som også kan analyseres ved hjælp af den interne MATLAB-analysearbejdsgang (se afsnit 5), selvom yderligere data kan gå tabt. Typisk er ANXA-ringformationer observeret i ikke-klæbende celler (supplerende figur 2C) placeret tæt på både kernen og cellens periferi. Som følge heraf kan der observeres en mere langstrakt ringstruktur, hvilket ikke er optimalt for den præsenterede dataanalyse. Derudover syntes ikke-klæbende celler at være mere modtagelige for celledød efter PM-skade. Når man overvejer skader som følge af bestråling af AuNP-aggregater, er det desuden vigtigt at bemærke, at disse skader kan være mere alvorlige og mindre kontrollerbare. Dette skyldes den betydelige stigning i plasmonisk opvarmning, som kan beskadige en stor del af cellen. Som følge heraf er sådanne skader ikke blevet indarbejdet i ANXA5-ringanalysen.

Desuden indikerer de foreløbige resultater, at forstyrrelsen af plasmamembranen ved hjælp af termoplasmonik resulterer i forhøjede intracellulære Ca2+ niveauer. Dette blev observeret selv ved lavintensiv bestråling af enkelte AuNP'er, hvilket tyder på PM-permeabilisering35, som vist i figur 4. Ca2+ tilstrømningen blev observeret i celler, der udtrykker en membranbundet calciumsonde, GCaMP6s-CAAX, som gennemgår en konformationsændring ved Ca2+ tilstrømning, og således kan en stigning i dens intensitet observeres64. Kalciumintensiteten blev kvantificeret for hele cellens fodaftryk over tid. For at eliminere baggrundsstøj blev baggrundsniveauet Ca2+ trukket fra før membranafbrydelse og reparation efter membranen. Den maksimale intensitet blev bestemt ved at normalisere den gennemsnitlige Ca2+ intensitet i cellen, hvilket resulterede i en intensitetskurve, der udviser en hurtig indledende Ca2+ intensitetsstigning efterfulgt af et langsommere fald, som vist i figur 4B.

Cellen nåede en maksimal calciumintensitet ved ~ 6,6 s, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af Klenow et al.64, der foreslog, at tiden for calciumintensitetstoppestedet (t = tc) svarer til den tid, der kræves til sårlukning. Ikke desto mindre, mens yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastslå den underliggende mekanisme for membranreparation og sårheling, viste de foreløbige resultater, at denne Ca2+ proces udelukkende blev observeret i den skadede celle og ikke i den uskadte celle, der blev brugt som en positiv kontrol. Dette bekræfter, at cellen oplevede Ca2+ tilstrømning ved termoplasmonisk membranforstyrrelse, hvor det overskydende intracellulære calcium aktivt pumpes ud efter vellykket PMR, da det intracellulære calciumniveau ikke længere konkurrerer med Ca2+ tilstrømningen og til sidst opnår cellehomeostatsis64.

Figure 4
Figur 4: Calciumtilstrømning opstår, når plasmamembranen i en HEK293T celle bristes af termoplasmonik. En række konfokale billeder viser to celler (cellen af interesse og en uskadt celle, der anvendes som en positiv kontrol), der udtrykker den membranbundne calciumsonde, GCaMP6s-CAAX. Vægtstangen måler 10 μm. (A) Før bestrålingen, kl. 00:00 s, visualiseres de to cellers fodaftryk ved hjælp af den grå stiplede linje, og bestrålingsstedet betegnes med den gule cirkel. Ved laserbestråling observeres en hurtig tilstrømning af Ca2+ , der når maksimal intensitet ved ~ 6,6 s, betegnet med den orange stiplede linje, et tidspunkt, der formodes at svare til tidspunktet for sårlukning64. (B) Kalciumintensitetsprofilen opnået fra GCaMP6s-CAAX-sonden i den skadede celle (blå linje) blev sammenlignet med Ca2+ -intensiteten i en nærliggende uskadt celle (grå stiplet linje), der viste en klar Ca2+ -tilstrømning udelukkende ved PM-forstyrrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Undersøgelsen fremhæver den termoplasmoniske tilgang som en lovende teknik til at udforske proteinresponser i levende celler og modelmembraner efter membranforstyrrelser. Denne metode giver ikke kun omfattende information om proteinrekruttering, men også om den biofysiske funktion af proteiner, der er involveret i proteinmembrandynamik. Derfor letter det identifikationen af molekylære komponenter, der er ansvarlige for overfladereparation, og fremmer forståelsen af det komplekse, men vitale maskineri til plasmamembranreparation. Selvom der findes forskellige metoder til at inducere membranforstyrrelser, såsom mekaniske, kemiske og optiske teknikker, lider disse metoder af begrænsninger, såsom at være ikke-specifikke for celler, generere flere skader på cellemembranen eller forårsage betydelig skade på membranen og ablere internt cellulært materiale langs laserbanen, når der anvendes pulserende lasere med høj effekt. Mens integrationen af konfokal mikroskopi og optisk pincet giver den mest omfattende information, kan alternative billeddannelsesmetoder også anvendes. For eksempel, da billeddannelsen af den plasmoniske nanopartikel opnås ved hjælp af refleksionsmikroskopi, kan en indbygget billeddannelsestilstand i Leica-konfokale mikroskoper, yderligere billeddannelsesteknikker, såsom mørkefeltmikroskopi65,66, andre spredningsmetoder som iSCAT67,68 eller fluorescerende mærkning af nanopartiklen, anvendes til AuNP-visualisering, selvom dette kan begrænse metodens anvendelighed.

Den præsenterede metode er desuden i stand til at inducere nanoskopiske huller i modelmembraner, hvilket muliggør undersøgelse af synergieffekterne mellem forskellige annexiner. Dette opnås ved at indkapsle forskelligt mærkede rekombinante annexiner, fx henholdsvis RFP og GFP, efterfulgt af termoplasmonisk punktering. Dette modelsystem giver indsigt i, hvordan annexiner interagerer med membraner i nærheden af frie kanter, som vist i figur 2D. I modsætning til i celler fortsætter hullerne påført GUV'er imidlertid med at ekspandere efterfulgt af destabilisering af vesiklen. Billeddannelse af huludviklingen ved hjælp af konfokalmikroskopi kan være udfordrende på grund af den hurtige udvidelse af huldiameteren, men kan opnås ved at fange flere z-stakke over tid. En alternativ metode ville være at bruge en roterende disk konfokal til hurtigere billeddannelse. Desuden giver den termoplasmoniske tilgang typisk et begrænset antal optimale resultater i timen, når den anvendes på enkeltceller eller GUV-eksperimenter, normalt to til tre, ved prøvetemperaturer mellem 20 °C og 30 °C. For at opnå den mest nøjagtige observation af proteinmembrandynamik anbefales det at opbevare cellerne i en HEPES-holdig buffer og udskifte prøven hver time. Alternativt kan forsøgsvinduet udvides ved at udføre forsøgene i et celleinkubationskammer, dvs. ved en konstant temperatur på 37 °C med 5% CO2. Desuden kan kombinationen af denne tilgang med andre billeddannelsesteknikker, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), give en dybere forståelse af den biofysiske funktion og interaktion mellem nøgleproteiner, der er involveret i membranreparation på et enkeltmolekyleniveau. Dette kunne give detaljerede oplysninger om skadestedet, herunder sårgeometri og placering af annexinproteiner, samt identificere andre nøgleaktører, der er involveret i reparation af membranoverfladen.

For at opnå maksimal effektivitet og præcision ved inducering af membranskader er det bydende nødvendigt at verificere placeringen af laserfokus før hvert eksperiment og sikre, at laserfokusets aksiale position falder sammen med det konfokale fokus. Denne justering optimerer intensiteten under AuNP-billeddannelse, hvilket fører til en maksimal lokal temperaturstigning og deraf følgende membranskade ved lavere lasereffekt. Denne proces udføres manuelt og er derfor modtagelig for variation i membranbrudeffektivitet, da fokus manuelt oversættes til en position, der falder sammen med partiklens placering. I mikroskoper, der mangler en refleksionstilstand, som i nogle kommercielle systemer, kan co-lokalisering af laserfokus og partikel være udfordrende. I sådanne tilfælde kan alternative billeddannelsestilstande (f.eks. Lyst felt) anvendes, og en langsom rasterscanning kan udføres omkring den forventede partikelposition. Det skal bemærkes, at lav lasereffekt sandsynligvis kun inducerer membranpermeabilisering, mens høj lasereffekt kan generere temperaturer omkring NP, der overstiger vandets kogepunkt, selvom glasoverfladen har en køleeffekt. Det anslås, at dannelsen af nanobobler omkring NP'erne sker mellem 200 °C og 300 °C25,48, hvor den eksplosive varme kan resultere i enten partikelforskydning fra laserfokus eller partikelfragmentering. Derudover udgør dannelsen af nano- eller mikrobobler under opvarmning en udfordring for denne metode. Da luftgrænseflader affugter membraner og kan forårsage proteindestabilisering, hvilket er uønsket, er det bydende nødvendigt at begrænse opvarmningen, når man undersøger membranreparation. Især guldnanoskaller tåler ikke høje temperaturer og nedbrydes under disse forhold, som demonstreret ved mikroskopi med høj opløsning58.

Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til brug af termoplasmonik til at udføre stærkt lokaliserede punkteringer i membraner, som gælder for både celler og modelmembraner. For yderligere at reducere omfanget af opvarmning kan mindre nanopartikler, der resonerer med NIR-lys, anvendes, hvilket muliggør intracellulære punkteringer i endosomer, det endoplasmatiske retikulum og den nukleare kuvert. Sådanne nanopartikler, herunder stænger og nanomatryoshkas48, kan bruges til at undersøge reparation af nukleare kuverter ved at målrette endocytoserede guldnanopartikler, der let optages på celleoverfladen og handles mod kernen69. Samlet set muliggør denne teknik identifikation og undersøgelse af centrale molekylære komponenter, der er involveret i PMR, hvilket belyser deres biofysiske funktion og rolle, samtidig med at cellernes levedygtighed bevares.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Jesper Nylandsted for at give os rekombinante annexinproteiner og plasmider, der koder for annexiner. Dette arbejde er støttet økonomisk af Det Frie Forskningsråd, Natural Sciences (DFF-4181-00196), Novo Nordisk Foundation Interdisciplinary Synergy Program 2018 (NNF18OC0034936), Videnskabelig Komité Danish Cancer Society (R90-A5847-14-S2), Lundbeckfonden (R218-2016-534) og Lundbeckfondens grundforskningscenter (Biomembranes in Nanomedicine).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1064 nm trapping laser Spectra Physics N/A Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold Nanoshells NanoComposix NCXGSIR150
200 nm Gold Nanoparticles BBI Solutions EM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwell MATTEK P35G-1.5-14-C
Amber-glass vials Supelco Sigma Aldrich 243438
Annexin A2 plasmids N/A N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-casein Sigma Life Science C6905-1G
CaCl2 Suprlco (sigma Aldrich) 10035-04-8
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702
Chloroform VWR Chemicals 67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface) Thermo scientific 150460
DID cell-labelling Solution Invitrogen  7757
Distilled water Gibco 15230-089
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Dissolved in chloroform 
DOPS Avanti Polar Lipids 840035C Dissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's Medium Thermo Fisher Scientific 11995065
FIJI ImageJ distribution ImageJ2 N/A
GCaMP6s-CAAX N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 11573397 10% of the culture medium
Glucose PROLABO 24 374.297
Hamilton syringes Hamilton Company N/A 50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 Harrick Plasma N/A
HEK293T cells N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) Leica N/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 Leica N/A
Leica SP5 confocal scanning microscope Leica N/A
Lipofectamine Fisher Scientific 15338030
MatLab The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States N/A
NaCl VWR Chemicals 7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum Medium Thermo Fisher Scientific 11058021
Parafilm Bemis PM-992
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 1% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20)  Physik Instrumente (Germany) N/A
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920-100ML 0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich 363065-25G
round glass slide 25 mm Ø VWR 631-1584
Sonicator Brandson 2800 Brandson N/A
sucrose Sigma Life Science 57-50-1
T25 tissue culture flask Falcon 353108 Blue Vented cap
Tris-HCl Invitrogen  15567-027
TrypLE Thermo Fisher Scientific A1285901
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 11590626
 VWR Mixer mini vortex 230V EU VWR  12620-84  ECN: 444-2790, SN: 150713022

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendix, P. M., et al. Interdisciplinary synergy to reveal mechanisms of annexin-mediated plasma membrane shaping and repair. Cells. 9 (4), 1029 (2020).
  2. Gajic, O., Lee, J., Doerr, C. H., Berrios, J. C., Myers, J. L., Hubmayr, R. D. Ventilator-induced Cell Wounding and Repair in the Intact Lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 1057-1063 (2003).
  3. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. The American Journal of Pathology. 140 (5), 1097-1109 (1992).
  4. Yu, Q. C., McNeil, P. L. Transient disruptions of aortic endothelial cell plasma membranes. The American Journal of Pathology. 141 (6), 1349-1360 (1992).
  5. Boye, T. L., et al. Annexin A4 and A6 induce membrane curvature and constriction during cell membrane repair. Nature Communications. 8, 1623 (2017).
  6. Bischofberger, M., Gonzalez, M. R., van der Goot, F. G. Membrane injury by pore-forming proteins. Current Opinion in Cell Biology. 21, 589-595 (2009).
  7. Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells. Science (New York, N.Y.). 356, 1022-1025 (2017).
  8. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair: Dealing with life's little traumas. Bioarchitecture. 1, 114-121 (2011).
  9. Sønder, S. L., et al. Annexin A7 is required for ESCRT III-mediated plasma membrane repair. Scientific Reports. 9, 6726 (2019).
  10. Andrews, N. W., Almeida, P. E., Corrotte, M. Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 24 (12), 734-742 (2014).
  11. Idone, V., Tam, C., Goss, J. W., Toomre, D., Pypaert, M., Andrews, N. W. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. The Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  12. Lauritzen, S. P., Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins are instrumental for efficient plasma membrane repair in cancer cells. Seminars in Cell & Developmental Biology. 45, 32-38 (2015).
  13. Häger, S. C., Nylandsted, J. Annexins: players of single cell wound healing and regeneration. Communicative & Integrative Biology. 12 (1), 162-165 (2019).
  14. Jaiswal, J. K., et al. S100A11 is required for efficient plasma membrane repair and survival of invasive cancer cells. Nature Communications. 5, 3795 (2014).
  15. Draeger, A., Monastyrskaya, K., Babiychuk, E. B. Plasma membrane repair and cellular damage control: The annexin survival kit. Biochemical Pharmacology. 81 (6), 703-712 (2011).
  16. Moreno-Pescador, G. S., et al. Thermoplasmonic nano-rupture of cells reveals annexin V function in plasma membrane repair. Nanoscale. 14 (21), 7778-7787 (2022).
  17. Zhivotovsky, B., Orrenius, S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective from the cell death community. Cell Calcium. 50 (3), 211-221 (2011).
  18. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: From structure to function. Physiological Reviews. 82 (2), 331-371 (2002).
  19. Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. Two-way traffic on the road to plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 18 (11), 552-559 (2008).
  20. Boye, T. L., et al. Annexins induce curvature on free-edge membranes displaying distinct morphologies. Scientific Reports. 8, 10309 (2018).
  21. Bouter, A., et al. Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair. Nature Communications. 2, 270 (2011).
  22. Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins in plasma membrane repair. Biological Chemistry. 397 (10), 961-969 (2016).
  23. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  24. Numata, T., Tatsuta, H., Morita, Y., Otani, Y., Umeda, N. Localized thermal processing with a laser-trapped and heated metal nanoparticle. IEEJ Transactions on Electrical and Electronic Engineering. 2, 398-401 (2007).
  25. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  26. Kyrsting, A., Bendix, P. M., Stamou, D. G., Oddershede, L. B. Heat profiling of three-dimensionally optically trapped gold nanoparticles using vesicle cargo release. Nano Letters. 11 (2), 888-892 (2011).
  27. Andersen, T., Kyrsting, A., Bendix, P. M. Local and transient permeation events are associated with local melting of giant liposomes. Soft Matter. 10 (24), 4268-4274 (2014).
  28. Bahadori, A., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Hot-nanoparticle-mediated fusion of selected cells. Nano Research. 10, 2034-2045 (2017).
  29. Rørvig-Lund, A., Bahadori, A., Semsey, S., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Vesicle fusion triggered by optically heated gold nanoparticles. Nano Letters. 15 (6), 4183-4188 (2015).
  30. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Ruhoff, V. T., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic vesicle fusion reveals membrane phase segregation of influenza spike proteins. Nano Letters. 23 (8), 3377-3384 (2023).
  31. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. SPIE Proceedings. SPIE 9922, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 992211, (2016).
  32. Bahadori, A., Moreno-Pescador, G., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Remotely controlled fusion of selected vesicles and living cells: a key issue review. Reports on Progress in Physics. 81 (3), 32602 (2018).
  33. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic induced vesicle fusion for investigating membrane protein phase affinity. bioRxiv. , (2022).
  34. Pescador, G. S. M., et al. Investigating plasma-membrane repair employing thermoplasmonics. Biophysical Journal. 120 (3), 45A (2021).
  35. Moreno-Pescador, G. S., Qoqaj, I., Thusgaard Ruhoff, V., Iversen, J., Nylandsted, J., Bendix, P. M. Effect of local thermoplasmonic heating on biological membranes. SPIE 11083, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XVI. 110830M, (2019).
  36. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current Biology. 9 (11), 579-587 (1999).
  37. Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 4 (139), 139ra85 (2012).
  38. Sudji, I. R., Subburaj, Y., Frenkel, N., García-Sáez, A. J., Wink, M. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 20 (11), 20146-20160 (2015).
  39. Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Intracellular Ca2+ operates a switch between repair and lysis of streptolysin O-perforated cells. Cell Death & Differentiation. 16, 1126-1134 (2009).
  40. Nygård Skalman, L., Holst, M. R., Larsson, E., Lundmark, R. Plasma membrane damage caused by listeriolysin O is not repaired through endocytosis of the membrane pore. Biology Open. 7 (10), bio035287 (2018).
  41. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6004-6009 (2014).
  42. Yeheskely-Hayon, D., Minai, L., Golan, L., Dann, E. J., Yelin, D. Optically induced cell fusion using bispecific nanoparticles. Small. 9 (22), 3771-3777 (2013).
  43. Minai, L., Yeheskely-Hayon, D., Golan, L., Bisker, G., Dann, E. J., Yelin, D. Optical nanomanipulations of malignant cells: Controlled cell damage and fusion. Small. 8 (11), 1732-1739 (2012).
  44. Lukianova-Hleb, E., et al. Plasmonic nanobubbles as transient vapor nanobubbles generated around plasmonic nanoparticles. ACS Nano. 4 (4), 2109-2123 (2010).
  45. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81, 1015-1047 (2005).
  46. Baffou, G., Polleux, J., Rigneault, H., Monneret, S. Super-heating and micro-bubble generation around plasmonic nanoparticles under cw illumination. Journal of Physical Chemistry C. 118 (9), 4890-4898 (2014).
  47. Sasikumar, K., Liang, Z., Cahill, D. G., Keblinski, P. Curvature induced phase stability of an intensely heated liquid. Journal of Chemical Physics. 140 (23), 234506 (2014).
  48. Jauffred, L., Samadi, A., Klingberg, H., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Plasmonic heating of nanostructures. Chemical Reviews. 119 (13), 8087-8130 (2019).
  49. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  50. Bendix, P. M., Jauffred, L., Norregaard, K., Oddershede, L. B. Optical trapping of nanoparticles and quantum dots. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 20, 15-26 (2014).
  51. Samadi, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Optical manipulation of individual strongly absorbing platinum nanoparticles. Nanoscale. 46, 18449-18455 (2017).
  52. Jørgensen, J. T., Norregaard, K., Tian, P., Bendix, P. M., Kjaer, A., Oddershede, L. B. Single particle and PET-based platform for identifying optimal plasmonic nano-heaters for photothermal cancer therapy. Scientific Reports. 6, 30076 (2016).
  53. Goldenberg, H., Tranter, C. J. Heat flow in an infinite medium heated by a sphere. British Journal of Applied Physics. 3 (9), 296-298 (1952).
  54. Eustis, S., El-Sayed, M. A. Why gold nanoparticles are more precious than pretty gold: Noble metal surface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Society Reviews. 35, 209-217 (2006).
  55. Landau, L. D., Lifshitz, E. M. Fluid Mechanics: Landau and Lifshitz: Course of Theoretical Physics. 6, Elsevier. (2013).
  56. Niederauer, C., Seynen, M., Zomerdijk, J., Kamp, M., Ganzinger, K. A. The K2: Open-source simultaneous triple-color TIRF microscope for live-cell and single-molecule imaging. HardwareX. 13, e00404 (2023).
  57. Richardson, A. C., Reihani, N., Oddershede, L. B. Combining confocal microscopy with precise force-scope optical tweezers. SPIE Proceedings:SPIE 6326, Optical Trapping and Optical Micromanipulation III. 632628, (2006).
  58. Samadi, A., Klingberg, H., Jauffred, L., Kjær, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Platinum nanoparticles: a non-toxic, effective and thermally stable alternative plasmonic material for cancer therapy and bioengineering. Nanoscale. 10 (19), 9097-9107 (2018).
  59. ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber for microscopy. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A7816 (2023).
  60. Kreibig, U., Vollmer, M. Theoretical considerations. In: Optical Properties of Metal Clusters. 25, Springer, Berlin, Heidelberg. (1995).
  61. Mie, G. Beiträge zur Optik trüber Medien, speziell kolloidaler Metallösungen. Annalen der Physik. 330 (3), 377-445 (1908).
  62. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  63. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  64. Klenow, M. B., Heitmann, A. S. B., Nylandsted, J., Simonsen, A. C. Timescale of hole closure during plasma membrane repair estimated by calcium imaging and numerical modeling. Scientific Reports. 11, 4226 (2021).
  65. Li, T., Wu, X., Liu, F., Li, N. Analytical methods based on the light-scattering of plasmonic nanoparticles at the single particle level with dark-field microscopy imaging. Analyst. 142 (2), 248-256 (2017).
  66. Gibbs-Flournoy, E. A., Bromberg, P. A., Hofer, T. P. J., Samet, J. M., Zucker, R. M. Darkfield-Confocal Microscopy detection of nanoscale particle internalization by human lung cells. Particle and Fibre Toxicology. 8 (1), 2 (2011).
  67. Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering microscopy: Seeing single nanoparticles and molecules via Rayleigh scattering. Nano Letters. 19 (8), 4827-4835 (2019).
  68. Wu, Y., Ali, M. R. K., Chen, K., Fang, N., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles in biological optical imaging. Nano Today. 24, 120-140 (2019).
  69. Klingberg, H., Oddershede, L. B., Loeschner, K., Larsen, E. H., Loft, S., Møller, P. Uptake of gold nanoparticles in primary human endothelial cells. Toxicology Research. 4 (3), 566-666 (2015).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 203 biofysik plasmamembranreparation optisk pincet annexiner kæmpe unilamellære vesikler termoplasmonik membranlækage
En termoplasmonisk tilgang til undersøgelse af plasmamembranreparation i levende celler og modelmembraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., … More

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., Moreno-Pescador, G., Bendix, P. M. A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes. J. Vis. Exp. (203), e65776, doi:10.3791/65776 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter