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Biology

जीवित कोशिकाओं और मॉडल झिल्ली में प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की जांच के लिए एक थर्मोप्लास्मोनिक दृष्टिकोण

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65776
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1The Niels Bohr Institute, University of Copenhagen, 2Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

Summary

थर्मोप्लास्मोनिक पंचर विधि कोशिकाओं और विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के दौरान प्रोटीन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, ऑप्टिकल चिमटी और सोने के नैनोकणों को एकीकृत करती है। तकनीक तेजी से और स्थानीयकृत झिल्ली पंचर को सक्षम बनाती है, जिससे जटिल प्लाज्मा झिल्ली मरम्मत मशीनरी में प्रमुख प्रोटीन और उनकी कार्यात्मक भूमिकाओं की पहचान की अनुमति मिलती है।

Abstract

कोशिका झिल्ली कोशिका के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, और इसकी अखंडता सुनिश्चित करना आवश्यक है क्योंकि कोशिका अपने पूरे जीवन चक्र में चोटों का अनुभव करती है। झिल्ली को नुकसान को रोकने के लिए, कोशिकाओं ने कुशल प्लाज्मा झिल्ली मरम्मत तंत्र विकसित किया है। इन मरम्मत तंत्रों का अध्ययन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और नैनोस्केल थर्मोप्लास्मोनिक्स के संयोजन से किया जा सकता है ताकि जीवित कोशिकाओं और झिल्ली मॉडल प्रणालियों में सतह की मरम्मत में शामिल एनेक्सिन जैसे प्रमुख प्रोटीन की भूमिका की पहचान और जांच की जा सके।

पंचर विधि नैनोपार्टिकल विकिरण पर अत्यधिक स्थानीयकृत हीटिंग को प्रेरित करने के लिए एक लेजर को नियोजित करती है। निकट-अवरक्त प्रकाश का उपयोग जैविक नमूने में फोटोटॉक्सिसिटी को कम करता है, जबकि अधिकांश अवशोषण निकट-अवरक्त गुंजयमान प्लास्मोनिक नैनोपार्टिकल में होता है। पुटिका और सेल संलयन अध्ययन के माध्यम से इंट्रासेल्युलर तंत्र और सेलुलर प्रतिक्रियाओं की समझ को बढ़ाने के लिए संभावित फोटोथर्मल और बायोफिजिकल अनुसंधान के लिए इस थर्मोप्लास्मोनिक विधि का शोषण किया गया है। दृष्टिकोण झिल्ली व्यवधान के लिए मौजूदा तरीकों के पूरक होने के लिए दिखाया गया है, जैसे यंत्रवत्, रासायनिक या वैकल्पिक रूप से प्रेरित चोटें, और बेहद स्थानीय चोटों को भड़काकर उच्च स्तर का नियंत्रण प्रदान करती है। चोट की सीमा गोलाकार नैनोपार्टिकल के आसपास के क्षेत्र तक सीमित है, और विभिन्न तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके स्पंदित लेज़रों के विपरीत बीम पथ के साथ कोई हानिकारक क्षति नहीं होती है। कुछ सीमाओं के बावजूद, जैसे कि नैनोबबल्स का गठन, थर्मोप्लास्मोनिक विधि सेल व्यवहार्यता से समझौता किए बिना लगभग देशी वातावरण में प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करती है।

जब कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकृत किया जाता है, तो पंचर विधि मॉडल झिल्ली प्रणालियों में झिल्ली गतिशीलता की यंत्रवत समझ प्रदान कर सकती है और साथ ही प्रोटीन भर्ती और उनके बायोफिजिकल फ़ंक्शन सहित झिल्ली क्षति के लिए प्रोटीन प्रतिक्रियाओं पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकती है। कुल मिलाकर, कम मॉडल सिस्टम के लिए इस पद्धति का अनुप्रयोग जीवित कोशिकाओं में जटिल प्लाज्मा झिल्ली मरम्मत मशीनरी की हमारी समझ को बढ़ा सकता है।

Introduction

कोशिका झिल्ली, दोनों एक भौतिक बाधा और एक संकेत मंच के रूप में सेवारत, सेल अस्तित्व1 के लिए महत्वपूर्ण है. अपने पूरे सेल चक्र के दौरान, प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) क्षति के अधीन है, जैसे यांत्रिक 2,3,4,5 और रासायनिक6 तनाव-प्रेरित चोटें। झिल्ली अखंडता को बनाए रखने और सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए, सेल ने मजबूत प्लाज्मा झिल्ली मरम्मत (पीएमआर) तंत्र विकसित किया है। ये तंत्र विभिन्न रणनीतियों पर निर्भर करते हैं, जैसे कि साइटोस्केलेटन पुनर्गठन, झिल्ली संलयन, और झिल्ली प्रतिस्थापन रणनीतियों 7,8,9,10,11, जिनमें से सभी विशिष्ट प्रोटीन की भर्ती पर निर्भर करते हैं। विशेष रूप से, एनेक्सिन प्रोटीन परिवार के सदस्यों को पीएमआर 1,9,12,13,14,15,16 की प्रक्रियाओं से जुड़े प्रमुख प्रोटीन के रूप में पहचाना गया है। पीएम चोट के बाद, सेल कैल्शियम आयनों (सीए2+), जो सेल के अस्तित्व17 के लिए एक तत्काल खतरा बन गया है की आमद का अनुभव करता है. सीए2 + प्रवाह के जवाब में, एनेक्सिन प्रोटीन, जो मुख्य रूप से साइटोसोल में स्थित हैं, पीएमआर रणनीतियों18 के एक भाग के रूप में क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली के भीतरी पत्रक से बंधे. एनेक्सिन ए 2 (एएनएक्सए 2) एनेक्सिन परिवार के पहले सदस्यों में से एक था जो डिस्फेरलिन-कमी वाली मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी में पीएमआर से जुड़ा था और चोट स्थल 5,19,20,21 के पास पीएम को इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं को फ्यूज करके मरम्मत में मध्यस्थता करने का सुझाव दिया गया था। इसके बाद, कई कार्यों को अनुलग्नक22 के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, और पीएमआर में उनकी भूमिका ने पिछले 20 वर्षों में ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, पीएमआर में अनुलग्नकों की सटीक भूमिका पूरी तरह से 15,18,21,22 को समझा नहीं गया है।

यह लेख प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन और झिल्ली गतिशीलता को नियंत्रित और अत्यधिक स्थानीयकृत तरीके से जांचने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है, जिसमें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, ऑप्टिकल चिमटी और सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) के संयोजन का उपयोग किया जाता है। यह विधि झिल्ली क्षति और सीए2+ प्रवाह के जवाब में प्रोटीन, लिपिड और छोटे अणु इंटरैक्शन के मात्रात्मक अध्ययन को सक्षम बनाती है। जटिलता और झिल्ली की मरम्मत की प्रक्रिया में शामिल घटकों की बहुलता के बावजूद, सरलीकृत झिल्ली प्रणालियों है कि प्लाज्मा झिल्ली की नकल झिल्ली गतिशीलता की एक गहरी यंत्रवत समझ और झिल्ली व्यवधान16 के लिए एनेक्सिन प्रोटीन की प्रतिक्रिया हासिल करने के लिए नियोजित किया गया है. विशाल यूनिलामेलर लिपिड पुटिकाओं (जीयूवी) को एक निर्दिष्ट लिपिड संरचना के साथ मॉडल झिल्ली प्रणाली के रूप में चुना गया था। GUVs को जेल-असिस्टेड हाइड्रेशन विधि का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, विशेष रूप से पॉलीविनाइल अल्कोहल जेल हाइड्रेशन, जैसा कि वेनबर्गर एट अल.23 द्वारा वर्णित है, जिसने GUVs में एनेक्सिन के कुशल एनकैप्सुलेशन की अनुमति दी थी।

धातु नैनोकणों (एनपी) पर निकट-अवरक्त (एनआईआर) लेजर विकिरण का उपयोग एनपी के महत्वपूर्ण हीटिंग को प्रेरित करता है, जिससे जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में शोषित स्थानीय गर्मी स्रोत स्थापित करने के लिए एक प्रभावी तरीका बन जाता है24. विधि शुरू में 2 डी और 3 डी बायोमिमेटिक परख दोनों में एक एकल एयूएनपी के आसपास के तापमान को सीधे मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इन परखोंमें 25,26, प्लास्मोनिक नैनोकणों को एक समर्थित लिपिड बाइलेयर पर विकिरणित किया गया था या स्थानीय हीटिंग पर स्थानीय थर्मल चरण संक्रमण से गुजरने वाले जीयूवी के पास वैकल्पिक रूप से फंस गया था, जिससे कण के चारों ओर सटीक तापमान प्रोफ़ाइल का परिमाणीकरण और नियंत्रण सक्षम हो गया। जैविक नमूनों की जांच या हेरफेर करते समय इस संदर्भ तापमान प्रोफ़ाइल का उपयोग किया गया है। विधि में आगे की प्रगति पुटिका और सेल संलयन28,29 के लिए अनुमति देता है, झिल्ली27 में नैनोस्कोपिक छिद्रों के प्रेरण की सुविधा प्रदान की है. अन्य अध्ययनों ने उपन्यास संकर पुटिकाओं का निर्माण करके जीयूवी29 और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन30 में परिधीय झिल्ली प्रोटीन के व्यवहार की जांच की है, जबकि सेलुलर प्रतिक्रियाओं या जीन अभिव्यक्ति 28,29,31,32,33को नियंत्रित करने और अध्ययन करने के लिए सेल-विशिष्ट दवा वितरण का भी पता लगाया गया है। हाल ही में, विधि झिल्ली क्षति32,34,35 करने के लिए प्रोटीन प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

सेलुलर प्रतिक्रियाओं और झिल्ली की मरम्मत का पता लगाने के लिए प्लाज्मा झिल्ली को बाधित करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं। इनमें माइक्रोनेडल पंचर, माइक्रोबीड झटकों और सेल स्क्रैपिंग शामिल हैं, जो सभी कोशिका झिल्ली को यंत्रवत् 14,36,37 बाधित कर सकते हैं। रासायनिक प्रेरित क्षति डिटर्जेंट 5,38 या जीवाणु विषाक्त पदार्थों39,40 कि लिपिड bilayer अस्थिर और प्लाज्मा झिल्ली भर में झिल्ली छिद्रों उत्पन्न जोड़कर प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, निरंतर तरंग और स्पंदित लेज़रों द्वारा वैकल्पिक रूप से प्रेरित चोटों का उपयोग पीएमआर घटकों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जैसे कि एनेक्सिन प्रोटीन 5,14,21,41, प्लास्मोनिक नैनोपार्टिकल्स 42,43,44,45 के संयोजन में. उच्च शक्ति स्पंदित लेज़रों की दक्षता के बावजूद, वे बीम पथ के साथ सेल के इंटीरियर को महत्वपूर्ण चोट और नुकसान पहुंचा सकते हैं। इसके अलावा, स्पंदित लेजर विकिरण पर जैविक पदार्थ में होने वाले विस्तृत परिवर्तन और क्या यह एक अच्छी तरह से परिभाषित छिद्र बनाता है, आगे की जांच की जानी बाकी है। इस लेख में एक वैकल्पिक विधि प्रस्तुत की गई है, आंतरिक संरचनाओं को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचाए बिना नियंत्रित तरीके सेपीएम में नैनोस्कोपिक छेद को प्रेरित करने के लिए थर्मोप्लास्मोनिक्स को नियोजित करना। यह प्लास्मोनिक एनपी को अत्यधिक केंद्रित एनआईआर लेजर में उजागर करके पूरा किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक अत्यंत स्थानीय तापमान वृद्धि होती है जो आसानी से 200 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान तक पहुंच सकती है, जिससे छोटे नैनोस्कोपिक विस्फोट 25,46,47 हो सकते हैं। इस प्रक्रिया को लेजर तीव्रता के साथ-साथ एनपीएस48 के आकार, आकार और संरचना को समायोजित करके नियंत्रित किया जा सकता है। इस तकनीक को नियोजित करके, शोधकर्ता जीवित कोशिकाओं में पीएम की मरम्मत में प्रोटीन की भूमिका का पता लगा सकते हैं, जो सेल व्यवहार्यता से समझौता किए बिना झिल्ली की मरम्मत में एनेक्सिन प्रोटीन की भागीदारी के बारे में कुछ अनुत्तरित प्रश्नों को संबोधित करने में मदद कर सकता है।

प्लास्मोनिक नैनोकणों के ऑप्टिकल फँसाने को पिछले अध्ययनों 25,49,50,51,52 द्वारा अच्छी तरह से स्थापित किया गया है; हालांकि, नैनोकणों 53,54,55 के थर्मोप्लाज्मोनिक गुणों के बारे में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि पूरक सामग्री (पूरक फ़ाइल 1) में प्राप्त की जा सकती है। थर्मोप्लाज्मोनिक विधि का उपयोग सेलुलर प्रतिक्रिया और मरम्मत तंत्र का अध्ययन करने के उद्देश्य से पीएम में नैनोस्कोपिक छेद बनाने के लिए किया जा सकता है। अधिक सटीक रूप से, पंचर को झिल्ली के करीब निकटता में एयूएनपी के ऑप्टिकल हीटिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि आंकड़े 1 ए और बी में दिखाया गया है। यह स्थानीयकृत पंचर सीए2+ प्रवाह के लिए अनुमति देता है, जिसे कैल्शियम सेंसर द्वारा सत्यापित किया गया था, इस प्रकार पीएमआर मशीनरी को सक्रिय करता है। लाइव सेल प्रयोगों के लिए, 200 एनएम के व्यास वाले एयूएनपी को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पीएमआर में एएनएक्सए 2 की भूमिका की निगरानी के लिए सेल के नीचे की सतह पर स्थिर किया गया था। एनआईआर लेजर(चित्रा 1ए,बी), 1064 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ, एयूएनपी को विकिरणित करता है, इसके प्लास्मोनिक गुणों(चित्रा 1सी)का शोषण करता है, जिसके परिणामस्वरूप जैविक पारदर्शिता खिड़की49 में पर्याप्त स्थानीय हीटिंग(चित्रा 1डी)होता है, जबकि सेल को कम से कम नुकसान होता है। एयूएनपी के आसपास का उच्च तापमान क्षेत्र एनपी की त्रिज्या के अनुरूप दूरी पर तेजी से 30-40% कम हो जाता है, जैसा कि चित्र 1ई में दर्शाया गया है, जिससे तीनों आयामों में अत्यंत सीमित चोट की अनुमति मिलती है।

अनुपूरक फ़ाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक विधि की योजनाबद्ध रूपरेखा। (ए) एएनएक्सए-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाएं सतह पर स्थिर सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) के शीर्ष पर स्थित होती हैं, या (बी) विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) को समझाया गया एएनएक्सए युक्त माध्यम में निलंबित कर दिया जाता है एयूएनपी। (सी) एक एकल एयूएनपी एनआईआर ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा विकिरणित होता है, जहां आने वाले विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र और चालन इलेक्ट्रॉनों के बीच बातचीत एनपी के भीतर इलेक्ट्रॉनों के सामूहिक दोलन की ओर ले जाती है। (D) इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप तापमान में अत्यधिक सीमित लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि होती है। एनपी सतह पर तापमान का अनुमान लगाने के लिए, एमआईई सिद्धांत कार्यरत है, और एक (ई) तापमान प्रोफ़ाइल की गणना एयूएनपी के लिए 200 एनएम के व्यास और लेजर तीव्रता I = 6.36 x 108 W/cm2 के साथ की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कोशिका झिल्ली पर थर्मल प्रभाव को कम करने के लिए, एयूएनपी केवल ~ 1 सेकंड के लिए विकिरणित होते हैं। यह हीटिंग के क्षणिक और स्थानीय विस्फोट का कारण बनता है, जो प्रोटीन को नुकसान को कम करता है जिसे आमतौर पर प्रकट होने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है। झिल्ली पंचर पर, एनेक्सिन प्रोटीन को एक सेकंड के एक अंश में भर्ती किया जाता है, और कुछ सेकंड के भीतर, चोट की साइट (चित्रा 2) के आसपास एक एनेक्सिन रिंग जैसी मचान बनती है। इस दृष्टिकोण को मरम्मत प्रक्रियाओं की पूरी योजना पर प्रकाश डालने के प्रयास में जीवित कोशिकाओं और मॉडल झिल्ली16 दोनों में ANXA5 की भागीदारी का पता लगाने के लिए भी लागू किया गया है। जबकि प्राथमिक ध्यान विभिन्न एनेक्सिन प्रोटीन की सहसंबंधित भर्ती पर रहा है, मरम्मत तंत्र के बायोफिजिकल पहलुओं को अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है।

प्रस्तावित विधि को पूरी तरह से लागू करने के लिए, तीन प्रमुख घटकों की आवश्यकता होती है: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, ऑप्टिकल चिमटी और धातु नैनोकण। ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग AuNPs को फंसाने के लिए किया जाता है, और उनका निर्माण न्यूमैन एट अल.49 द्वारा उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करके प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, अगर एक ऑप्टिकल चिमटी का निर्माण बहुत चुनौतीपूर्ण साबित होता है, तो कोशिकाओं के नीचे स्थिर एयूएनपी को विकिरणित करने के लिए एक कसकर केंद्रित एनआईआर लेजर का उपयोग किया जा सकता है। गोलाकार AuNPs इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया, ट्यून करने योग्य अवशोषण स्पेक्ट्रा के साथ प्लास्मोनिक कणों की एक किस्म भी एनआईआर क्षेत्र48 के भीतर एक अत्यधिक स्थानीयकृत तापमान ढाल प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन की भूमिका को देखने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग आवश्यक है, और इसलिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफ)56 को कॉन्फोकल इमेजिंग के विकल्प के रूप में माना जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक केवल सतह इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और मॉडल झिल्ली पुटिका प्रयोगों के साथ संगत नहीं होगा. नतीजतन, ऑप्टिकल चिमटी और confocal खुर्दबीन दोनों नैनोपार्टिकल के सटीक स्थानीयकरण और सेल चोट के आसपास के स्थानीय क्षेत्र की विस्तृत जांच के लिए आवश्यक हैं. एक विवर्तन-सीमित लेजर फोकस के साथ नैनोपार्टिकल को प्रभावी ढंग से विकिरणित करने के लिए, नैनोपार्टिकल की कल्पना करना आवश्यक है। यह प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी द्वारा बेहतर रूप से प्राप्त किया जा सकता है, जो लीका कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की एक मानक इमेजिंग विशेषता है। हालांकि, यदि प्रतिबिंब या प्रकीर्णन इमेजिंग उपलब्ध नहीं है, तो वैकल्पिक तरीकों, जैसे कम कुशल फ्लोरोसेंट एयूएनपी लेबलिंग, पर विचार किया जा सकता है।

सारांश में, इस अध्ययन में प्रस्तुत अत्यधिक नियंत्रणीय और स्थानीयकृत थर्मोप्लास्मोनिक विधि में जीवित कोशिकाओं में सेलुलर प्रतिक्रियाओं और पीएम मरम्मत तंत्र में शामिल आणविक घटकों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मंच के रूप में सेवा करने की क्षमता है। पीएम क्षति पर प्रोटीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग स्थानीय रूप से पुटिकाओं को पंचर करने के लिए भी किया जा सकता है, जिससे प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-झिल्ली गतिशीलता दोनों में प्रोटीन प्रतिक्रिया की जांच को सक्षम किया जा सकता है। इसके अलावा, यह विधि प्रोटीन, लिपिड और छोटे अणुओं के बीच बातचीत के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है जब झिल्ली बाधित होती है। सामूहिक रूप से, इन अग्रिमों में जटिल और जटिल प्लाज्मा झिल्ली मरम्मत मशीनरी के बारे में कुछ अनसुलझे प्रश्नों पर प्रकाश डालने की क्षमता है।

Protocol

1. कोशिका झिल्ली पंचर तैयारी

  1. सेल सीडिंग (दिन 1)
    1. संस्कृति मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293T) एक 5% सीओ2 humidifier इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं जब तक वे 70% संगम तक पहुँचने.
    2. ट्रिप्सिन के 500 माइक्रोन का उपयोग करके सतह से कोशिकाओं को अलग करें, 200,000 HEK293T कोशिकाओं की गिनती करें, और उन्हें संस्कृति माध्यम के 3 एमएल की कुल मात्रा के साथ एक संस्कृति डिश में बीज दें। 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: डिश के केंद्र में सेल क्लस्टरिंग को रोकने के लिए, कोशिकाओं को समान रूप से फैलाएं और डिश को घुमाने से बचें, क्योंकि यह अभिकर्मक दक्षता को कम कर सकता है।
  2. सेल अभिकर्मक (दिन 2)
    नोट: ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद 48 घंटे तक इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. Pipet, ब्याज की प्लाज्मिड और उपयोग से पहले 5 s के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक.
    2. एक बाँझ 2 एमएल ट्यूब में, निम्नलिखित को विशिष्ट क्रम में मिलाएं: कम-सीरम माध्यम का 500 माइक्रोन, अभिकर्मक अभिकर्मक का 5 माइक्रोन (प्लास्मिड से 4 गुना अधिक), और प्लास्मिड का 1.25 माइक्रोन (1 माइक्रोग्राम/μL)।
      नोट: झिल्ली के टूटने पर कैल्शियम के प्रवाह की जांच करने के लिए, उसी प्रक्रिया का पालन करें लेकिन झिल्ली-बाध्य कैल्शियम सेंसर जांच GCaMP6-CAAX (1 μg/μL) का उपयोग करें।
    3. धीरे लेकिन अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण pipet और यह कोशिकाओं के लिए dropwise जोड़ने से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं.
    4. अभिकर्मक मिश्रण जोड़ने से पहले, संस्कृति पकवान से माध्यम को हटा दें, धीरे से फॉस्फेट-बफर खारा के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें, और पकवान में कम-सीरम माध्यम के 2000 माइक्रोन जोड़ें।
    5. संस्कृति माध्यम के 3 एमएल के लिए माध्यम बदलने से पहले 2 घंटे और 45 मिनट के लिए 5% सीओ2 humidifier इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मक मिश्रण के साथ कोशिकाओं को एक साथ सेते हैं.
  3. सोने नैनोपार्टिकल (AuNP) समाधान की तैयारी (2 दिन)
    1. भंवर 10 के स्तर पर 10 s के लिए 200 एनएम AuNP स्टॉक समाधान (उपकरण के आगे विनिर्देश के लिए सामग्री की तालिकादेखें ), 5 मिनट (अधिकतम आयाम) के लिए sonicate, और 10 s के लिए फिर से भंवर।
    2. 1 एमएल की कुल मात्रा में आसुत जल के 850 माइक्रोन के साथ एयूएनपी के 150 माइक्रोन मिलाएं।
      नोट: पतला AuNP समाधान फ्रिज में संग्रहीत किया जा सकता है और 1 महीने तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  4. प्रयोगात्मक पकवान की तैयारी (2 दिन)
    1. 0.01% -0.1% सेल अटैचमेंट समाधान के 150 माइक्रोन के साथ माइक्रोवेल डिश को कोट करें और आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. आसुत जल के 500 माइक्रोन के साथ कांच की सतह को दो बार धोएं और इसे ~ 10 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।
    3. सूखी सतह पर AuNP समाधान ड्रॉपवाइज के 80 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: भंवर (10 एस), सोनिकेट (5 मिनट), और भंवर (10 एस) पतला एयूएनपी समाधान एयूएनपी समुच्चय को कम करने के लिए लेपित ग्लास सतह में जोड़ने से पहले।
    4. संस्कृति माध्यम के 1.5 एमएल शुरू करने से पहले ~ 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। पकवान 37 डिग्री सेल्सियस रात भर में सेते हैं.
  5. प्रयोगात्मक कक्ष की तैयारी (3 दिन)
    नोट: प्रयोगात्मक कक्ष या तो दिन 3 या 4 पर तैयार किया जा सकता है; हालांकि, सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित तैयारी प्रयोग के रूप में एक ही दिन पर किया जाता है.
    1. संस्कृति पकवान में कोशिकाओं से माध्यम निकालें और फॉस्फेट बफर खारा के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें.
      नोट: यह कदम किसी भी अवशिष्ट माध्यम और मलबे को हटाने के लिए आवश्यक है जो बाद के चरणों में हस्तक्षेप कर सकता है।
    2. एंजाइम आधारित सेल टुकड़ी समाधान के 500 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें और 1-3 मिनट के लिए सेते हैं जब तक कि कोशिकाओं संस्कृति पकवान से अलग हो गया है.
    3. ताजा संस्कृति माध्यम के 1.5 एमएल जोड़ें और सेल समूहों की संभावना को कम करने के लिए एक समरूप सेल समाधान प्राप्त करने के लिए सेल समाधान विंदुक.
    4. प्रयोगात्मक माइक्रोवेल में एयूएनपी से माध्यम को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    5. सेल समाधान (2 एमएल) microwell के लिए जोड़ें और यह प्रयोग प्रदर्शन करने से पहले कम से कम 5 घंटे के लिए सेते करने के लिए अनुमति देते हैं.
      नोट: इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों के लिए, कक्ष घूमता से बचें, के रूप में इस कक्ष के बीच में क्लस्टर करने के लिए कोशिकाओं का कारण बन सकता है.

2. कोशिका झिल्ली पंचर प्रयोग

  1. प्रयोग की ऑप्टिकल सेटिंग्स
    1. एक 1064 एनएम फँसाने लेजर57 के साथ संयुक्त एक confocal स्कैनिंग खुर्दबीन का उपयोग प्रयोगों का संचालन.
    2. 1.2 के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ 63x जल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके फोकल प्लेन में ऑप्टिकल ट्रैपिंग करें।
    3. मान लें कि फोकस एक हवादार डिस्क का आकार है और विकिरण लेजर की फोकल बीम चौड़ाई त्रिज्या में ~ 540 एनएम है।
    4. लेजर पावर (P) को संबंधित लेजर तीव्रता (I) में प्रति क्षेत्र लेजर पावर (W/cm2) की गणना करके कनवर्ट करें।
    5. फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों का उपयोग करके पता लगाए गए कई फ्लोरोसेंट संकेतों की कल्पना करने के लिए एक ध्वनिक ऑप्टिकल बीम फाड़नेवाला (एओबीएस) का उपयोग करें और उनके बिखरने वाले संकेत के माध्यम से धातु एनपी का एक साथ पता लगाएं।
      नोट: सभी कॉन्फोकल सिस्टम एओबीएस से लैस नहीं हैं, जो धातु एनपी के प्रतिबिंब इमेजिंग की अनुमति देता है। यहां, पता लगाने के अन्य रूपों को लागू किया जाना चाहिए, या सेल के नीचे के क्षेत्र में एनआईआर लेजर की अनुक्रमिक स्कैनिंग का प्रयास किया जा सकता है।
    6. प्रयोगात्मक सत्र के दौरान, खुर्दबीन पर कोशिकाओं, आणविक फ्लोरोसेंट जांच, और सोने नैनोकणों युक्त एक गिलास नीचे खुले कक्ष माउंट.
    7. नैनोमीटर-सटीक पार्श्व आंदोलनों16 को सक्षम करने, एक पीजोइलेक्ट्रिक चरण पर घुड़सवार नमूना अनुवाद करके कोशिकाओं के सापेक्ष जाल को स्थानांतरित करें।
      नोट: ऑप्टिकल जाल स्थिर रखा जाता है।
  2. कोशिका झिल्ली पंचर के लिए प्रायोगिक सेटिंग्स
    1. कोशिकाओं HEK293T रखें, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ युग्मित एनेक्सिन प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है, जो कांच की सतह(चित्रा 1ए)पर स्थिर होते हैं।
    2. स्कैनिंग कंफोकल माइक्रोस्कोप में एयूएनपी प्रतिबिंब को देखने के लिए जीएफपी प्रतिदीप्ति संकेत और एक HeNe 633 एनएम लेजर की कल्पना करने के लिए एक आर्गन 488 एनएम लेजर का उपयोग करें।
    3. ऑप्टिकल चिमटी को नियोजित करें, जो ~ 1 एस के लिए एक एकल एयूएनपी को विकिरणित करने के लिए 1064 एनएम एनआईआर लेजर के साथ संचालित होता है, जो प्लाज्मा झिल्ली को बाधित करने वाले तापमान में महत्वपूर्ण स्थानीय वृद्धि को प्रेरित करता है।
    4. केंद्रित कण के लिए 200-295 मेगावाट के बीच विकिरण लागू करें, जिसके परिणामस्वरूप एक वास्तविक तापमान में वृद्धि होती है।
      नोट: प्रकाशिकी के भीतर शक्ति का पर्याप्त नुकसान होता है, फोकल पॉइंट पर लेजर पावर के साथ विशिष्ट सेटअप के आधार पर लगभग 20% तक पहुंच जाता है। सेमी2 में मापा गया) सिस्टम के सटीक संरेखण पर निर्भर करता है, विशेष रूप से फोकल आकार। इसके अतिरिक्त, कांच की गर्मी चालन सेल और पानी की तुलना में अधिक है और परिणामस्वरूप प्लाज्मा झिल्ली को जारी गर्मी की मात्रा को कम करने से थोड़ा48,58 कम हो जाता है।
    5. एनआईआर लेजर फोकस स्पॉट के स्थानीयकरण को ठीक से कैलिब्रेट करके प्रभावी और स्थानीयकृत पीएम चोट और बाद में प्रोटीन मरम्मत प्रतिक्रिया प्राप्त करें। यह एक ही इमेजिंग माध्यम में निलंबित एक एकल एयूएनपी को कैप्चर करके और यह सुनिश्चित करके प्राप्त किया जाता है कि चयनित एयूएनपी विकिरण से पहले फोकस में है।
      नोट: नैनोपार्टिकल को फोकस में माना जाता है जब इसका बिखरने वाला संकेत सबसे तेज दिखाई देता है, यानी, स्पष्ट किनारों और कण के चारों ओर एक प्रभामंडल की अनुपस्थिति का प्रदर्शन करता है, जब इसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2सी(ii)) में देखा जाता है।
  3. सेल और AuNP घनत्व की स्थिति
    1. प्लाज्मा झिल्ली के ओवरलैप को रोकने के लिए सेल समूहों के बजाय एकल कोशिकाओं का चयन करें।
      नोट: कोशिकाओं को सतह का पालन किया जाना चाहिए, एक चपटा आकारिकी (पूरक चित्रा 1) का प्रदर्शन करना, जो परमाणु झिल्ली (पूरक चित्रा 2) को नुकसान को रोकने के दौरान सेल परिधि के पंचर की अनुमति देता है।
    2. प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें या जब तक वे एयूएनपी सेलुलर तेज को रोकने के लिए बस गए और चपटा न हो जाएं। अत्यधिक इनक्यूबेशन समय से बचें और PEGylated AuNPs का उपयोग करके AuNP एंडोसाइटोसिस की संभावना को कम करें।
    3. सुनिश्चित करें कि स्थिर AuNPs एकल कणों के रूप में मौजूद हैं, समुच्चय को रोकने के लिए एक दूसरे से पर्याप्त रूप से अलग दूरी पर हैं। समुच्चय थर्मल ढाल में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊंचा तापमान होता है जो सेल के एक बड़े हिस्से को बाधित कर सकता है।
    4. सेल स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए हर 1-2 घंटे में नमूना बदलें।
      नोट: लंबे समय तक एक्सपोजर सेल स्वास्थ्य में गिरावट का कारण बन सकता है, झिल्ली की मरम्मत के मामले में चोट का सटीक जवाब देने की उनकी क्षमता से समझौता कर सकता है। सेल स्वास्थ्य में यह गिरावट आमतौर पर सेल आकार में बदलाव से देखी जाती है, क्योंकि कोशिकाएं अधिक गोलाकार और अधिक कठोर दिखाई देती हैं, अंततः कोशिका मृत्यु में परिणत होती हैं।

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3. विशालकाय यूनिलामेलर पुटिका (GUV) तैयारी

  1. लिपिड मिश्रण की तैयारी
    1. 4:1 के दाढ़ अनुपात में 1,2-डायोलॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीओपीसी) और 1,2-डाइओलॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फो-एल-सेरीन (डीओपीएस) लिपिड को मिलाकर जीयूवी लिपिड संरचना बनाएं ( तालिका 1देखें)। प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार लिपिड स्टॉक को 1.5 एमएल ग्लास शीशियों में विभाज्य करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: लंबे समय तक लिपिड संरक्षण के लिए और असंतृप्त लिपिड के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए, एलिकोटेड शीशियों में आर्गन के साथ हवा को बदलें।
    2. लिपिड मिश्रण करने से पहले, क्लोरोफॉर्म के साथ 50 माइक्रोन और 500 माइक्रोन ग्लास या धातु सिरिंज को पांच बार अच्छी तरह से साफ करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे क्लोरोफॉर्म-भंग लिपिड के लिए दूषित पदार्थों से मुक्त हैं।
      चेतावनी: इसकी विषाक्तता के कारण एक धूआं हुड में क्लोरोफॉर्म संभाल.
      1. क्लोरोफॉर्म की गणना की मात्रा को एक साफ एम्बर-ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें, इसके बाद प्रत्येक लिपिड की निर्दिष्ट मात्रा ( तालिका 1देखें)।
        नोट: लिपिड स्टॉक के बीच पार संदूषण से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि सीरिंज क्लोरोफॉर्म के साथ साफ कर रहे हैं.
      2. अंत में, झिल्ली डाई जोड़ें और पाइपिंग द्वारा लिपिड को अच्छी तरह मिलाएं। आगे उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार लिपिड मिश्रण स्टोर करें; मिश्रण बिना किसी लिपिड क्षति के 2-3 सप्ताह तक व्यवहार्य रहता है।
        नोट: मिश्रण एक धातु या कांच सिरिंज के साथ किया जाना चाहिए। फ्रीजर से बाहर होने पर लिपिड को हमेशा बर्फ पर रखें।
  2. पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) जेल की तैयारी
    1. मामूली संशोधनों के साथ वेनबर्गर एट अल.23द्वारा वर्णित जेल-असिस्टेड हाइड्रेशन विधि का उपयोग करके जीयूवी तैयार करें।
      1. 50 एमएम सुक्रोज, 25 एमएम एनएसीएल और 25 एमएम ट्रिस (पीएच 7.4) युक्त बफर के 100 एमएल में पीवीए के 5 ग्राम को भंग करके पीवीए जेल तैयार करें।
      2. पीवीए समाधान को 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और पारदर्शी होने तक हिलाएं। इसे आरटी तक ठंडा होने दें और आगे उपयोग के लिए फ्रिज में स्टोर करें।
        नोट: पीवीए बफर में ठीक से भंग नहीं होता है, और इसलिए, 85 डिग्री सेल्सियस तक हीटिंग आवश्यक है।
  3. ग्लास स्लाइड की तैयारी
    1. इथेनॉल के साथ साफ ग्लास स्लाइड और उन्हें हवा सूखी करते हैं. फिर, कांच की सतह से किसी भी अवशिष्ट संदूषण को दूर करने के लिए एक वायु प्लाज्मा क्लीनर के साथ स्लाइड का इलाज करें।
    2. पीवीए-लेपित ग्लास स्लाइड की तैयारी
      1. इसकी तरलता बढ़ाने के लिए 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक पीवीए जेल (5%) गर्म करें। ग्लास स्लाइड पर गर्म पीवीए के 90 माइक्रोन लागू करें, समान रूप से फैलाएं, और इसे 50 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग कैबिनेट में सूखने दें।
      2. एक बार पीवीए ग्लास स्लाइड तैयार हो जाने के बाद, एक ग्लास या धातु सिरिंज का उपयोग करके तैयार लिपिड मिश्रण के 30 माइक्रोन जोड़ें और सुई के किनारे का उपयोग करके इसे एक पतली फिल्म में फैलाएं।
      3. कोमल नाइट्रोजन दबाव के तहत इसकी क्लोरोफॉर्म सामग्री को वाष्पित करके लिपिड मिश्रण को सुखाएं। इसके अलावा, 1.5-2 घंटे के लिए एक वैक्यूम के तहत कांच स्लाइड सूखी.
  4. एक कक्ष में बढ़ते GUV
    1. तैयार ग्लास स्लाइड का उपयोग करके, पहले प्रकाशित रिपोर्ट59 के डिजाइन के समान, इन-हाउस चैंबर को इकट्ठा करें।
    2. एक अलग 2 एमएल ट्यूब में, ब्याज की पुनः संयोजक प्रोटीन (इस मामले में, ANXA5 या ANXA4) को 500 एनएम की अंतिम एकाग्रता में 80 मिमी सुक्रोज, 70 मिमी NaCl, और 25 मिमी Tris-HCl (पीएच 7.4) से मिलकर बढ़ते बफर (जीबी) के साथ पतला करें।
    3. कक्ष में पतला पुनः संयोजक प्रोटीन समाधान के 400 माइक्रोन जोड़ें। 1 घंटे के लिए आरटी पर चैम्बर सेते हैं GUVs जमा लिपिड कोट से बढ़ने के लिए अनुमति देने के लिए. एक ही बफर का प्रयोग करें, प्रोटीन को छोड़कर, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में.
      नोट: बफर वाष्पीकरण को रोकने के लिए पॉलीओलेफ़िन फिल्म में कक्ष लपेटें।
    4. चैम्बर सामग्री के 400 माइक्रोन को 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करके जीयूवी लीजिए।
    5. एकत्रित समाधान के लिए 55 मिमी ग्लूकोज, 70 मिमी NaCl, और 50 मिमी Tris-HCl (पीएच 7.4) युक्त अवलोकन बफर (OB) के 1 एमएल जोड़कर GUVs के बाहर गैर समझाया प्रोटीन निकालें. फिर, 13 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर समाधान अपकेंद्रित्र.
    6. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, अवलोकन बफर की एक समान मात्रा के साथ सतह पर तैरनेवाला के 1 एमएल को बदलें। कोमल पाइपिंग के माध्यम से GUVs तितर-बितर और उन्हें रेफ्रिजरेटर में स्टोर जब तक वे GUV प्रयोगों में उपयोग किया जाता है.

4. GUV पंचर प्रयोग

  1. चैंबर की तैयारी
    1. प्रयोग के लिए एक 35 मिमी गिलास नीचे पकवान का प्रयोग करें. GUVs को सतह पर चिपके रहने और फटने से रोकने के लिए, 15-30 मिनट के लिए β-कैसिइन (5 mg/mL) के साथ सतह को कोट करें।
      1. β कैसिइन समाधान के लिए, 20 मिमी ट्रिस (पीएच 7.5) और 100 मिमी NaCl के 20-एमएल बफर में प्रोटीन का 0.1 ग्राम भंग। प्रोटीन समाधान को फ़िल्टर करें, इसे छोटे शीशियों में विभाज्य करें, और इसे आगे उपयोग के लिए फ्रीज करें।
    2. सतह से किसी भी अतिरिक्त मुक्त β-केसिन को हटाने के लिए अवलोकन बफर के साथ दो बार कक्ष धो लें और आरटी पर सूखने दें।
    3. एक अलग 2 एमएल ट्यूब में, ओबी के साथ एकत्रित जीयूवी मिलाएं। वांछित अंतिम एकाग्रता (इस मामले में, 200 माइक्रोन) के लिए मिश्रण में सीएसीएल2 जोड़ें।
    4. 1:100 के अनुपात में मिश्रण में 150 एनएम सोने के नैनोशेल्स (AuNSs) का परिचय दें। अंतिम मिश्रण में GUVs का 250 μL, OB का 225 μL, CaCl2 (5 mM) का 20 μL और निर्दिष्ट AuNSs का 5 μL शामिल है।
  2. प्रायोगिक सेटअप
    1. कक्ष के लिए मिश्रण स्थानांतरण और खुर्दबीन मंच पर यह माउंट. कक्ष के आकार के आधार पर, या तो पूरे मिश्रण या मिश्रण का एक हिस्सा जोड़ें।
      नोट: समय महत्वपूर्ण है क्योंकि कैल्शियम आयन झिल्ली से गुजर सकते हैं और झिल्ली के आंतरिक पत्रक में एनेक्सिन के बंधन में मध्यस्थता कर सकते हैं।
    2. सेल पंचर प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही ऑप्टिकल सेटअप को नियोजित करें।
    3. ~ 125 मेगावाट की लेजर शक्ति लागू करके एक GUV की सतह पर या उसके करीब निकटता में एक व्यक्ति AuNS जाल करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी का प्रयोग करें.
    4. इसके बाद, लेजर शक्ति को ~ 300 मेगावाट तक बढ़ाएं। यह एक अत्यधिक स्थानीयकृत तापमान वृद्धि पैदा करता है, जो लक्ष्य स्थल पर झिल्ली को बाधित और पंचर करता है।
      नोट: ठोस AuNPs की तुलना में एक छोटे आकार को बनाए रखते हुए एक उच्च क्षणिक तापमान वृद्धि उत्पन्न करने की उनकी क्षमता के कारण GUV प्रयोगों के लिए AuN को प्राथमिकता दी जाती है।

Table 1
तालिका 1: जीयूवी संरचना का निर्धारण करने के लिए तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

5. सेल पंचर प्रयोगों में ANXA प्रतिक्रिया के माप और डेटा विश्लेषण

  1. छवियों का विश्लेषण करने और Mie के समीकरणों60,61 के आधार पर AuNP तापमान प्रोफ़ाइल (चित्रा 1D, E) की गणना और साजिश करने के लिए MATLAB का उपयोग करें।
  2. इसके अतिरिक्त, फिजी इमेजजे वितरण62,63 का उपयोग करके सभी कॉन्फोकल छवियों को संसाधित करें।
  3. ANXA रिंग त्रिज्या की गणना
    1. झिल्ली चोट विश्लेषण से पहले कच्चे डेटा से छिद्रित क्षेत्र युक्त ब्याज के क्षेत्र फसल.
    2. ANXA रिंग के केंद्र और उसकी बाहरी परिधि को मैन्युअल रूप से चिह्नित करके प्रत्येक छवि को संसाधित करने के लिए इन-हाउस MATLAB वर्कफ़्लो को नियोजित करें।
      1. ब्याज के क्षेत्र के लिए प्रसंस्करण सीमा निर्धारित करने के लिए इन चिह्नों का उपयोग करें।
        नोट: क्षेत्र को बाद में निर्धारित सीमाओं के भीतर रेडियल रूप से संसाधित किया जाता है, और केंद्र के लिए एक विशिष्ट दूरी पर प्रतिदीप्ति तीव्रता एक ही केंद्र दूरी के साथ पूर्ण सर्कल पर औसत होती है। यह संख्या प्रत्येक त्रिज्या चरण के लिए संग्रहीत की जाती है।
      2. पूरे स्कैनिंग रेंज पर औसत तीव्रता को एक आयामी गाऊसी वक्र में फिट करने के लिए वर्कफ़्लो का उपयोग करें ताकि क्रमशः आरएक्स्ट और आरइंट के अनुरूप अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) पर अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) की पहचान की जा सके, जैसा कि चित्रा 3 ए में दर्शाया गया है।
    3. अंत में, MATLAB वर्कफ़्लो द्वारा उत्पन्न प्लॉट द्वारा दिए गए रिंग के केंद्र से Rext तक की दूरी से ANXA रिंग की त्रिज्या निर्धारित करें।
  4. त्रि-आयामी ANXA रिंग त्रिज्या गणना
    1. चरण 5.1 के समान MATLAB विश्लेषण वर्कफ़्लो का उपयोग करके z-दिशा में ANXA रिंग त्रिज्या में परिवर्तन को ट्रैक करें। झिल्ली घाव भर में कई confocal z- वर्गों के लिए कार्यप्रवाह लागू करें, के रूप में चित्रा 3C, ई में सचित्र है.
    2. जेड-वर्गों पर त्रिज्या में परिवर्तन के आधार पर प्रत्येक घाव के लिए ढलान की गणना करें, जैसा कि चित्र 3एफ में दर्शाया गया है।
  5. ANXA रिंग त्रिज्या का समय विकास
    1. इसी तरह, चरण 5.1 से MATLAB विश्लेषण वर्कफ़्लो का उपयोग करके थर्मोप्लास्मोनिक झिल्ली पंचर के बाद ANXA रिंग के ANXA रिंग के विकास को ट्रैक करें। समय के साथ परिवर्तनों की निगरानी के लिए लगातार समय बिंदुओं का विश्लेषण करें, जैसा कि चित्रा 3 डी, जी, एच में दिखाया गया है।

Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, थर्मोप्लाज्मोनिक विधि का उपयोग प्लाज्मा झिल्ली व्यवधान के लिए एनेक्सिन प्रोटीन प्रतिक्रिया की जांच के लिए किया जाता है; हालांकि, झिल्ली की चोट पर भर्ती किए जा सकने वाले किसी भी प्रोटीन की जांच इस परख का उपयोग करके की जा सकती है, यह देखते हुए कि संबंधित प्रोटीन फ्लोरोसेंटली लेबल है। प्रोटीन भर्ती और कार्य की निगरानी मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293T) कोशिकाओं और विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) दोनों में कन्फोकल इमेजिंग द्वारा की जाती है। विस्तृत करने के लिए, चित्रा 2 प्रयोगात्मक स्थितियों को दिखाता है जिसमें 1064 एनएम पर एक केंद्रित एनआईआर लेजर बीम का उपयोग एकल एयूएनपी (चित्रा 2ए) को विकिरणित करने के लिए किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली की चोट और सेल में सीए2+ की आमद होती है, पीएमआर मशीनरी को सक्रिय करती है। इसके बाद, एनेक्सिन को तेजी से चोट स्थल पर भर्ती किया जाता है, जहां वे घाव की परिधि पर नकारात्मक चार्ज फॉस्फोलिपिड्स से बंधते हैं, सेकंड के भीतर एक अंगूठी जैसी संरचना बनाते हैं (चित्र 2बी, आई-आई-आई)। जीयूवी का उपयोग करते हुए मॉडल झिल्ली प्रयोगों ने प्रदर्शित किया कि झिल्ली पंचर को एएनएक्सए की अनुपस्थिति में तेजी से फिर से सील कर दिया गया था, जैसा कि चित्रा 2 सी में दर्शाया गया है। हालांकि, एएनएक्सए की उपस्थिति में, झिल्ली पंचर (चित्रा 2डी) के बाद चोट स्थल पर एएनएक्सए का तेजी से संचय देखा गया था। विशेष रूप से, ANXA ने उजागर किनारों को रोल करना जारी रखा, अंततः GUV के फटने के लिए अग्रणी। इस रोलिंग तंत्र वक्रता प्रेरित करने और लिपिड झिल्ली20 मोड़ ANXA की क्षमता से उत्पन्न माना जाता है.

Figure 2
चित्रा 2: थर्मोप्लास्मोनिक-प्रेरित झिल्ली व्यवधान के लिए अनुलग्नक (एएनएक्सए) प्रतिक्रिया। प्रारंभ में, (ए) प्लाज्मा झिल्ली सीए2+ आयनों के उच्च स्तर वाले बाह्य वातावरण और एन्कैप्सुलेटेड एएनएक्सए के साथ इंट्रासेल्युलर वातावरण के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करती है। निकट-अवरक्त (एनआईआर) लेजर के साथ विकिरण पर, एयूएनपी पर्याप्त गर्मी उत्पन्न करता है, जिससे झिल्ली फट जाती है और परिणामस्वरूप सीए2+ आयनों का प्रवाह होता है। नतीजतन, प्लाज्मा झिल्ली मरम्मत (पीएमआर) मशीनरी सक्रिय होती है, जिसमें चोट की साइट पर एएनएक्सए की भर्ती शामिल होती है, जहां वे नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए फॉस्फोलिपिड्स से बंधते हैं। (बी-डी) ANXA2 युक्त सेल की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां और ANXA4 युक्त GUV इस प्रक्रिया को प्रदर्शित करती हैं। (i) विकिरण से पहले, छवियों सफेद तीर द्वारा निरूपित विकिरण साइटों के साथ, एक बरकरार सेल, या GUV दिखा. (ii) नैनोपार्टिकल विकिरण पर, (बी) एएनएक्सए को तेजी से चोट स्थल पर भर्ती किया जाता है, जिससे झिल्ली घाव (बी [ii-iv]) के चारों ओर एक अंगूठी जैसी संरचना बनती है। पैनल (सी) एएनएक्सए के बिना एक झिल्ली-सना हुआ जीयूवी दिखाता है, जो पंचर होने पर, अवलोकन योग्य झिल्ली रीमॉडेलिंग के बिना तेजी से फिर से सील करता है। दूसरी ओर, पैनल (डी) एक जीयूवी दिखाता है जिसमें पुनः संयोजक एएनएक्सए 4 होता है, जो झिल्ली में सीए2+ रिसाव के कारण (i) विकिरण से पहले से ही झिल्ली से बंधा होता है। (ii) पंचर होने पर, ANXA4 मुक्त किनारों से बंध जाता है, जिससे GUV ढह जाता है क्योंकि झिल्ली किनारे से दूर लुढ़क जाती है। स्केल बार आंकड़ा (बी) के लिए 10 माइक्रोन, बी (आई) के लिए 2 माइक्रोन, (सी) के लिए 10 माइक्रोन, और (डी) के लिए 15 माइक्रोन मापते हैं। यह आंकड़ा मोरेनो-पेसकाडोर एट से पुन: प्रस्तुत किया गया है। अल16 रॉयल सोसाइटी ऑफ केमिस्ट्री से अनुमति के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूर्ण एएनएक्सए अंगूठी जैसी संरचनाओं (चित्रा 2 बी और पूरक चित्रा 1) का विश्लेषण घाव के आकार और आकृति विज्ञान में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। ANXA रिंग संरचना की त्रिज्या को समय और स्थान पर निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि धारा 5 में वर्णित है। मोरेनो एट अल .16 ने जीवित कोशिकाओं में 135 से अधिक प्लाज्मा झिल्ली चोटों का विश्लेषण किया, जहां एएनएक्सए 5 रिंग संरचनाओं का विश्लेषण चित्रा 3 में दर्शाया गया है। त्रिज्या को अंगूठी के केंद्र से वक्र के बाहरी त्रिज्या तक की दूरी को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था, जो ढह गई तीव्रता प्रोफ़ाइल(चित्रा 3ए)की पूर्ण-चौड़ाई-आधा-अधिकतम पर आधारित था। निष्कर्षों ने एएनएक्सए 5 रिंग आकार(चित्रा 3बी)के विषम वितरण को चित्रित किया, जो समय के साथ स्थिर रहा(चित्र 3डी,जी,एच)और अंतरिक्ष(चित्रा 3सी,ई,एफ)। ये परिणाम चोट साइटों के आसपास ANXA5 के संचय का सुझाव देते हैं, क्षतिग्रस्त झिल्ली5 के परिकल्पित फ़नल की तरह आवक नवोदित करने के लिए जीवित कोशिकाओं में एक वैकल्पिक ANXA5-मध्यस्थता पीएमआर रणनीति का संकेत।

Figure 3
चित्रा 3: जीवित कोशिकाओं में एक चोट साइट के आसपास एएनएक्सए 5 रिंग संरचनाओं का विश्लेषण। (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण को दर्शाता है, जो एएनएक्सए तीव्रता लाइन प्रोफाइल की पूर्ण-चौड़ाई-आधा अधिकतम पर आधारित है। (बी) हिस्टोग्राम 135 मापा ANXA5 रिंग त्रिज्या दिखाता है। (सी)जेड-स्टैक के प्रत्येक जेड-सेक्शन के लिए एएनएक्सए 5-जीएफपी रिंग में प्रतिदीप्ति तीव्रता लाइन प्रोफाइल। (डी) कॉन्फोकल छवियां घाव के समय के विकास को दर्शाती हैं, जहां एएनएक्सए 5-जीएफपी चोट के तुरंत बाद घाव की परिधि पर जमा होता है, इसके बाद घाव स्थिरीकरण होता है। 1-6 लेबल वाले समय सीमा को प्रति फ्रेम 0.66 एस अंतराल पर कैप्चर किया गया था। स्केल बार 2 माइक्रोन है। (ई) घावों की त्रिज्या पैनल ए में प्रस्तुत विधि के आधार पर घाव की गहराई के एक समारोह के रूप में निर्धारित की गई थी। (एफ) घाव की ढलान का विश्लेषण एएनएक्सए 5 रिंग त्रिज्या के रूप में जेड-ऊंचाई के एक समारोह के रूप में किया गया था, जो पैनल ई से निकाले गए डेटा पर आधारित था। (जी) प्रतिदीप्ति तीव्रता लाइन प्रोफाइल को पैनल डी से एएनएक्सए 5-जीएफपी रिंग में मापा गया था, जहां हर बार अंतराल 1-6 को स्लाइस 1-6 के रूप में दर्शाया जाता है। अंत में, (एच) एएनएक्सए 5-जीएफपी रिंग त्रिज्या का समय विकास पैनल जी में डेटा से गणना किए गए समय के एक समारोह के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। यह आंकड़ा मोरेनो-पेसकाडोर एट से पुन: प्रस्तुत किया गया है। अल16 रॉयल सोसाइटी ऑफ केमिस्ट्री से अनुमति के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अकेले पीएम (अनुपूरक चित्रा 1) को बाधित करके गठित अंगूठी जैसी संरचनाओं की तुलना में, नाभिक (पूरक चित्रा 2 ए) के करीब निकटता में चोटें घाव के विकास और ज्यामिति को प्रभावित कर सकती हैं। कभी-कभी, एएनएक्सए के छल्ले का केवल एक अंश स्पष्ट था (पूरक चित्रा 2 बी, सी), जिसे इन-हाउस मैटलैब विश्लेषण वर्कफ़्लो (धारा 5 देखें) का उपयोग करके भी विश्लेषण किया जा सकता है, हालांकि अतिरिक्त डेटा खो सकता है। आमतौर पर, गैर-पक्षपाती कोशिकाओं (पूरक चित्रा 2 सी) में मनाया गया एएनएक्सए रिंग फॉर्मेशन नाभिक और सेल की परिधि दोनों के करीब स्थित होता है। परिणामस्वरूप, एक अधिक लम्बी अंगूठी संरचना देखी जा सकती है, जो प्रस्तुत डेटा विश्लेषण के लिए उप-इष्टतम है। इसके अतिरिक्त, गैर-पालन कोशिकाएं पीएम चोट के बाद कोशिका मृत्यु के लिए अधिक संवेदनशील दिखाई दीं। इसके अलावा, जब एयूएनपी समुच्चय के विकिरण से उत्पन्न चोटों पर विचार किया जाता है, तो यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये चोटें अधिक गंभीर और कम नियंत्रणीय हो सकती हैं। यह प्लास्मोनिक हीटिंग में उल्लेखनीय वृद्धि के कारण है, जो सेल के एक बड़े हिस्से को नुकसान पहुंचा सकता है। नतीजतन, ऐसी चोटों को ANXA5 रिंग विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया है।

इसके अलावा, प्रारंभिक निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि थर्मोप्लास्मोनिक्स का उपयोग करके प्लाज्मा झिल्ली के विघटन के परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर सीए2+ स्तर बढ़ जाता है। यह एकल एयूएनपी के कम तीव्रता वाले विकिरण पर भी देखा गया था, पीएम पारगम्यता35 का सुझाव देते हुए, जैसा कि चित्र 4 में दर्शाया गया है। सीए2 + प्रवाह एक झिल्ली बाध्य कैल्शियम जांच, GCaMP6s-CAAX, जो सीए2 + प्रवाह पर एक रचनात्मक परिवर्तन से गुजरता है व्यक्त कोशिकाओं में मनाया गया था, और इस प्रकार, इसकी तीव्रता में वृद्धि64 मनाया जा सकता है. समय के साथ कोशिका के पूरे पदचिह्न के लिए कैल्शियम की तीव्रता निर्धारित की गई थी। पृष्ठभूमि शोर को खत्म करने के लिए, पृष्ठभूमि सीए2 + स्तर झिल्ली व्यवधान और बाद झिल्ली की मरम्मत से पहले घटाया गया था. अधिकतम तीव्रता सेल के भीतर मतलब सीए2 + तीव्रता को सामान्य करके निर्धारित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक तीव्रता वक्र तेजी से प्रारंभिक सीए2+ तीव्रता वृद्धि का प्रदर्शन करता है, जिसके बाद धीमी कमी होती है, जैसा कि चित्रा 4 बी में दर्शाया गया है।

सेल ~ 6.6 एस पर अधिकतम कैल्शियम तीव्रता तक पहुंच गया, जो क्लेनो एट अल 64 के निष्कर्षों के अनुरूप है, जिन्होंने सुझाव दिया कि कैल्शियम तीव्रता शिखर (टी = टीसी) का समय घाव बंद करने के लिए आवश्यक समय से मेल खाता है। फिर भी, झिल्ली की मरम्मत और घाव भरने के अंतर्निहित तंत्र को स्थापित करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता होती है, प्रारंभिक निष्कर्षों से पता चला है कि यह सीए2+ प्रक्रिया विशेष रूप से घायल कोशिका में देखी गई थी, न कि सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले अप्रकाशित सेल में। यह पुष्टि करता है कि सेल ने थर्मोप्लास्मोनिक झिल्ली व्यवधान पर सीए2 + प्रवाह का अनुभव किया, जहां अतिरिक्त इंट्रासेल्युलर कैल्शियम को सफल पीएमआर के बाद सक्रिय रूप से पंप किया जाता है क्योंकि इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्तर अब सीए2+ प्रवाह के साथ प्रतिस्पर्धा में नहीं है, अंततः सेल होमोस्टैटिस64 प्राप्त कर रहा है।

Figure 4
चित्र 4: कैल्शियम का प्रवाह तब होता है जब थर्मोप्लाज्मोनिक्स द्वारा एक HEK293T कोशिका की प्लाज्मा झिल्ली टूट जाती है। कॉन्फोकल छवियों की एक श्रृंखला दो कोशिकाओं (ब्याज की कोशिका और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग की जाने वाली एक घायल कोशिका) को झिल्ली-बाध्य कैल्शियम जांच, GCaMP6s-CAAX व्यक्त करती है। स्केल बार 10 माइक्रोन मापता है। (ए) विकिरण से पहले, 00:00 एस पर, दो कोशिकाओं के पदचिह्न को ग्रे बिंदीदार रेखा द्वारा कल्पना की जाती है, और विकिरण साइट को पीले सर्कल द्वारा दर्शाया जाता है। लेजर विकिरण पर, सीए2 + का एक तेजी से प्रवाह मनाया जाता है, ~ 6.6 एस पर अधिकतम तीव्रता तक पहुंचने, नारंगी धराशायी रेखा द्वारा निरूपित, एक समय बिंदु है कि घाव बंद64 के समय के अनुरूप माना जाता है. (बी) घायल सेल (नीली रेखा) में GCaMP6s-CAAX जांच से प्राप्त कैल्शियम तीव्रता प्रोफ़ाइल की तुलना पड़ोसी अप्रभावित सेल (ग्रे बिंदीदार रेखा) में सीए2+ तीव्रता से की गई थी, जो विशेष रूप से पीएम व्यवधान पर एक स्पष्ट सीए2+ प्रवाह दिखा रही थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

अध्ययन में झिल्ली व्यवधान के बाद जीवित कोशिकाओं और मॉडल झिल्ली में प्रोटीन प्रतिक्रियाओं की खोज के लिए एक आशाजनक तकनीक के रूप में थर्मोप्लास्मोनिक दृष्टिकोण पर प्रकाश डाला गया है। यह विधि न केवल प्रोटीन भर्ती पर व्यापक जानकारी प्रदान करती है, बल्कि प्रोटीन-झिल्ली गतिशीलता में शामिल प्रोटीन के बायोफिजिकल फ़ंक्शन पर भी प्रदान करती है। नतीजतन, यह सतह की मरम्मत के लिए जिम्मेदार आणविक घटकों की पहचान की सुविधा प्रदान करता है और प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की जटिल अभी तक महत्वपूर्ण मशीनरी की समझ को आगे बढ़ाता है। यद्यपि यांत्रिक, रासायनिक और ऑप्टिकल तकनीकों जैसे झिल्ली व्यवधान को प्रेरित करने के लिए विभिन्न विधियां मौजूद हैं, ये विधियां सीमाओं से ग्रस्त हैं, जैसे कि कोशिकाओं के लिए गैर-विशिष्ट होना, कोशिका झिल्ली को कई चोटें पैदा करना, या झिल्ली को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचाना और उच्च शक्ति स्पंदित लेजर का उपयोग करते समय लेजर पथ के साथ आंतरिक सेलुलर सामग्री को समाप्त करना। जबकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल चिमटी का एकीकरण सबसे व्यापक जानकारी प्रदान करता है, वैकल्पिक इमेजिंग तौर-तरीकों का भी उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्लास्मोनिक नैनोपार्टिकल की इमेजिंग प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त की जाती है, लीका कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में एक अंतर्निहित इमेजिंग मोड, अतिरिक्त इमेजिंग तकनीक, जैसे डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी65,66, अन्य बिखरने के तरीके जैसे आईएससीएटी 67,68, या नैनोकण के फ्लोरोसेंट लेबलिंग, एयूएनपी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए नियोजित किया जा सकता है, हालांकि यह विधि की प्रयोज्यता को सीमित कर सकता है।

प्रस्तुत विधि मॉडल झिल्ली में नैनोस्कोपिक छेद को प्रेरित करने में भी सक्षम है, जिससे विभिन्न अनुलग्नकों के बीच तालमेल प्रभाव की जांच सक्षम हो जाती है। यह अलग-अलग लेबल वाले पुनः संयोजक एनेक्सिन, जैसे, आरएफपी और जीएफपी को क्रमशः एनकैप्सुलेट करके प्राप्त किया जाता है, इसके बाद थर्मोप्लास्मोनिक पंचर होता है। यह मॉडल प्रणाली अंतर्दृष्टि प्रदान करती है कि कैसे एनेक्सिन मुक्त किनारों के आसपास के क्षेत्र में झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं, जैसा कि चित्र 2 डी में दिखाया गया है। हालांकि, कोशिकाओं के विपरीत, जीयूवी पर लगाए गए छिद्रों का विस्तार जारी रहता है, इसके बाद पुटिका का अस्थिर हो जाता है। छेद व्यास के तेजी से विस्तार के कारण कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छेद के विकास को इमेजिंग करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन समय के साथ कई जेड-स्टैक पर कब्जा करके पूरा किया जा सकता है। एक वैकल्पिक तरीका तेजी से इमेजिंग के लिए कताई डिस्क कॉन्फोकल का उपयोग करना होगा। इसके अलावा, थर्मोप्लाज्मोनिक दृष्टिकोण आमतौर पर प्रति घंटे इष्टतम परिणामों की एक सीमित संख्या पैदा करता है जब एकल कोशिकाओं या जीयूवी प्रयोगों पर लागू होता है, आमतौर पर दो से तीन, 20 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच नमूना तापमान पर। प्रोटीन-झिल्ली गतिशीलता का सबसे सटीक अवलोकन प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को HEPES युक्त बफर में रखने और हर घंटे नमूना बदलने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, प्रयोगात्मक खिड़की 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान पर, यानी, एक सेल इनक्यूबेटिंग चैम्बर में प्रयोगों प्रदर्शन द्वारा बढ़ाया जा सकता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को अन्य इमेजिंग तकनीकों के साथ जोड़ना, जैसे स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), बायोफिजिकल फ़ंक्शन और एकल-अणु स्तर पर झिल्ली की मरम्मत में शामिल प्रमुख प्रोटीनों की बातचीत की गहरी समझ प्रदान कर सकता है। यह चोट की साइट पर विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है, जिसमें घाव की ज्यामिति और एनेक्सिन प्रोटीन का स्थान शामिल है, साथ ही झिल्ली की सतह की मरम्मत में शामिल अन्य प्रमुख खिलाड़ियों की पहचान भी कर सकता है।

झिल्ली की चोट को प्रेरित करने में अधिकतम प्रभावशीलता और सटीकता प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक प्रयोग से पहले लेजर फोकस के स्थान को सत्यापित करना और यह सुनिश्चित करना अनिवार्य है कि लेजर फोकस की अक्षीय स्थिति कॉन्फोकल फोकस के साथ मेल खाती है। यह संरेखण एयूएनपी इमेजिंग के दौरान तीव्रता का अनुकूलन करता है, जिससे अधिकतम स्थानीय तापमान में वृद्धि होती है और परिणामस्वरूप कम लेजर शक्ति पर झिल्ली की चोट होती है। इस प्रक्रिया को मैन्युअल रूप से निष्पादित किया जाता है और इसलिए झिल्ली टूटना दक्षता में परिवर्तनशीलता के लिए अतिसंवेदनशील होता है क्योंकि फोकस मैन्युअल रूप से एक ऐसी स्थिति में अनुवादित होता है जो कण के स्थान के साथ मेल खाता है। सूक्ष्मदर्शी में जिसमें प्रतिबिंब मोड की कमी होती है, जैसा कि कुछ वाणिज्यिक प्रणालियों में होता है, लेजर फोकस और कण का सह-स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। ऐसे मामलों में, वैकल्पिक इमेजिंग मोड (जैसे, उज्ज्वल क्षेत्र) नियोजित किया जा सकता है, और एक धीमी गति से रेखापुंज स्कैन अपेक्षित कण स्थिति के आसपास किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कम लेजर शक्ति केवल झिल्ली पारगम्यता को प्रेरित करने की संभावना है, जबकि उच्च लेजर शक्ति एनपी के आसपास तापमान उत्पन्न कर सकती है जो पानी के क्वथनांक से अधिक है, भले ही कांच की सतह का शीतलन प्रभाव हो। यह अनुमान है कि एनपी के आसपास नैनोबबल्स का गठन 200 डिग्री सेल्सियस और 300 डिग्री सेल्सियस25,48 के बीच होता है, जहां विस्फोटक गर्मी के परिणामस्वरूप लेजर फोकस या कण विखंडन से कण विस्थापन हो सकता है। इसके अतिरिक्त, हीटिंग के दौरान नैनो या सूक्ष्म बुलबुले का गठन इस पद्धति के लिए एक चुनौती है। चूंकि हवा के इंटरफेस झिल्ली को गीला करते हैं और प्रोटीन अस्थिरता का कारण बन सकते हैं, जो अवांछनीय है, झिल्ली की मरम्मत की जांच करते समय हीटिंग को सीमित करना अनिवार्य है। विशेष रूप से, सोने के नैनोशेल उच्च तापमान को सहन नहीं करते हैं और इन परिस्थितियों में नीचा दिखाएंगे, जैसा कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी58 द्वारा प्रदर्शित किया गया है।

यह लेख झिल्ली में अत्यधिक स्थानीयकृत पंचर करने के लिए थर्मोप्लास्मोनिक्स का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जो कोशिकाओं और मॉडल झिल्ली दोनों पर लागू होता है। हीटिंग की सीमा को और कम करने के लिए, एनआईआर प्रकाश के साथ गुंजयमान छोटे नैनोकणों का उपयोग किया जा सकता है, जिससे एंडोसोम, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और परमाणु लिफाफे में इंट्रासेल्युलर पंचर सक्षम हो सकते हैं। छड़ और nanomatryoshkas48 सहित इस तरह के nanoparticles, endocytosed सोने नैनोकणों है कि आसानी से सेल की सतह पर ले जाया जाता है और नाभिक69 की ओर तस्करी को लक्षित करके परमाणु लिफाफा की मरम्मत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल मिलाकर, यह तकनीक पीएमआर में शामिल प्रमुख आणविक घटकों की पहचान और परीक्षा को सक्षम बनाती है, कोशिकाओं की व्यवहार्यता को संरक्षित करते हुए उनके बायोफिजिकल फ़ंक्शन और भूमिका को स्पष्ट करती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम हमें पुनः संयोजक एनेक्सिन प्रोटीन और एनेक्सिन के लिए प्लास्मिड एन्कोडिंग प्रदान करने के लिए जेस्पर नाइलैंडस्टेड का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को डेनिश काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च, नेचुरल साइंसेज (DFF-4181-00196) द्वारा नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन इंटरडिसिप्लिनरी सिनर्जी प्रोग्राम 2018 (NNF18OC0034936), वैज्ञानिक समिति डेनिश कैंसर सोसाइटी (R90-A5847-14-S2), लुंडबेक फाउंडेशन (R218-2016-534), और लुंडबेक फाउंडेशन सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (नैनोमेडिसिन में बायोमेम्ब्रेन) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1064 nm trapping laser Spectra Physics N/A Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold Nanoshells NanoComposix NCXGSIR150
200 nm Gold Nanoparticles BBI Solutions EM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwell MATTEK P35G-1.5-14-C
Amber-glass vials Supelco Sigma Aldrich 243438
Annexin A2 plasmids N/A N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-casein Sigma Life Science C6905-1G
CaCl2 Suprlco (sigma Aldrich) 10035-04-8
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702
Chloroform VWR Chemicals 67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface) Thermo scientific 150460
DID cell-labelling Solution Invitrogen  7757
Distilled water Gibco 15230-089
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Dissolved in chloroform 
DOPS Avanti Polar Lipids 840035C Dissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's Medium Thermo Fisher Scientific 11995065
FIJI ImageJ distribution ImageJ2 N/A
GCaMP6s-CAAX N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 11573397 10% of the culture medium
Glucose PROLABO 24 374.297
Hamilton syringes Hamilton Company N/A 50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 Harrick Plasma N/A
HEK293T cells N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) Leica N/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 Leica N/A
Leica SP5 confocal scanning microscope Leica N/A
Lipofectamine Fisher Scientific 15338030
MatLab The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States N/A
NaCl VWR Chemicals 7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum Medium Thermo Fisher Scientific 11058021
Parafilm Bemis PM-992
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 1% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20)  Physik Instrumente (Germany) N/A
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920-100ML 0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich 363065-25G
round glass slide 25 mm Ø VWR 631-1584
Sonicator Brandson 2800 Brandson N/A
sucrose Sigma Life Science 57-50-1
T25 tissue culture flask Falcon 353108 Blue Vented cap
Tris-HCl Invitrogen  15567-027
TrypLE Thermo Fisher Scientific A1285901
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 11590626
 VWR Mixer mini vortex 230V EU VWR  12620-84  ECN: 444-2790, SN: 150713022

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JoVE में इस महीने अंक 203 बायोफिज़िक्स प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत ऑप्टिकल चिमटी एनेक्सिन विशाल यूनिलामेलर पुटिकाएं थर्मोप्लास्मोनिक्स झिल्ली रिसाव
जीवित कोशिकाओं और मॉडल झिल्ली में प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की जांच के लिए एक थर्मोप्लास्मोनिक दृष्टिकोण
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Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., … More

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., Moreno-Pescador, G., Bendix, P. M. A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes. J. Vis. Exp. (203), e65776, doi:10.3791/65776 (2024).

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