Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En termoplasmonisk metod för att undersöka reparation av plasmamembran i levande celler och modellmembran

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65776
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1The Niels Bohr Institute, University of Copenhagen, 2Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

Summary

Den termoplasmoniska punkteringsmetoden integrerar konfokalmikroskopi, optisk pincett och guldnanopartiklar för att studera proteinsvar under reparation av plasmamembran i celler och gigantiska unilamellära vesiklar. Tekniken möjliggör snabb och lokaliserad membranpunktion, vilket gör det möjligt att identifiera nyckelproteiner och deras funktionella roller i det intrikata plasmamembranreparationsmaskineriet.

Abstract

Cellmembranet är avgörande för cellens överlevnad, och att säkerställa dess integritet är viktigt eftersom cellen upplever skador under hela sin livscykel. För att förhindra skador på membranet har cellerna utvecklat effektiva mekanismer för reparation av plasmamembran. Dessa reparationsmekanismer kan studeras genom att kombinera konfokalmikroskopi och termoplasmonik i nanoskala för att identifiera och undersöka rollen för nyckelproteiner, såsom annexiner, som är involverade i ytreparation i levande celler och membranmodellsystem.

Punkteringsmetoden använder en laser för att inducera mycket lokal uppvärmning vid bestrålning av nanopartiklar. Användningen av nära-infrarött ljus minimerar fototoxiciteten i det biologiska provet, medan majoriteten av absorptionen sker i den nära-infraröda resonansplasmoniska nanopartikeln. Denna termoplasmoniska metod har utnyttjats för potentiell fototermisk och biofysisk forskning för att öka förståelsen för intracellulära mekanismer och cellulära svar genom vesikel- och cellfusionsstudier. Tillvägagångssättet har visat sig vara ett komplement till befintliga metoder för membranstörningar, såsom mekaniskt, kemiskt eller optiskt inducerade skador, och ger en hög grad av kontroll genom att tillfoga extremt lokala skador. Skadans omfattning är begränsad till närheten av den sfäriska nanopartikeln, och ingen skadlig skada uppstår längs strålvägen i motsats till pulsade lasrar med olika våglängder. Trots vissa begränsningar, såsom bildandet av nanobubblor, erbjuder den termoplasmoniska metoden ett unikt verktyg för att undersöka cellulära svar vid reparation av plasmamembran i en nästan naturlig miljö utan att kompromissa med cellviabiliteten.

När punkteringsmetoden integreras med konfokalmikroskopi kan den ge en mekanistisk förståelse av membrandynamik i modellmembransystem samt kvantitativ information om proteiners svar på membranskador, inklusive proteinrekrytering och deras biofysiska funktion. Sammantaget kan tillämpningen av denna metod på reducerade modellsystem öka vår förståelse för det intrikata plasmamembranreparationsmaskineriet i levande celler.

Introduction

Cellmembranet, som fungerar både som en fysisk barriär och en signalplattform, är avgörande för cellens överlevnad1. Under hela sin cellcykel utsätts plasmamembranet (PM) för skador, såsom mekaniska 2,3,4,5 och kemiska6 stressinducerade skador. För att upprätthålla membranintegriteten och säkerställa cellens överlevnad har cellen utvecklat robusta mekanismer för reparation av plasmamembran (PMR). Dessa mekanismer beror på olika strategier, såsom omorganisation av cytoskelett, membranfusion och membranersättningsstrategier 7,8,9,10,11, som alla är beroende av rekrytering av specifika proteiner. Noterbart är att medlemmar av annexinproteinfamiljen har identifierats som nyckelproteiner associerade med processerna för PMR 1,9,12,13,14,15,16. Efter partikelskada upplever cellen ett inflöde av kalciumjoner (Ca2+), vilket utgör ett omedelbart hot mot cellens överlevnad17. Som svar på Ca2+-inflöde binder annexinproteiner, som huvudsakligen finns i cytosolen, till det inre bladet i det skadade plasmamembranet som en del av PMR-strategierna18. Annexin A2 (ANXA2) var en av de första medlemmarna i annexinfamiljen som associerades med PMR vid dysferlin-bristfällig muskeldystrofi och föreslogs förmedla reparation genom att smälta intracellulära vesiklar till PM nära skadestället 5,19,20,21. Därefter har flera funktioner tillskrivits annexiner22, och deras roll i PMR har fått ökad uppmärksamhet under de senaste 20 åren. Den exakta rollen för annexiner i PMR är dock fortfarande inte helt klarlagd 15,18,21,22.

Denna artikel föreslår en metod för att undersöka protein-membraninteraktion och membrandynamik på ett kontrollerat och mycket lokaliserat sätt, med hjälp av en kombination av konfokalmikroskopi, optisk pincett och guldnanopartiklar (AuNP). Denna metod möjliggör kvantitativa studier av protein-, lipid- och småmolekylinteraktioner som svar på membranskador och Ca2+ -inflöde. Trots komplexiteten och mångfalden av komponenter som är involverade i processen för membranreparation, har förenklade membransystem som efterliknar plasmamembranet använts för att få en djupare mekanistisk förståelse av membrandynamik och annexinproteiners respons på membranstörningar16. Gigantiska unilamellära lipidvesiklar (GUV) valdes som modellmembransystem med en specificerad lipidsammansättning. GUV:erna genererades med hjälp av den gelassisterade hydratiseringsmetoden, särskilt polyvinylalkoholgelhydratisering, som beskrivs av Weinberger et al.23, vilket möjliggjorde effektiv inkapsling av annexiner i GUV:er.

Användningen av nära-infraröd (NIR) laserbestrålning på metalliska nanopartiklar (NP) inducerar betydande uppvärmning av NP, vilket gör det till en effektiv metod för att etablera en lokal värmekälla som utnyttjas i biomedicinska tillämpningar24. Metoden användes ursprungligen för att direkt mäta temperaturen kring en enda AuNP i både 2D och 3D biomimetiska analyser. I dessa analyser25,26 bestrålades de plasmoniska nanopartiklarna på ett lipiddubbelskikt eller optiskt fångade nära GUV:er som genomgick en lokal termisk fasövergång vid lokal uppvärmning, vilket möjliggjorde kvantifiering och kontroll av den exakta temperaturprofilen runt partikeln. Denna referenstemperaturprofil har använts vid undersökning eller manipulering av biologiska prover. Ytterligare framsteg i metoden har underlättat induktionen av nanoskopiska porer i membran27, vilket möjliggör vesikel- och cellfusion28,29. Andra studier har undersökt beteendet hos perifera membranproteiner i GUVs29 och transmembranproteiner30 genom att skapa nya hybridvesiklar, medan cellspecifik läkemedelsleverans också har utforskats för att kontrollera och studera cellulära svar eller genuttryck 28,29,31,32,33. På senare tid har metoden använts för att undersöka proteiners respons på membranskador 32,34,35.

Det finns flera metoder för att störa plasmamembranet för att utforska cellulära svar och membranreparation. Dessa inkluderar mikronålspunkteringar, skakning av mikropärlor och cellskrapning, som alla kan störa cellmembranet mekaniskt 14,36,37. Kemiskt inducerad skada kan uppnås genom tillsats av rengöringsmedel 5,38 eller bakterietoxiner39,40 som destabiliserar lipiddubbelskiktet och genererar membranporer över plasmamembranet. Dessutom har optiskt inducerade skador av kontinuerliga vågor och pulsade lasrar använts för att studera PMR-komponenter, såsom annexinproteiner 5,14,21,41, i kombination med plasmoniska nanopartiklar 42,43,44,45. Trots effektiviteten hos pulsade lasrar med hög effekt kan de orsaka betydande skador och skador på cellens inre längs strålvägen. Dessutom återstår det att undersöka de detaljerade förändringar som sker i det biologiska materialet vid pulsad laserbestrålning och om det skapar en väldefinierad por. En alternativ metod presenteras i denna artikel, som använder termoplasmonik för att inducera nanoskopiska hål i PM på ett kontrollerat sätt34,35 utan att orsaka betydande skada på de inre strukturerna. Detta åstadkoms genom att exponera plasmoniska NP för en mycket fokuserad NIR-laser, vilket resulterar i en extremt lokal temperaturökning som lätt kan nå temperaturer över 200 °C, vilket kan leda till små nanoskopiska explosioner 25,46,47. Denna process kan styras genom att justera laserintensiteten samt storleken, formen och sammansättningen av NP48. Genom att använda denna teknik kan forskare utforska proteinernas roll i PM-reparation i levande celler, vilket kan hjälpa till att ta itu med några av de obesvarade frågorna om annexinproteiners inblandning i membranreparation utan att äventyra cellviabiliteten.

Den optiska infångningen av plasmoniska nanopartiklar är väl etablerad i tidigare studier 25,49,50,51,52; Ytterligare insikter om de termoplasmoniska egenskaperna hos nanopartiklarna 53,54,55 kan dock erhållas i de kompletterande materialen (Supplementary File 1). Den termoplasmoniska metoden kan användas för att skapa nanoskopiska hål i PM i syfte att studera cellulära respons- och reparationsmekanismer. Mer exakt kan punkteringen åstadkommas genom optisk uppvärmning av AuNP i närheten av membranet, som visas i figurerna 1A och B. Denna lokaliserade punktering möjliggör Ca2+-inflöde, vilket verifierades av en kalciumsensor, vilket aktiverar PMR-maskineriet. För experiment med levande celler immobiliserades AuNP med en diameter på 200 nm på ytan under cellen för att övervaka ANXA2:s roll i PMR via konfokalmikroskopi. NIR-lasern (figur 1A,B), med en våglängd på 1064 nm, bestrålar AuNP och utnyttjar dess plasmoniska egenskaper (figur 1C), vilket resulterar i betydande lokal uppvärmning (figur 1D) i det biologiska transparensfönstret49 samtidigt som den orsakar minimal skada på själva cellen. Högtemperaturområdet som omger AuNP minskar snabbt med 30-40 % på ett avstånd som motsvarar NP:s radie, som visas i figur 1E, vilket möjliggör en extremt begränsad skada i alla tre dimensionerna.

Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över den experimentella metoden. (A) ANXA-transfekterade celler är belägna ovanpå immobiliserade guldnanopartiklar (AuNP) på ytan, eller (B) gigantiska unilamellära vesiklar (GUV) med inkapslad ANXA är suspenderade i ett medium som innehåller AuNPs. (C) En enda AuNP bestrålas av den optiska NIR-fällan, där interaktionen mellan det inkommande elektromagnetiska fältet och ledningselektronerna leder till en kollektiv svängning av elektroner inom NP. (D) Denna process resulterar i en mycket begränsad men ändå betydande temperaturökning. För att uppskatta temperaturen vid NP-ytan används Mie-teorin, och en (E) temperaturprofil beräknas för en AuNP med en diameter på 200 nm och laserintensiteten I = 6,36 x 108 W/cm2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För att minimera den termiska effekten på cellmembranet bestrålas AuNP endast i ~1 sekund. Detta orsakar en övergående och lokal explosion av uppvärmning, vilket minskar skadorna på proteiner som vanligtvis kräver mer tid för att utvecklas. Vid membranpunktion rekryteras annexinproteiner på bråkdelen av en sekund, och inom några sekunder bildas en annexinringliknande ställning runt skadestället (Figur 2). Detta tillvägagångssätt har också tillämpats för att utforska involveringen av ANXA5 i både levande celler och modellmembran16 i ett försök att belysa hela schemat för reparationsprocesserna. Medan det primära fokuset har legat på korrelerande rekrytering av olika annexinproteiner, har de biofysiska aspekterna av reparationsmekanismen ännu inte klarlagts.

För att fullt ut implementera den föreslagna metoden krävs tre nyckelkomponenter: konfokalmikroskopi, optisk pincett och metallnanopartiklar. Optisk pincett används för att fånga AuNPs, och deras konstruktion kan uppnås genom att följa proceduren som beskrivs av Neuman et al.49. Men om det visar sig vara för utmanande att bygga en optisk pincett, kan en tätt fokuserad NIR-laser användas för att bestråla AuNPs immobiliserade under cellerna. Medan sfäriska AuNP valdes för detta protokoll, kunde en mängd plasmoniska partiklar med avstämbara absorptionsspektra också användas för att uppnå en mycket lokal temperaturgradient inom NIR-regionen48.

Fluorescensavbildning är nödvändig för att observera de fluorescerande märkta proteinernas roll, och därför kan total intern reflektionsmikroskopi (TIRF)56 övervägas som ett alternativ till konfokal avbildning. Denna teknik tillåter dock endast ytavbildning och skulle inte vara kompatibel med modellmembranvesikelexperimenten. Följaktligen är både den optiska pincetten och konfokalmikroskopet viktiga för den exakta lokaliseringen av nanopartikeln och detaljerad undersökning av det lokala området kring cellskadan. För att effektivt bestråla nanopartikeln med ett diffraktionsbegränsat laserfokus är det nödvändigt att visualisera nanopartikeln. Detta kan uppnås optimalt genom reflektionsmikroskopi, som är en standardavbildningsfunktion för Leicas konfokalmikroskop. Om reflektions- eller spridningsavbildning inte är tillgänglig kan dock alternativa metoder, såsom den mindre effektiva fluorescerande AuNP-märkningen, övervägas.

Sammanfattningsvis har den mycket kontrollerbara och lokaliserade termoplasmoniska metoden som presenteras i denna studie potential att fungera som en utmärkt plattform för att undersöka de molekylära komponenter som är involverade i cellulära svar och PM-reparationsmekanismer i levande celler. Förutom att studera proteinresponsen vid PM-skada kan detta tillvägagångssätt också användas för att lokalt punktera vesiklar, vilket möjliggör en undersökning av proteinresponsen i både protein-protein och protein-membrandynamik. Dessutom möjliggör denna metod en kvantitativ analys av interaktionerna mellan proteiner, lipider och små molekyler när membran störs. Sammantaget har dessa framsteg potential att kasta ljus över några av de olösta frågorna om det intrikata och komplexa maskineriet för reparation av plasmamembran.

Protocol

1. Förberedelse av punktion av cellmembran

  1. Cellsådd (dag 1)
    1. Odla humana embryonala njurceller (HEK293T) i odlingsmedium vid 37 °C i en 5 % CO2 luftfuktare inkubator tills de når 70 % sammanflöde.
    2. Lossa cellerna från ytan med hjälp av 500 μL trypsin, räkna 200 000 HEK293T celler och så dem i en odlingsskål med en total volym på 3 ml odlingsmedium. Inkubera cellerna vid 37 °C i en inkubator för 5 % CO2 luftfuktare i 24 timmar.
      OBS: För att förhindra cellkluster i mitten av skålen, sprid cellerna jämnt och undvik att virvla skålen, eftersom detta kan minska transfektionseffektiviteten.
  2. Celltransfektion (dag 2)
    OBS: De transfekterade cellerna kan användas upp till 48 timmar efter transfektionen.
    1. Pipettera plasmiden av intresse och transfektionsreagenset i 5 s före användning.
    2. Blanda följande i en steril 2 ml tub i specifik ordning: 500 μl reducerat serummedium, 5 μl transfektionsreagens (4 gånger mer än plasmiden) och 1,25 μL plasmid (1 μg/μL).
      OBS: För att undersöka kalciuminflöde vid membranbrott, följ samma procedur men använd den membranbundna kalciumsensorsonden GCaMP6-CAAX (1 μg/μL).
    3. Pipsa försiktigt men noggrant transfektionsblandningen och inkubera den i rumstemperatur (RT) i 30 minuter innan du tillsätter den droppvis till cellerna.
    4. Innan du tillsätter transfektionsblandningen, ta bort mediet från odlingsformen, tvätta försiktigt cellerna med 2 ml fosfatbuffrad koksaltlösning och tillsätt 2000 μl reducerat serummedium till skålen.
    5. Inkubera cellerna tillsammans med transfektionsblandningen vid 37 °C i en 5 % CO2 luftfuktare inkubator i 2 timmar och 45 minuter innan mediet byts till 3 ml odlingsmedium.
  3. Beredning av guldnanopartikellösning (AuNP) (dag 2)
    1. Virvla 200 nm AuNP-stamlösningen i 10 s på nivå 10 (se materialtabell för ytterligare specifikation av apparaten), sonikera i 5 min (max amplitud) och virvla igen i 10 s.
    2. Blanda 150 μL AuNP med 850 μL destillerat vatten till en total volym av 1 ml.
      OBS: Den utspädda AuNP-lösningen kan förvaras i kylen och återanvändas i upp till 1 månad.
  4. Beredning av försöksskålen (dag 2)
    1. Täck mikrobrunnsskålen med 150 μL 0,01%-0,1% cellbindningslösning och inkubera i 15 minuter vid RT.
    2. Tvätta glasytan två gånger med 500 μL destillerat vatten och låt den lufttorka i ~10 min.
    3. Tillsätt 80 μl AuNP-lösning droppvis till den torra ytan.
      OBS: Virvla (10 s), sonikera (5 min) och virvla (10 s) den utspädda AuNP-lösningen innan du tillsätter den till den belagda glasytan för att minimera AuNP-aggregat.
    4. Vänta i ~10 minuter innan du tillför 1.5 ml odlingsmedium. Låt skålen inkubera vid 37 °C över natten.
  5. Förberedelse av försökskammaren (dag 3)
    OBS: Försökskammaren kan beredas antingen dag 3 eller 4; Se dock till att följande förberedelser görs samma dag som försöket.
    1. Ta bort mediet från cellerna i odlingsskålen och tvätta cellerna med 2 ml fosfatbuffrad koksaltlösning.
      OBS: Detta steg är viktigt för att ta bort eventuellt kvarvarande medium och skräp som kan störa de efterföljande stegen.
    2. Tillsätt 500 μl enzymbaserad cellavskiljningslösning till brunnen och inkubera i 1–3 minuter tills cellerna har lossnat från odlingsskålen.
    3. Tillsätt 1,5 ml färskt odlingsmedium och pipettera celllösningen för att få en homogen celllösning för att minimera sannolikheten för cellkluster.
    4. Ta försiktigt bort mediet från AuNP i den experimentella mikrobrunnen.
    5. Tillsätt celllösningen (2 ml) till mikrobrunnen och låt den inkuberas i minst 5 timmar innan försöket utförs.
      OBS: För optimala experimentella förhållanden, undvik att virvla kammaren, eftersom detta kan få celler att samlas i mitten av kammaren.

2. Experiment med punktion av cellmembran

  1. Experimentets optiska inställningar
    1. Utför experimenten med hjälp av ett konfokalt skanningsmikroskop kombinerat med en 1064 nm fångstlaser57.
    2. Utför den optiska fällan vid fokalplanet med ett 63x vattennedsänkningsobjektiv med en numerisk bländare (NA) på 1,2.
    3. Antag att fokus är storleken på en Airy-skiva och att bestrålningslaserns fokalstrålebredd är ~540 nm i radie.
    4. Konvertera lasereffekten (P) till motsvarande laserintensitet (I) genom att beräkna lasereffekten per område (W/cm2).
    5. Använd en acousto optisk stråldelare (AOBS) för att visualisera flera fluorescerande signaler detekterade med hjälp av fotomultiplikatorrör och samtidig detektion av metalliska NP via deras spridningssignal.
      OBS: Inte alla konfokala system är utrustade med AOBS, vilket möjliggör reflektionsavbildning av metalliska NP. Här måste andra former av detektion implementeras, eller så kan en sekventiell skanning av NIR-lasern i området under cellen försökas.
    6. Under experimentsessionerna monterar du en öppen kammare med glasbotten som innehåller celler, molekylära fluorescerande sonder och guldnanopartiklar på mikroskopet.
    7. Flytta fällan i förhållande till cellerna genom att översätta provet monterat på ett piezoelektriskt steg, vilket möjliggör laterala rörelser med nanometerprecision16.
      OBS: Den optiska fällan hålls stillastående.
  2. Experimentella inställningar för cellmembranpunktion
    1. Placera HEK293T celler, transfekterade med annexinplasmider kopplade till ett fluorescerande protein, ovanpå isolerade AuNP som är immobiliserade på glasytan (figur 1A).
    2. Använd en Argon 488 nm-laser för att visualisera GFP-fluorescenssignalen och en HeNe 633 nm-laser för att observera AuNP-reflektion i det svepande konfokalmikroskopet.
    3. Använd den optiska pincetten, som arbetar med en 1064 nm NIR-laser, för att bestråla en enda AuNP i ~1 s, vilket inducerar en betydande lokal temperaturökning som stör plasmamembranet.
    4. Applicera bestrålning mellan 200-295 mW på den fokuserade partikeln, vilket resulterar i en betydande temperaturökning.
      OBS: Det finns en betydande effektförlust i optiken, med lasereffekten vid brännpunkten som når cirka 20 % av den angivna milliwatten, beroende på den specifika inställningen. Den specifika intensiteten (mätt i W/cm2) beror på systemets exakta inriktning, särskilt brännvidden. Dessutom är värmeledningen av glas högre än för cell och vatten och följaktligen minskar mängden värme som frigörs till plasmamembranet något48,58.
    5. Uppnå effektiv och lokaliserad PM-skada och efterföljande proteinreparationsrespons genom att korrekt kalibrera lokaliseringen av NIR-laserfokuspunkten. Detta uppnås genom att fånga en enda AuNP upphängd i samma bildmedium och se till att den valda AuNP är i fokus före bestrålning.
      OBS: Nanopartikeln anses vara i fokus när dess spridningssignal verkar som skarpast, dvs. uppvisar tydliga kanter och frånvaron av en halo runt partikeln, när den observeras i konfokalmikroskopi (Figur 2C (ii)).
  3. Densitetsförhållanden för celler och AuNP
    1. Välj enstaka celler istället för cellkluster för att förhindra överlappning av plasmamembran.
      OBS: Cellerna ska fästas på ytan och uppvisa en tillplattad morfologi (tilläggsfigur 1), vilket möjliggör punktering av cellens periferi samtidigt som skador på kärnmembranet förhindras (tilläggsfigur 2).
    2. Inkubera cellerna enligt protokollet eller tills de har stabiliserat sig och plattats till för att förhindra AuNP-cellulärt upptag. Undvik för lång inkubationstid och minska sannolikheten för AuNP-endocytos med hjälp av PEGylerade AuNP.
    3. Se till att de immobiliserade AuNP finns som enstaka partiklar, tillräckligt åtskilda från varandra för att förhindra aggregat. Aggregat kan leda till en betydande ökning av den termiska gradienten, vilket resulterar i förhöjda temperaturer som kan störa en betydande del av cellen.
    4. Byt ut sample var 1-2:e timme för att bibehålla cellhälsan.
      OBS: Långvarig exponering kan leda till en försämring av cellhälsan, vilket äventyrar deras förmåga att reagera korrekt på skador när det gäller membranreparation. Denna försämring av cellhälsan observeras vanligtvis av en förändring i cellformen, eftersom cellerna verkar mer sfäriska och styvare, vilket så småningom kulminerar i celldöd.

Kompletterande information. Klicka här för att ladda ner den här filen.

3. Beredning av jätte unilamellär vesikel (GUV)

  1. Beredning av lipidblandningen
    1. Gör GUV-lipidsammansättningen genom att kombinera lipiderna 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serin (DOPS) i ett molärt förhållande på 4:1 (se tabell 1). Fördela lipidlagret i 1,5 ml injektionsflaskor av glas enligt de experimentella behoven och förvara dem vid -20 °C.
      OBS: För långvarig lipidkonservering och för att förhindra oxidation av omättade lipider, ersätt luften med argon i de aliciterade injektionsflaskorna.
    2. Innan lipiderna blandas, rengör noggrant en 50 μL och en 500 μL glas- eller metallspruta med kloroform fem gånger för att säkerställa att de är fria från föroreningar för de kloroformlösta lipiderna.
      VARNING: Hantera kloroform i ett dragskåp på grund av dess toxicitet.
      1. Överför den beräknade volymen kloroform till en ren injektionsflaska av bärnstensfärgat glas, följt av den specificerade mängden av varje lipid (se tabell 1).
        OBS: För att undvika korskontaminering mellan lipidlager, se till att sprutorna rengörs med kloroform.
      2. Tillsätt slutligen membranfärgen och blanda lipiderna ordentligt genom pipettering. Förvara den beredda lipidblandningen vid -20 °C för vidare användning. Blandningen förblir livskraftig i 2-3 veckor utan några betydande lipidskador.
        OBS: Blandningen ska göras med en metall- eller glasspruta. Förvara alltid lipiderna på is när de är ute ur frysen.
  2. Beredning av polyvinylalkohol (PVA) gel
    1. Förbered GUV:erna med hjälp av den gelassisterade hydreringsmetoden som beskrivs av Weinberger et al.23med mindre modifieringar.
      1. Bered PVA-gelen genom att lösa upp 5 g PVA i 100 ml av en buffert innehållande 50 mM sackaros, 25 mM NaCl och 25 mM Tris (pH 7,4).
      2. Värm PVA-lösningen till 85 °C och rör om tills den blir genomskinlig. Låt den svalna till RT och förvara den i kylskåp för vidare användning.
        OBS: PVA är inte ordentligt upplöst i bufferten, och därför är uppvärmning upp till 85 °C nödvändig.
  3. Beredning av glasskivor
    1. Rengör glasskivorna med etanol och låt dem lufttorka. Behandla sedan objektglasen med en luftplasmarengörare för att ta bort eventuell kvarvarande kontaminering från glasytan.
    2. Beredning av PVA-belagda glasskivor
      1. Värm PVA-gelen (5 %) upp till 60 °C i 30 minuter för att öka dess flytbarhet. Applicera 90 μL av den varma PVA:n på glasglaset, fördela jämnt och låt den torka i ett värmeskåp vid 50 °C i 50 minuter.
      2. När PVA-glasglaset är klart, tillsätt 30 μl av den beredda lipidblandningen med hjälp av en glas- eller metallspruta och sprid ut den i en tunn film med hjälp av nålens kant.
      3. Torka lipidblandningen genom att indunsta dess kloroforminnehåll under lätt kvävetryck. Torka sedan glasskivorna under vakuum i 1,5-2 timmar.
  4. Odla GUV:er i en kammare
    1. Montera den interna kammaren, som har en liknande design som en tidigare publicerad rapport59, med hjälp av den förberedda glasskivan.
    2. I ett separat 2 ml rör späds det rekombinanta proteinet av intresse (i detta fall ANXA5 eller ANXA4) till en slutlig koncentration av 500 nM med en växande buffert (GB) bestående av 80 mM sackaros, 70 mM NaCl och 25 mM Tris-HCl (pH 7,4).
    3. Tillsätt 400 μl av den utspädda rekombinanta proteinlösningen till kammaren. Inkubera kammaren vid RT i 1 timme så att GUV kan växa från det deponerade lipidhöljet. Använd samma buffert, exklusive proteinet, som en negativ kontroll.
      OBS: Linda in kammaren i polyolefinfilm för att förhindra buffertavdunstning.
    4. Samla upp GUV:erna genom att överföra 400 μl av kammarens innehåll till ett 2 ml rör.
    5. Avlägsna icke-inkapslade proteiner utanför GUV:erna genom att tillsätta 1 ml observationsbuffert (OB) innehållande 55 mM glukos, 70 mM NaCl och 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) till den uppsamlade lösningen. Centrifugera sedan lösningen vid 600 x g i 10 minuter vid 13 °C.
    6. Efter centrifugeringen ersätts 1 ml av supernatanten med en lika stor volym observationsbuffert. Sprid GUV:erna genom försiktig pipettering och förvara dem i kylskåpet tills de används i GUV-experiment.

4. Experiment med GUV-punktering

  1. Förberedelse av kammaren
    1. Använd en 35 mm tjock glasbotten för experimentet. För att förhindra att GUV fastnar på ytan och spricker, belägg ytan med β-kasein (5 mg/ml) i 15-30 minuter.
      1. För β-kaseinlösningen, lös 0,1 g av proteinet i en 20 ml buffert med 20 mM Tris (PH 7,5) och 100 mM NaCl. Filtrera proteinlösningen, fördela den i små injektionsflaskor och frys in den för vidare användning.
    2. Tvätta kammaren två gånger med observationsbuffert för att ta bort eventuellt överskott av fria β-kaseiner från ytan och låt torka vid RT.
    3. Blanda de uppsamlade GUV:erna med OB i ett separat 2 ml rör. Tillsätt CaCl2 till blandningen för önskad slutlig koncentration (i detta fall 200 μM).
    4. Tillsätt 150 nm guldnanoskal (AuNS) till blandningen i förhållandet 1:100. Den slutliga blandningen består av 250 μl GUVs, 225 μL OB, 20 μL CaCl2 (5 mM) och 5 μL av de specificerade AuNS.
  2. Experimentell uppställning
    1. Överför blandningen till kammaren och montera den på mikroskopetage. Beroende på kammarens storlek, tillsätt antingen hela blandningen eller en del av blandningen.
      OBS: Timing är kritisk eftersom kalciumjoner kan passera genom membranet och förmedla bindningen av annexinerna till membranets inre broschyr.
    2. Använd samma optiska uppställning som används för cellpunkteringsexperimenten.
    3. Använd den optiska pincetten för att fånga en enskild AuNS i närheten av eller på ytan av en GUV genom att applicera en lasereffekt på ~ 125 mW.
    4. Öka sedan lasereffekten till ~ 300 mW. Detta ger en mycket lokal temperaturökning, vilket stör och punkterar membranet på målplatsen.
      OBS: AuNS är att föredra för GUV-experimenten på grund av deras förmåga att generera en högre transient temperaturökning samtidigt som de bibehåller en mindre storlek jämfört med fasta AuNP.

Table 1
Tabell 1: Tabell för bestämning av GUV-sammansättningen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

5. Mätningar och dataanalys av ANXA-respons i cellpunktionsexperiment

  1. Använd MATLAB för att analysera bilderna och för att beräkna och plotta AuNP-temperaturprofilen (Figur 1D, E) baserat på Mies ekvationer60,61.
  2. Bearbeta dessutom alla konfokala bilder med FIJI ImageJ-fördelningen62,63.
  3. Beräkning av ANXA-ringradien
    1. Beskär det intressanta området som innehåller det punkterade området från rådata före membranskadeanalysen.
    2. Använd det interna MATLAB-arbetsflödet för att bearbeta varje bild genom att manuellt markera mitten av ANXA-ringen och dess yttre omkrets.
      1. Använd dessa markeringar för att ställa in bearbetningsgränserna för det intressanta området.
        OBS: Området bearbetas därefter radiellt inom de inställda gränserna, och fluorescensintensiteten vid ett specifikt avstånd till centrum är medelvärdet över hela cirkeln med samma centrumavstånd. Detta nummer lagras för varje steg i radien.
      2. Använd arbetsflödet för att anpassa de genomsnittliga intensiteterna över hela skanningsområdet till en endimensionell Gaussisk kurva för att identifiera maxima (Rp) och full bredd vid halva maximum (FWHM) som motsvarar Rext respektive Rint, som visas i figur 3A.
    3. Slutligen bestäms ANXA-ringens radie med avståndet från ringens centrum till Rext som ges av diagrammet som genereras av MATLAB-arbetsflödet.
  4. Tredimensionell beräkning av ANXA-ringradie
    1. Spåra förändringen i ANXA-ringradien i z-riktningen med samma MATLAB-analysarbetsflöde som i steg 5.1. Applicera arbetsflödet på flera konfokala z-sektioner över membransåret, som illustreras i figur 3C, E.
    2. Beräkna lutningen för varje sår baserat på förändringen i radier över z-sektionerna, som visas i figur 3F.
  5. Tidsutveckling av ANXA-ringradien
    1. På samma sätt kan du spåra ANXA-ringens utveckling av ANXA-ringen efter termoplasmonisk membranpunktion med hjälp av MATLAB-analysarbetsflödet från steg 5.1. Analysera på varandra följande tidpunkter för att övervaka förändringar över tid, som visas i figur 3D, G, H.

Representative Results

I den aktuella studien används den termoplasmoniska metoden för att undersöka annexinproteinets svar på plasmamembranstörningar; Alla proteiner som kan rekryteras vid membranskada kan dock undersökas med hjälp av denna analys, förutsatt att respektive protein är fluorescerande märkt. Proteinrekrytering och funktion övervakas genom konfokalavbildning i både humana embryonala njurceller (HEK293T) och gigantiska unilamellära vesiklar (GUV). Figur 2 illustrerar de experimentella förhållanden under vilka en fokuserad NIR-laserstråle vid 1064 nm används för att bestråla en enda AuNP (figur 2A), vilket resulterar i membranskada och ett inflöde av Ca2+ in i cellen, vilket aktiverar PMR-maskineriet. Därefter rekryteras annexiner snabbt till skadestället, där de binder till de negativt laddade fosfolipiderna vid såromkretsen och bildar en ringliknande struktur inom några sekunder (Figur 2B, i-iv). Modellmembranexperimenten, med GUV:er, visade att membranpunkteringar snabbt återförslöts i frånvaro av ANXA, som visas i figur 2C. I närvaro av ANXA observerades dock en snabb ackumulering av ANXA på skadestället efter membranpunktion (Figur 2D). Noterbart är att ANXA fortsatte att rulla de exponerade kanterna, vilket i slutändan ledde till att GUV sprack. Denna rullningsmekanism tros uppstå från ANXA:s förmåga att inducera krökning och böja lipidmembran20.

Figure 2
Figur 2: Annexiner (ANXA) svar på termoplasmoniskt inducerad membranstörning. Inledningsvis, (A) fungerar plasmamembranet som en barriär mellan den extracellulära miljön som innehåller höga nivåer av Ca2+ -joner och den intracellulära miljön med inkapslade ANXA. Vid bestrålning med en nära-infraröd (NIR) laser genererar AuNP betydande värme, vilket gör att membranet spricker och resulterar i ett inflöde av Ca2+-joner. Följaktligen aktiveras PMR-maskineriet (plasma membrane repair), vilket innebär rekrytering av ANXA till skadestället, där de binder till negativt laddade fosfolipider. (B-D) Konfokalmikroskopibilder av en cell som innehåller ANXA2 och en GUV som innehåller ANXA4 visar denna process. i) Före bestrålningen visar bilderna en intakt cell, eller GUV, med bestrålningsställena markerade med de vita pilarna. (ii) Vid bestrålning av nanopartiklar rekryteras (B) ANXA snabbt till skadestället och bildar en ringliknande struktur runt membransåret (B [ii-iv]). Panel (C) visar en membranfärgad GUV utan ANXA, som vid punktering snabbt återförsluts utan observerbar membranombyggnad. Å andra sidan visar panel (D) en GUV innehållande rekombinant ANXA4, som redan är bunden till membranet före (i) bestrålning på grund av Ca2+-läckage över membranet. (ii) Vid punktering binder ANXA4 till de fria kanterna, vilket gör att GUV kollapsar när membranet rullar bort från kanten. Skalstrecken mäter 10 μm för figur (B), 2 μm för B (i), 10 μm för (C) och 15 μm för (D). Denna figur är återgiven från Moreno-Pescador et. al16 med tillstånd från Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Analysen av kompletta ANXA-ringliknande strukturer (Figur 2B och Kompletterande Figur 1) ger användbara insikter om sårstorlek och morfologi. Radien för ANXA-ringstrukturen kan bestämmas över tid och rum, enligt beskrivningen i avsnitt 5. Moreno et al.16 analyserade över 135 plasmamembranskador i levande celler, där analysen av ANXA5-ringstrukturer visas i figur 3. Radien bestämdes genom att mäta avståndet från ringens centrum till kurvans yttre radie baserat på den kollapsade intensitetsprofilens fulla bredd-halv-maximum (figur 3A). Resultaten illustrerade en heterogen fördelning av ANXA5-ringstorlekar (Figur 3B), som förblev konstant över tid (Figur 3D,G,H) och rymd (Figur 3C,E,F). Dessa resultat tyder på en ackumulering av ANXA5 runt skadeställena, vilket tyder på en alternativ ANXA5-medierad PMR-strategi i levande celler till den hypotetiska trattliknande inåtriktade knoppningen av det skadade membranet5.

Figure 3
Figur 3: Analys av ANXA5-ringstrukturer som omger ett skadeställe i levande celler. (A) Den schematiska framställningen illustrerar den analytiska metoden, som är baserad på den maximala bredden på halva för ANXA-intensitetslinjeprofilen. (B) Histogrammet illustrerar 135 uppmätta ANXA5-ringradier. (C) Linjeprofiler för fluorescensintensitet över en ANXA5-GFP-ring för varje z-sektion av z-stacken. (D) De konfokala bilderna illustrerar tidsutvecklingen av ett sår, där ANXA5-GFP ackumuleras vid såromkretsen omedelbart efter skadan, följt av sårstabilisering. Tidsramarna märkta 1-6 fångades med 0,66 s intervall per bildruta. Skalstapeln är 2 μm. (E) Sårens radier bestämdes som en funktion av sårdjupet baserat på den metod som presenteras i panel A. (F) Sårets lutning analyserades som ANXA5-ringradier som en funktion av z-höjden baserat på data som extraherats från panel E. (G) Linjeprofilerna för fluorescensintensitet mättes över ANXA5-GFP-ringen från panel D. där varje tidsintervall 1-6 betecknas som sektor 1-6. Slutligen (H) presenteras tidsutvecklingen för ANXA5-GFP-ringradierna som en funktion av tiden beräknad från data i panel G. Denna figur är återgiven från Moreno-Pescador et. al16 med tillstånd från Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna figur.

I jämförelse med de ringliknande strukturer som bildas genom att enbart störa partiklar (tilläggsfigur 1) kan skador i närheten av kärnan (tilläggsfigur 2A) påverka sårets utveckling och geometri. Ibland var endast en bråkdel av ANXA-ringarna uppenbara (tilläggsfigur 2B,C), som också kan analyseras med hjälp av det interna MATLAB-analysarbetsflödet (se avsnitt 5), även om ytterligare data kan gå förlorade. Vanligtvis är ANXA-ringformationer som observerats i icke-vidhäftande celler (tilläggsfigur 2C) belägna nära både kärnan och cellens periferi. Som en konsekvens kan en mer långsträckt ringstruktur observeras, vilket är suboptimalt för den dataanalys som presenteras. Dessutom verkade icke-vidhäftande celler vara mer mottagliga för celldöd efter partikelskada. När man överväger skador till följd av bestrålning av AuNP-aggregat är det dessutom viktigt att notera att dessa skador kan vara allvarligare och mindre kontrollerbara. Detta beror på den betydande ökningen av plasmonisk uppvärmning, vilket kan skada en stor del av cellen. Som ett resultat av detta har sådana skador inte införlivats i ANXA5-ringanalysen.

Dessutom indikerar de preliminära resultaten att störningen av plasmamembranet med hjälp av termoplasmonik resulterar i förhöjda intracellulära Ca2+ -nivåer. Detta observerades även vid lågintensiv bestrålning av enstaka AuNPs, vilket tyder på PM-permeabilisering35, som visas i figur 4. Ca2+ -inflödet observerades i celler som uttryckte en membranbunden kalciumsond, GCaMP6s-CAAX, som genomgår en konformationsförändring vid Ca2+ -inflöde, och därmed kan en ökning av dess intensitet observeras64. Kalciumintensiteten kvantifierades för hela cellens fotavtryck över tid. För att eliminera bakgrundsbrus subtraherades bakgrundsnivån Ca2+ före membranstörningar och reparation efter membranreparation. Den maximala intensiteten bestämdes genom att normalisera den genomsnittliga Ca2+ -intensiteten i cellen, vilket resulterade i en intensitetskurva som uppvisade en snabb initial ökning av Ca2+ -intensiteten följt av en långsammare minskning, som visas i figur 4B.

Cellen nådde en maximal kalciumintensitet på ~ 6,6 s, vilket överensstämmer med resultaten från Klenow et al.64, som föreslog att tiden för kalciumintensitetstoppen (t = tc) motsvarar den tid som krävs för sårförslutning. Även om ytterligare undersökningar krävs för att fastställa den underliggande mekanismen för membranreparation och sårläkning, visade de preliminära resultaten att denna Ca2+ -process observerades uteslutande i den skadade cellen och inte i den oskadade cellen som användes som en positiv kontroll. Detta bekräftar att cellen upplevde Ca2+ -inflöde vid termoplasmonisk membranstörning, där överskottet av intracellulärt kalcium aktivt pumpas ut efter framgångsrik PMR eftersom den intracellulära kalciumnivån inte längre konkurrerar med Ca2+ -inflödet, vilket så småningom uppnår cellhomeostatis64.

Figure 4
Figur 4: Kalciuminflöde uppstår när plasmamembranet i en HEK293T cell spricker av termoplasmonik. En serie konfokala bilder visar två celler (cellen av intresse och en oskadad cell som används som positiv kontroll) som uttrycker den membranbundna kalciumsonden, GCaMP6s-CAAX. Skalstången mäter 10 μm. (A) Före bestrålningen, kl. 00:00 s, visualiseras de två cellernas fotavtryck med den grå streckade linjen, och bestrålningsstället betecknas med den gula cirkeln. Vid laserbestrålning observeras ett snabbt inflöde av Ca2+ som når maximal intensitet vid ~ 6,6 s, betecknat med den orange streckade linjen, en tidpunkt som antas motsvara tidpunkten för sårförslutning64. (B) Kalciumintensitetsprofilen som erhölls från GCaMP6s-CAAX-sonden i den skadade cellen (blå linje) jämfördes med Ca2+ -intensiteten i en intilliggande oskadad cell (grå streckad linje), som visade ett tydligt Ca2+ -inflöde uteslutande vid PM-störning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Studien lyfter fram det termoplasmoniska tillvägagångssättet som en lovande teknik för att utforska proteinsvar i levande celler och modellmembran efter membranstörningar. Denna metod ger inte bara omfattande information om proteinrekrytering utan också om den biofysiska funktionen hos proteiner som är involverade i protein-membrandynamik. Följaktligen underlättar det identifieringen av molekylära komponenter som är ansvariga för ytreparation och ökar förståelsen för det komplexa men ändå viktiga maskineriet för reparation av plasmamembran. Även om det finns olika metoder för att inducera membranstörningar, såsom mekaniska, kemiska och optiska tekniker, lider dessa metoder av begränsningar, såsom att de är ospecifika för celler, genererar flera skador på cellmembranet eller orsakar betydande skador på membranet och ablaterar internt cellulärt material längs laservägen när man använder pulserande lasrar med hög effekt. Integreringen av konfokalmikroskopi och optisk pincett ger den mest omfattande informationen, men alternativa avbildningsmetoder kan också användas. Till exempel, eftersom avbildningen av den plasmoniska nanopartikeln uppnås med hjälp av reflektionsmikroskopi, kan ett inbyggt avbildningsläge i Leicas konfokalmikroskop, ytterligare avbildningstekniker, såsom mörkfältsmikroskopi65,66, andra spridningsmetoder som iSCAT67,68 eller fluorescerande märkning av nanopartikeln, användas för AuNP-visualisering, även om detta kan begränsa metodens tillämplighet.

Den presenterade metoden är dessutom kapabel att inducera nanoskopiska hål i modellmembran, vilket möjliggör undersökning av synergieffekterna mellan olika annexiner. Detta uppnås genom inkapsling av olika märkta rekombinanta annexiner, t.ex. RFP respektive GFP, följt av termoplasmonisk punktion. Detta modellsystem ger insikt i hur annexiner interagerar med membran i närheten av fria kanter, vilket visas i figur 2D. Men till skillnad från i celler fortsätter hålen som tillfogas GUV:er att expandera, följt av destabilisering av vesikeln. Att avbilda hålets utveckling med hjälp av konfokalmikroskopi kan vara utmanande på grund av den snabba expansionen av håldiametern, men kan åstadkommas genom att fånga flera z-stackar över tid. En alternativ metod skulle vara att använda en konfokal med snurrande skiva för snabbare avbildning. Dessutom ger den termoplasmoniska metoden vanligtvis ett begränsat antal optimala resultat per timme när den tillämpas på enskilda celler eller GUV-experiment, vanligtvis två till tre, vid provtemperaturer mellan 20 °C och 30 °C. För att få den mest exakta observationen av protein-membrandynamiken rekommenderas att hålla cellerna i en HEPES-innehållande buffert och byta ut provet varje timme. Alternativt kan försöksfönstret förlängas genom att experimenten utförs i en cellinkubationskammare, dvs. vid en konstant temperatur på 37 °C med 5 % CO2 . Att kombinera detta tillvägagångssätt med andra avbildningstekniker, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), kan ge en djupare förståelse för den biofysiska funktionen och interaktionen mellan nyckelproteiner som är involverade i membranreparation på en enda molekylnivå. Detta skulle kunna ge detaljerad information om skadestället, inklusive sårgeometrin och placeringen av annexinproteiner, samt identifiera andra nyckelaktörer som är involverade i reparationen av membranytan.

För att uppnå maximal effektivitet och precision när det gäller att inducera membranskada är det absolut nödvändigt att verifiera laserfokusets placering före varje experiment och se till att laserfokusets axiella position sammanfaller med det konfokala fokuset. Denna inriktning optimerar intensiteten under AuNP-avbildning, vilket leder till en maximal lokal temperaturökning och därmed membranskada vid lägre lasereffekt. Denna process utförs manuellt och är därför känslig för variabilitet i membranbrotteffektivitet eftersom fokus manuellt översätts till en position som sammanfaller med partikelns plats. I mikroskop som saknar reflektionsläge, som i vissa kommersiella system, kan samlokalisering av laserfokus och partiklar vara utmanande. I sådana fall kan alternativa avbildningslägen (t.ex. ljusfält) användas, och en långsam rasterskanning kan utföras runt den förväntade partikelpositionen. Det bör noteras att låg lasereffekt sannolikt endast inducerar membranpermeabilisering, medan hög lasereffekt kan generera temperaturer runt NP som överstiger vattnets kokpunkt, även om glasytan har en kylande effekt. Det uppskattas att bildandet av nanobubblor som omger NP sker mellan 200 °C och 300 °C25,48, där den explosiva värmen kan resultera i antingen partikelförskjutning från laserfokus eller partikelfragmentering. Dessutom utgör bildandet av nano- eller mikrobubblor under uppvärmning en utmaning för denna metod. Eftersom luftgränssnitt avvätar membran och kan orsaka proteindestabilisering, vilket är oönskat, är det absolut nödvändigt att begränsa uppvärmningen när man undersöker membranreparation. Noterbart är att guldnanoskal inte tål höga temperaturer och kommer att brytas ned under dessa förhållanden, vilket demonstreras av högupplöst mikroskopi58.

Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för att använda termoplasmonik för att utföra mycket lokaliserade punkteringar i membran, vilket är tillämpligt på både celler och modellmembran. För att ytterligare minska uppvärmningen kan mindre nanopartiklar som resonerar med NIR-ljus användas, vilket möjliggör intracellulära punkteringar i endosomer, det endoplasmatiska nätverket och kärnhöljet. Sådana nanopartiklar, inklusive stavar och nanomatrjosjkor48, kan användas för att undersöka reparation av kärnhöljet genom att rikta in sig på endocytoserade guldnanopartiklar som lätt tas upp vid cellytan och transporteras mot kärnan69. Sammantaget möjliggör denna teknik identifiering och undersökning av viktiga molekylära komponenter som är involverade i PMR, vilket belyser deras biofysiska funktion och roll samtidigt som cellernas livskraft bevaras.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Jesper Nylandsted för att han försett oss med rekombinanta annexinproteiner och plasmider som kodar för annexiner. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Danish Council for Independent Research, Natural Sciences (DFF-4181-00196), av Novo Nordisk Foundation Interdisciplinary Synergy Program 2018 (NNF18OC0034936), Scientific Committee Danish Cancer Society (R90-A5847-14-S2), Lundbeck Foundation (R218-2016-534) och av Lundbeck Foundation Center of Excellence (Biomembranes in Nanomedicine).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1064 nm trapping laser Spectra Physics N/A Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold Nanoshells NanoComposix NCXGSIR150
200 nm Gold Nanoparticles BBI Solutions EM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwell MATTEK P35G-1.5-14-C
Amber-glass vials Supelco Sigma Aldrich 243438
Annexin A2 plasmids N/A N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein  N/A N/A N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-casein Sigma Life Science C6905-1G
CaCl2 Suprlco (sigma Aldrich) 10035-04-8
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702
Chloroform VWR Chemicals 67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface) Thermo scientific 150460
DID cell-labelling Solution Invitrogen  7757
Distilled water Gibco 15230-089
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Dissolved in chloroform 
DOPS Avanti Polar Lipids 840035C Dissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's Medium Thermo Fisher Scientific 11995065
FIJI ImageJ distribution ImageJ2 N/A
GCaMP6s-CAAX N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 11573397 10% of the culture medium
Glucose PROLABO 24 374.297
Hamilton syringes Hamilton Company N/A 50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 Harrick Plasma N/A
HEK293T cells N/A Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) Leica N/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 Leica N/A
Leica SP5 confocal scanning microscope Leica N/A
Lipofectamine Fisher Scientific 15338030
MatLab The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States N/A
NaCl VWR Chemicals 7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum Medium Thermo Fisher Scientific 11058021
Parafilm Bemis PM-992
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 1% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20)  Physik Instrumente (Germany) N/A
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920-100ML 0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich 363065-25G
round glass slide 25 mm Ø VWR 631-1584
Sonicator Brandson 2800 Brandson N/A
sucrose Sigma Life Science 57-50-1
T25 tissue culture flask Falcon 353108 Blue Vented cap
Tris-HCl Invitrogen  15567-027
TrypLE Thermo Fisher Scientific A1285901
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 11590626
 VWR Mixer mini vortex 230V EU VWR  12620-84  ECN: 444-2790, SN: 150713022

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendix, P. M., et al. Interdisciplinary synergy to reveal mechanisms of annexin-mediated plasma membrane shaping and repair. Cells. 9 (4), 1029 (2020).
  2. Gajic, O., Lee, J., Doerr, C. H., Berrios, J. C., Myers, J. L., Hubmayr, R. D. Ventilator-induced Cell Wounding and Repair in the Intact Lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 1057-1063 (2003).
  3. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. The American Journal of Pathology. 140 (5), 1097-1109 (1992).
  4. Yu, Q. C., McNeil, P. L. Transient disruptions of aortic endothelial cell plasma membranes. The American Journal of Pathology. 141 (6), 1349-1360 (1992).
  5. Boye, T. L., et al. Annexin A4 and A6 induce membrane curvature and constriction during cell membrane repair. Nature Communications. 8, 1623 (2017).
  6. Bischofberger, M., Gonzalez, M. R., van der Goot, F. G. Membrane injury by pore-forming proteins. Current Opinion in Cell Biology. 21, 589-595 (2009).
  7. Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells. Science (New York, N.Y.). 356, 1022-1025 (2017).
  8. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair: Dealing with life's little traumas. Bioarchitecture. 1, 114-121 (2011).
  9. Sønder, S. L., et al. Annexin A7 is required for ESCRT III-mediated plasma membrane repair. Scientific Reports. 9, 6726 (2019).
  10. Andrews, N. W., Almeida, P. E., Corrotte, M. Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 24 (12), 734-742 (2014).
  11. Idone, V., Tam, C., Goss, J. W., Toomre, D., Pypaert, M., Andrews, N. W. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. The Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  12. Lauritzen, S. P., Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins are instrumental for efficient plasma membrane repair in cancer cells. Seminars in Cell & Developmental Biology. 45, 32-38 (2015).
  13. Häger, S. C., Nylandsted, J. Annexins: players of single cell wound healing and regeneration. Communicative & Integrative Biology. 12 (1), 162-165 (2019).
  14. Jaiswal, J. K., et al. S100A11 is required for efficient plasma membrane repair and survival of invasive cancer cells. Nature Communications. 5, 3795 (2014).
  15. Draeger, A., Monastyrskaya, K., Babiychuk, E. B. Plasma membrane repair and cellular damage control: The annexin survival kit. Biochemical Pharmacology. 81 (6), 703-712 (2011).
  16. Moreno-Pescador, G. S., et al. Thermoplasmonic nano-rupture of cells reveals annexin V function in plasma membrane repair. Nanoscale. 14 (21), 7778-7787 (2022).
  17. Zhivotovsky, B., Orrenius, S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective from the cell death community. Cell Calcium. 50 (3), 211-221 (2011).
  18. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: From structure to function. Physiological Reviews. 82 (2), 331-371 (2002).
  19. Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. Two-way traffic on the road to plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 18 (11), 552-559 (2008).
  20. Boye, T. L., et al. Annexins induce curvature on free-edge membranes displaying distinct morphologies. Scientific Reports. 8, 10309 (2018).
  21. Bouter, A., et al. Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair. Nature Communications. 2, 270 (2011).
  22. Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins in plasma membrane repair. Biological Chemistry. 397 (10), 961-969 (2016).
  23. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  24. Numata, T., Tatsuta, H., Morita, Y., Otani, Y., Umeda, N. Localized thermal processing with a laser-trapped and heated metal nanoparticle. IEEJ Transactions on Electrical and Electronic Engineering. 2, 398-401 (2007).
  25. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  26. Kyrsting, A., Bendix, P. M., Stamou, D. G., Oddershede, L. B. Heat profiling of three-dimensionally optically trapped gold nanoparticles using vesicle cargo release. Nano Letters. 11 (2), 888-892 (2011).
  27. Andersen, T., Kyrsting, A., Bendix, P. M. Local and transient permeation events are associated with local melting of giant liposomes. Soft Matter. 10 (24), 4268-4274 (2014).
  28. Bahadori, A., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Hot-nanoparticle-mediated fusion of selected cells. Nano Research. 10, 2034-2045 (2017).
  29. Rørvig-Lund, A., Bahadori, A., Semsey, S., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Vesicle fusion triggered by optically heated gold nanoparticles. Nano Letters. 15 (6), 4183-4188 (2015).
  30. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Ruhoff, V. T., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic vesicle fusion reveals membrane phase segregation of influenza spike proteins. Nano Letters. 23 (8), 3377-3384 (2023).
  31. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. SPIE Proceedings. SPIE 9922, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 992211, (2016).
  32. Bahadori, A., Moreno-Pescador, G., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Remotely controlled fusion of selected vesicles and living cells: a key issue review. Reports on Progress in Physics. 81 (3), 32602 (2018).
  33. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic induced vesicle fusion for investigating membrane protein phase affinity. bioRxiv. , (2022).
  34. Pescador, G. S. M., et al. Investigating plasma-membrane repair employing thermoplasmonics. Biophysical Journal. 120 (3), 45A (2021).
  35. Moreno-Pescador, G. S., Qoqaj, I., Thusgaard Ruhoff, V., Iversen, J., Nylandsted, J., Bendix, P. M. Effect of local thermoplasmonic heating on biological membranes. SPIE 11083, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XVI. 110830M, (2019).
  36. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current Biology. 9 (11), 579-587 (1999).
  37. Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 4 (139), 139ra85 (2012).
  38. Sudji, I. R., Subburaj, Y., Frenkel, N., García-Sáez, A. J., Wink, M. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 20 (11), 20146-20160 (2015).
  39. Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Intracellular Ca2+ operates a switch between repair and lysis of streptolysin O-perforated cells. Cell Death & Differentiation. 16, 1126-1134 (2009).
  40. Nygård Skalman, L., Holst, M. R., Larsson, E., Lundmark, R. Plasma membrane damage caused by listeriolysin O is not repaired through endocytosis of the membrane pore. Biology Open. 7 (10), bio035287 (2018).
  41. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6004-6009 (2014).
  42. Yeheskely-Hayon, D., Minai, L., Golan, L., Dann, E. J., Yelin, D. Optically induced cell fusion using bispecific nanoparticles. Small. 9 (22), 3771-3777 (2013).
  43. Minai, L., Yeheskely-Hayon, D., Golan, L., Bisker, G., Dann, E. J., Yelin, D. Optical nanomanipulations of malignant cells: Controlled cell damage and fusion. Small. 8 (11), 1732-1739 (2012).
  44. Lukianova-Hleb, E., et al. Plasmonic nanobubbles as transient vapor nanobubbles generated around plasmonic nanoparticles. ACS Nano. 4 (4), 2109-2123 (2010).
  45. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81, 1015-1047 (2005).
  46. Baffou, G., Polleux, J., Rigneault, H., Monneret, S. Super-heating and micro-bubble generation around plasmonic nanoparticles under cw illumination. Journal of Physical Chemistry C. 118 (9), 4890-4898 (2014).
  47. Sasikumar, K., Liang, Z., Cahill, D. G., Keblinski, P. Curvature induced phase stability of an intensely heated liquid. Journal of Chemical Physics. 140 (23), 234506 (2014).
  48. Jauffred, L., Samadi, A., Klingberg, H., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Plasmonic heating of nanostructures. Chemical Reviews. 119 (13), 8087-8130 (2019).
  49. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  50. Bendix, P. M., Jauffred, L., Norregaard, K., Oddershede, L. B. Optical trapping of nanoparticles and quantum dots. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 20, 15-26 (2014).
  51. Samadi, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Optical manipulation of individual strongly absorbing platinum nanoparticles. Nanoscale. 46, 18449-18455 (2017).
  52. Jørgensen, J. T., Norregaard, K., Tian, P., Bendix, P. M., Kjaer, A., Oddershede, L. B. Single particle and PET-based platform for identifying optimal plasmonic nano-heaters for photothermal cancer therapy. Scientific Reports. 6, 30076 (2016).
  53. Goldenberg, H., Tranter, C. J. Heat flow in an infinite medium heated by a sphere. British Journal of Applied Physics. 3 (9), 296-298 (1952).
  54. Eustis, S., El-Sayed, M. A. Why gold nanoparticles are more precious than pretty gold: Noble metal surface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Society Reviews. 35, 209-217 (2006).
  55. Landau, L. D., Lifshitz, E. M. Fluid Mechanics: Landau and Lifshitz: Course of Theoretical Physics. 6, Elsevier. (2013).
  56. Niederauer, C., Seynen, M., Zomerdijk, J., Kamp, M., Ganzinger, K. A. The K2: Open-source simultaneous triple-color TIRF microscope for live-cell and single-molecule imaging. HardwareX. 13, e00404 (2023).
  57. Richardson, A. C., Reihani, N., Oddershede, L. B. Combining confocal microscopy with precise force-scope optical tweezers. SPIE Proceedings:SPIE 6326, Optical Trapping and Optical Micromanipulation III. 632628, (2006).
  58. Samadi, A., Klingberg, H., Jauffred, L., Kjær, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Platinum nanoparticles: a non-toxic, effective and thermally stable alternative plasmonic material for cancer therapy and bioengineering. Nanoscale. 10 (19), 9097-9107 (2018).
  59. ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber for microscopy. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A7816 (2023).
  60. Kreibig, U., Vollmer, M. Theoretical considerations. In: Optical Properties of Metal Clusters. 25, Springer, Berlin, Heidelberg. (1995).
  61. Mie, G. Beiträge zur Optik trüber Medien, speziell kolloidaler Metallösungen. Annalen der Physik. 330 (3), 377-445 (1908).
  62. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  63. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  64. Klenow, M. B., Heitmann, A. S. B., Nylandsted, J., Simonsen, A. C. Timescale of hole closure during plasma membrane repair estimated by calcium imaging and numerical modeling. Scientific Reports. 11, 4226 (2021).
  65. Li, T., Wu, X., Liu, F., Li, N. Analytical methods based on the light-scattering of plasmonic nanoparticles at the single particle level with dark-field microscopy imaging. Analyst. 142 (2), 248-256 (2017).
  66. Gibbs-Flournoy, E. A., Bromberg, P. A., Hofer, T. P. J., Samet, J. M., Zucker, R. M. Darkfield-Confocal Microscopy detection of nanoscale particle internalization by human lung cells. Particle and Fibre Toxicology. 8 (1), 2 (2011).
  67. Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering microscopy: Seeing single nanoparticles and molecules via Rayleigh scattering. Nano Letters. 19 (8), 4827-4835 (2019).
  68. Wu, Y., Ali, M. R. K., Chen, K., Fang, N., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles in biological optical imaging. Nano Today. 24, 120-140 (2019).
  69. Klingberg, H., Oddershede, L. B., Loeschner, K., Larsen, E. H., Loft, S., Møller, P. Uptake of gold nanoparticles in primary human endothelial cells. Toxicology Research. 4 (3), 566-666 (2015).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 203 biofysik reparation av plasmamembran optisk pincett annexiner gigantiska unilamellära vesiklar termoplasmonik membranläckage
En termoplasmonisk metod för att undersöka reparation av plasmamembran i levande celler och modellmembran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., … More

Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., Moreno-Pescador, G., Bendix, P. M. A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes. J. Vis. Exp. (203), e65776, doi:10.3791/65776 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter