I Planta Genekspression og genredigering i Moso bambusblade

Summary

I denne undersøgelse blev en roman inden for planta-genekspression og genredigeringsmetode medieret af Agrobacterium udviklet i bambus. Denne metode forbedrede i høj grad effektiviteten af genfunktionsvalidering i bambus, hvilket har betydelige konsekvenser for at fremskynde processen med bambusavl.

Abstract

En ny planta gentransformationsmetode blev udviklet til bambus, som undgår behovet for tidskrævende og arbejdskrævende callus induktions- og regenereringsprocesser. Denne metode involverer Agrobacterium-medieret genekspression via sår og vakuum til bambusplanter. Det demonstrerede med succes ekspressionen af eksogene gener, såsom RUBY-reporteren og Cas9-genet, i bambusblade. Den højeste transformationseffektivitet til akkumulering af betalain i RUBY-frøplanter blev opnået ved anvendelse af GV3101-stammen med en procentdel på 85,2% efter infektion. Selvom det fremmede DNA ikke blev integreret i bambusgenomet, var metoden effektiv til at udtrykke de eksogene gener. Desuden er der også udviklet et genredigeringssystem med en indfødt reporter ved hjælp af denne metode, hvorfra en in situ-mutant genereret af det redigerede bambusviolaxanthin de-epoxidase-gen (PeVDE) i bambusblade med en mutationshastighed på 17,33%. Mutationen af PeVDE resulterede i reducerede ikke-fotokemiske slukningsværdier (NPQ) under højt lys, som kan detekteres nøjagtigt af et fluorometer. Dette gør den redigerede PeVDE til en potentiel indfødt reporter for både eksogene og endogene gener i bambus. Med reporteren fra PeVDE blev et cinnamoyl-CoA-reduktasegen med succes redigeret med en mutationshastighed på 8,3%. Denne operation undgår processen med vævskultur eller callusinduktion, hvilket er hurtigt og effektivt til at udtrykke eksogene gener og endogen genredigering i bambus. Denne metode kan forbedre effektiviteten af genfunktionsverifikation og vil hjælpe med at afsløre de molekylære mekanismer i vigtige metaboliske veje i bambus.

Introduction

Undersøgelsen af genfunktionen i bambus er meget lovende for den avancerede forståelse af bambus og frigør dets potentiale for genetisk modifikation. En effektiv måde at opnå dette på kan opnås gennem processen med Agrobacterium-medieret infektion i bambusblade, hvorved T-DNA-fragmentet indeholdende eksogene gener indføres i cellerne, hvilket efterfølgende fører til ekspression af generne i bladcellerne.

Bambus er en værdifuld og vedvarende ressource med en bred vifte af anvendelser inden for fremstilling, kunst og forskning. Bambus besidder fremragende træegenskaber såsom høj mekanisk styrke, sejhed, moderat stivhed og fleksibilitet¹, som nu er meget udbredt i en række husholdnings- og industrielle forsyninger, herunder tandbørster, sugerør, knapper, engangsservice, underjordiske rørledninger og køletårnfyldstoffer til termisk elproduktion. Derfor spiller bambusavl en afgørende rolle i at opnå bambussorter med fremragende træegenskaber til erstatning af plast og reduktion af plastforbrug, beskyttelse af miljøet og håndtering af klimaændringer samt generering af betydelig økonomisk værdi.

Imidlertid står traditionel bambusavl over for udfordringer på grund af det lange vegetative vækststadium og usikre blomstringsperiode. Selvom molekylære avlsteknikker er blevet udviklet og anvendt til bambusavl, er processen med bambusgentransformation tidskrævende, arbejdskrævende og kompliceret på grund af callus-induktions- og regenereringsprocesserne 2,3,4,5. Stabil genetisk transformation kræver ofte Agrobacterium-medierede metoder, som involverer vævskulturprocesser såsom callus induktion og regenerering. Imidlertid har bambus en lav evne til regenerering af hård hud, hvilket i høj grad begrænser anvendelsen af stabil genetisk transformation i bambus. Efter at Agrobacterium inficerer planteceller, kommer T-DNA-fragmentet ind i plantecellerne, hvor størstedelen af T-DNA-fragmenterne forbliver ikke-integrerede i cellerne, hvilket resulterer i forbigående ekspression. Kun en lille del af T-DNA-fragmenter integreres tilfældigt i dets kromosom, hvilket fører til stabilt udtryk. De forbigående ekspressionsniveauer viser en akkumuleringskurve, der kan variere for hvert gen udtrykt fra et Agrobacterium-leveret T-DNA. I de fleste tilfælde forekommer de højeste ekspressionsniveauer 3-4 dage efter infiltration og falder hurtigt efter 5-6 dage ^6,7. Tidligere undersøgelser har vist, at mere end 1/3 af mutationerne i genredigerede planter opnået uden selektionstryk for resistens kommer fra den forbigående ekspression af CRISPR/Cas9, mens de resterende mindre end 2/3 kommer fra stabil ekspression efter DNA-integration i genomet⁸. Dette indikerer, at T-DNA-integration i plantegenomet ikke er nødvendig for genredigering. Desuden hæmmer selektionstryk for resistens signifikant væksten af ikke-transgene celler, hvilket direkte påvirker regenereringsprocessen af inficerede eksplanter. Ved at bruge forbigående ekspression uden selektionstryk for resistens i bambus er det derfor muligt at opnå ikke-integreret ekspression af eksogene gener og studere genfunktion direkte i planteorganer. Derfor kan der udvikles en nem og tidsbesparende metode til eksogen genekspression og redigering i bambus⁹.

Den udviklede eksogene genekspressions- og genredigeringsmetode er kendetegnet ved sin enkelhed, omkostningseffektivitet og fraværet af dyrt udstyr eller komplekse procedurer⁹. I denne metode blev bambusendogent violaxanthin de-epoxidase-genet (PeVDE) brugt som reporter til eksogen genekspression uden selektionstryk. Dette skyldes, at den redigerede PeVDE i bambusblade reducerer fotobeskyttelsesevnen under højt lys og demonstrerer et fald i den ikke-fotokemiske slukningsværdi (NPQ), som kan detekteres gennem klorofylfluorescensbilleddannelse. For at demonstrere effektiviteten af denne metode blev et andet bambusendogent gen, cinnamoyl-CoA-reduktasegenet (PeCCR5)⁹, slået ud ved hjælp af dette system og genererede med succes mutanter af dette gen. Denne teknik kan bruges til funktionel karakterisering af gener, der har funktioner i bambusblade. Ved at overudtrykke disse gener forbigående i bambusblade kan deres ekspressionsniveauer forbedres, eller ved genredigering kan deres ekspression slås ned, hvilket giver mulighed for undersøgelse af nedstrøms genekspressionsniveauer, bladfænotyper og produktindhold. Dette giver en mere effektiv og gennemførlig tilgang til genfunktionsforskning i bambus. Denne teknik kan anvendes til funktionel karakterisering af gener, der fungerer i bambusblade. Ved at overudtrykke disse gener forbigående i bambusblade kan deres ekspressionsniveauer forbedres, eller ved genredigering kan deres ekspression slås ned, hvilket giver mulighed for undersøgelse af nedstrøms genekspressionsniveauer, bladfænotyper og produktindhold. Derudover er det vigtigt at bemærke, at på grund af omfattende polyploidisering er størstedelen af kommercielt vigtige gener i bambusgenomer til stede i flere kopier, hvilket resulterer i genetisk redundans. Dette udgør en udfordring for at udføre multiplex genomredigering i bambus. Før anvendelsen af stabil genetisk transformation eller genredigeringsteknikker er det afgørende hurtigt at validere genfunktioner. Ved behandling af spørgsmålet om flere genkopier er en tilgang at analysere transkriptomekspressionsprofiler for at identificere gener, der aktivt udtrykkes i bestemte faser. Desuden giver målretning mod de bevarede funktionelle domæner af disse genkopier mulighed for design af fælles målsekvenser eller inkorporering af flere målsteder i den samme CRISPR / Cas9-vektor, hvilket muliggør samtidig knockout af disse gener. Dette giver en mere effektiv og gennemførlig tilgang til genfunktionsforskning i bambus.

Protocol

1. Forberedelse af bambusplanter Forbered moso bambus (Phyllostachys edulis) frøplanter ved hjælp af frø høstet i Guilin, Guangxi, Kina. Begynd med at lægge frøene i blød i vand i 2-3 dage, og sørg for at skifte vand dagligt. Opret derefter et substrat ved at blande jord og vermikulit i et forhold på 3: 1. Så de gennemblødte frø i substratet til spiring. Vedligehold kimplanterne under laboratorieforhold, og hold temperaturen mellem 18-25 °C. Sørg for en 16 time…

Representative Results

Agrobacterium-medieret i planta genekspression i bambusbladeRUBY reporter-genet har vist sig at være effektivt til at visualisere forbigående genekspression på grund af dets evne til at producere levende rød betalain fra tyrosin10. I denne undersøgelse blev Agrobacterium-medieret transformation brugt til forbigående at udtrykke det eksogene RUBY-gen i bambusblade (figur 1). På de 3. dage</su…

Discussion

Denne metode reducerer signifikant den krævede tid sammenlignet med traditionelle genetiske transformationsmetoder, som typisk tager 1-2 år, og opnår forbigående ekspression af eksogene gener og genredigering af endogene gener inden for 5 dage. Denne metode har dog begrænsninger, da den kun kan omdanne en lille del af cellerne, og de genredigerede blade er kimære og mangler evnen til at regenerere til komplette planter. Ikke desto mindre giver dette i planta genekspression og genredigeringsteknologi en kra…

Materials

35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.