En Planta Expresión génica y edición génica en hojas de bambú Moso
Summary
En este estudio, se desarrolló en bambú un novedoso método de expresión génica y edición génica en planta mediado por Agrobacterium . Este método mejoró en gran medida la eficiencia de la validación de la función génica en el bambú, lo que tiene implicaciones significativas para acelerar el proceso de mejoramiento del bambú.
Abstract
Se desarrolló un novedoso método de transformación génica in planta para el bambú, que evita la necesidad de procesos de inducción y regeneración de callos que requieren mucho tiempo y mano de obra. Este método implica la expresión génica mediada por Agrobacterium a través de heridas y vacío para plántulas de bambú. Demostró con éxito la expresión de genes exógenos, como el reportero RUBY y el gen Cas9 , en hojas de bambú. La mayor eficiencia de transformación para la acumulación de betalaína en plántulas RUBY se logró utilizando la cepa GV3101, con un porcentaje de 85.2% después de la infección. Aunque el ADN extraño no se integró en el genoma del bambú, el método fue eficiente para expresar los genes exógenos. Además, también se ha desarrollado un sistema de edición génica con un reportero nativo utilizando este método, a partir del cual se ha desarrollado un mutante in situ generado por el gen editado de la violaxantina de-epoxidasa de bambú (PeVDE) en hojas de bambú, con una tasa de mutación del 17,33%. La mutación de PeVDE dio lugar a una disminución de los valores de enfriamiento no fotoquímico (NPQ) bajo alta luz, que puede detectarse con precisión con un fluorómetro. Esto convierte al PeVDE editado en un potencial reportero nativo para genes exógenos y endógenos en el bambú. Con el reportero de PeVDE, se editó con éxito un gen de cinamoil-CoA reductasa con una tasa de mutación del 8,3%. Esta operación evita el proceso de cultivo de tejidos o inducción de callos, que es rápido y eficiente para la expresión de genes exógenos y la edición de genes endógenos en el bambú. Este método puede mejorar la eficiencia de la verificación de la función génica y ayudará a revelar los mecanismos moleculares de las vías metabólicas clave en el bambú.
Introduction
La investigación de la función de los genes en el bambú es muy prometedora para la comprensión avanzada del bambú y para desbloquear su potencial de modificación genética. Una forma efectiva de esto se puede lograr a través del proceso de infección mediada por Agrobacterium en hojas de bambú, mediante el cual el fragmento de ADN-T que contiene genes exógenos se introduce en las células, lo que posteriormente conduce a la expresión de los genes dentro de las células de la hoja.
El bambú es un recurso valioso y renovable con una amplia gama de aplicaciones en la fabricación, el arte y la investigación. El bambú posee excelentes propiedades de madera, como alta resistencia mecánica, tenacidad, rigidez moderada y flexibilidad1, que ahora se usa ampliamente en una variedad de suministros domésticos e industriales, incluidos cepillos de dientes, pajitas, botones, vajillas desechables, tuberías subterráneas y rellenos de torres de enfriamiento para la generación de energía térmica. Por lo tanto, el cultivo de bambú juega un papel crucial en la obtención de variedades de bambú con excelentes propiedades de madera para reemplazar los plásticos y reducir el uso de plástico, proteger el medio ambiente y abordar el cambio climático, además de generar un valor económico significativo.
Sin embargo, la cría tradicional de bambú se enfrenta a desafíos debido a la larga etapa de crecimiento vegetativo y al incierto período de floración. Aunque se han desarrollado y aplicado técnicas de mejoramiento molecular al mejoramiento genético de bambú, el proceso de transformación del gen del bambú requiere mucho tiempo, mano de obra y es complicado debido a los procesos de inducción y regeneración de callos 2,3,4,5. La transformación genética estable a menudo requiere métodos mediados por Agrobacterium, que involucran procesos de cultivo de tejidos como la inducción y regeneración de callos. Sin embargo, el bambú tiene una baja capacidad para la regeneración de callos, lo que limita en gran medida la aplicación de la transformación genética estable en el bambú. Después de que Agrobacterium infecta las células vegetales, el fragmento de ADN-T ingresa a las células vegetales, y la mayoría de los fragmentos de ADN-T permanecen no integrados en las células, lo que resulta en una expresión transitoria. Solo una pequeña porción de fragmentos de ADN-T se integra aleatoriamente en su cromosoma, lo que conduce a una expresión estable. Los niveles de expresión transitoria muestran una curva de acumulación que puede variar para cada gen expresado a partir de un ADN-T entregado por Agrobacterium. En la mayoría de los casos, los niveles más altos de expresión ocurren 3-4 días después de la infiltración y disminuyen rápidamente después de 5-6 días 6,7. Estudios previos han demostrado que más de 1/3 de las mutaciones en plantas editadas genéticamente obtenidas sin presión de selección para resistencia provienen de la expresión transitoria de CRISPR/Cas9, mientras que las restantes menos de 2/3 provienen de la expresión estable después de la integración del ADN en el genoma8. Esto indica que la integración del ADN-T en el genoma de la planta no es necesaria para la edición de genes. Además, la presión de selección para la resistencia inhibe significativamente el crecimiento de células no transgénicas, lo que afecta directamente el proceso de regeneración de los explantes infectados. Por lo tanto, mediante el uso de la expresión transitoria sin presión de selección para la resistencia en el bambú, es posible lograr una expresión no integrada de genes exógenos y estudiar la función génica directamente en los órganos de la planta. Por lo tanto, se puede desarrollar un método fácil y que ahorra tiempo para la expresión y edición de genes exógenos en bambú9.
El método desarrollado de expresión génica exógena y edición génica se caracteriza por su simplicidad, rentabilidad y ausencia de equipos costosos o procedimientos complejos9. En este método, se utilizó el gen endógeno de la violaxantina deepoxidasa (PeVDE) del bambú como indicador de la expresión génica exógena sin presión de selección. Esto se debe a que el PeVDE editado en las hojas de bambú reduce la capacidad de fotoprotección bajo mucha luz y demuestra una disminución en el valor de enfriamiento no fotoquímico (NPQ), que se puede detectar a través de imágenes de fluorescencia de clorofila. Para demostrar la eficacia de este método, otro gen endógeno del bambú, el gen de la cinamoil-CoA reductasa (PeCCR5)9, fue eliminado utilizando este sistema y generó con éxito mutantes de este gen. Esta técnica se puede utilizar para la caracterización funcional de genes que tienen funciones en las hojas de bambú. Al sobreexpresar estos genes transitoriamente en las hojas de bambú, se pueden mejorar sus niveles de expresión o, mediante la edición de genes, se puede reducir su expresión, lo que permite el estudio de los niveles de expresión génica posteriores, los fenotipos de las hojas y el contenido del producto. Esto proporciona un enfoque más eficiente y factible para la investigación de la función génica en el bambú. Esta técnica se puede aplicar a la caracterización funcional de genes que funcionan en hojas de bambú. Al sobreexpresar estos genes transitoriamente en las hojas de bambú, se pueden mejorar sus niveles de expresión o, mediante la edición de genes, se puede reducir su expresión, lo que permite el estudio de los niveles de expresión génica posteriores, los fenotipos de las hojas y el contenido del producto. Además, es importante tener en cuenta que, debido a la extensa poliploidización, la mayoría de los genes comercialmente importantes en los genomas del bambú están presentes en múltiples copias, lo que resulta en redundancia genética. Esto plantea un desafío para realizar la edición multiplexada del genoma en bambú. Antes de la aplicación de técnicas de transformación genética estable o edición de genes, es crucial validar rápidamente las funciones de los genes. Al abordar el problema de las copias múltiples de genes, un enfoque es analizar los perfiles de expresión del transcriptoma para identificar los genes que se expresan activamente durante etapas específicas. Además, dirigirse a los dominios funcionales conservados de estas copias génicas permite el diseño de secuencias diana comunes o la incorporación de múltiples sitios diana en el mismo vector CRISPR/Cas9, lo que permite la eliminación simultánea de estos genes. Esto proporciona un enfoque más eficiente y factible para la investigación de la función génica en el bambú.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método reduce significativamente el tiempo requerido en comparación con los métodos tradicionales de transformación genética, que suelen tardar entre 1 y 2 años, y logra la expresión transitoria de genes exógenos y la edición genética de genes endógenos en 5 días. Sin embargo, este método tiene limitaciones, ya que solo puede transformar una pequeña proporción de células, y las hojas editadas genéticamente son quiméricas y carecen de la capacidad de regenerarse en plantas completas. Sin embargo, es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Subvención No. 2021YFD2200502), a la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 31971736) por el apoyo financiero.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
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