في بلانتا التعبير الجيني وتحرير الجينات في أوراق الخيزران موسو
Summary
في هذه الدراسة ، تم تطوير رواية في التعبير الجيني للنباتات وطريقة تحرير الجينات بوساطة Agrobacterium في الخيزران. حسنت هذه الطريقة بشكل كبير من كفاءة التحقق من صحة وظيفة الجينات في الخيزران ، والتي لها آثار كبيرة على تسريع عملية تربية الخيزران.
Abstract
تم تطوير طريقة جديدة في تحويل الجينات النباتية للخيزران ، والتي تتجنب الحاجة إلى عمليات تحريض الكالس وتجديده التي تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة. تتضمن هذه الطريقة التعبير الجيني بوساطة Agrobacterium عن طريق الجرح والفراغ لشتلات الخيزران. لقد أظهر بنجاح التعبير عن الجينات الخارجية ، مثل مراسل RUBY وجين Cas9 ، في أوراق الخيزران. تم تحقيق أعلى كفاءة تحويل لتراكم البيتالين في شتلات الياقوت باستخدام سلالة GV3101 ، بنسبة 85.2٪ بعد الإصابة. على الرغم من أن الحمض النووي الأجنبي لم يندمج في جينوم الخيزران ، إلا أن الطريقة كانت فعالة في التعبير عن الجينات الخارجية. علاوة على ذلك ، تم أيضا تطوير نظام تحرير الجينات مع مراسل أصلي باستخدام هذه الطريقة ، والتي يتم من خلالها إنشاء طفرة في الموقع بواسطة جين de-epoxidase المحرر من الخيزران (PeVDE) في أوراق الخيزران ، بمعدل طفرة يبلغ 17.33٪. أدت طفرة PeVDE إلى انخفاض قيم التبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQ) تحت الضوء العالي ، والتي يمكن اكتشافها بدقة بواسطة مقياس الفلورومتر. هذا يجعل PeVDE المحرر مراسلا أصليا محتملا لكل من الجينات الخارجية والداخلية في الخيزران. مع مراسل PeVDE ، تم تحرير جين اختزال سينامويل-CoA بنجاح بمعدل طفرة 8.3٪. تتجنب هذه العملية عملية زراعة الأنسجة أو تحريض الكالس ، وهي سريعة وفعالة للتعبير عن الجينات الخارجية وتحرير الجينات الداخلية في الخيزران. يمكن لهذه الطريقة تحسين كفاءة التحقق من وظائف الجينات وستساعد في الكشف عن الآليات الجزيئية لمسارات التمثيل الغذائي الرئيسية في الخيزران.
Introduction
إن التحقيق في وظيفة الجينات في الخيزران يحمل وعدا كبيرا للفهم المتقدم للخيزران وإطلاق العنان لإمكاناته للتعديل الوراثي. يمكن تحقيق طريقة فعالة لذلك من خلال عملية العدوى بوساطة Agrobacterium في أوراق الخيزران ، حيث يتم إدخال جزء T-DNA الذي يحتوي على جينات خارجية في الخلايا ، مما يؤدي لاحقا إلى التعبير عن الجينات داخل خلايا الأوراق.
الخيزران هو مورد قيم ومتجدد مع مجموعة واسعة من التطبيقات في التصنيع والفن والبحث. يمتلك الخيزران خصائص خشبية ممتازة مثل القوة الميكانيكية العالية والمتانة والصلابة المعتدلة والمرونة1 ، والتي تستخدم الآن على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من اللوازم المنزلية والصناعية ، بما في ذلك فرش الأسنان والقش والأزرار وأدوات المائدة التي تستخدم لمرة واحدة وخطوط الأنابيب تحت الأرض وحشوات برج التبريد لتوليد الطاقة الحرارية. لذلك ، تلعب تربية الخيزران دورا حاسما في الحصول على أصناف الخيزران ذات الخصائص الخشبية الممتازة لاستبدال البلاستيك وتقليل استخدام البلاستيك ، وحماية البيئة ، ومعالجة تغير المناخ ، فضلا عن توليد قيمة اقتصادية كبيرة.
ومع ذلك ، فإن تربية الخيزران التقليدية تواجه تحديات بسبب مرحلة النمو الخضري الطويلة وفترة الإزهار غير المؤكدة. على الرغم من تطوير تقنيات التربية الجزيئية وتطبيقها على تربية الخيزران ، إلا أن عملية التحول الجيني للخيزران تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة ومعقدة بسبب عمليات تحريض الكالسوتجديده 2،3،4،5. غالبا ما يتطلب التحول الوراثي المستقر طرقا بوساطة Agrobacterium ، والتي تتضمن عمليات زراعة الأنسجة مثل تحريض الكالس وتجديده. ومع ذلك ، فإن الخيزران لديه قدرة منخفضة على تجديد الكالس ، مما يحد بشكل كبير من تطبيق التحول الجيني المستقر في الخيزران. بعد أن تصيب Agrobacterium الخلايا النباتية ، تدخل جزء T-DNA إلى الخلايا النباتية ، مع بقاء غالبية شظايا T-DNA غير مدمجة في الخلايا ، مما يؤدي إلى تعبير عابر. فقط جزء صغير من شظايا T-DNA يندمج بشكل عشوائي في كروموسومه ، مما يؤدي إلى تعبير مستقر. تظهر مستويات التعبير العابر منحنى تراكم يمكن أن يختلف لكل جين يتم التعبير عنه من الحمض النووي التائي الذي يتم تسليمه بواسطة Agrobacterium. في معظم الحالات ، تحدث أعلى مستويات التعبير بعد 3-4 أيام من التسلل وتنخفض بسرعة بعد 5-6 أيام 6,7. أظهرت الدراسات السابقة أن أكثر من 1/3rd من الطفرات في النباتات المحررة جينيا التي تم الحصول عليها دون ضغط اختيار للمقاومة تأتي من التعبير العابر ل CRISPR / Cas9 ، في حين أن الطفرات المتبقية أقل من 2/3rd تأتي من التعبير المستقر بعد دمج الحمض النووي في الجينوم8. يشير هذا إلى أن تكامل T-DNA في جينوم النبات ليس ضروريا لتحرير الجينات. علاوة على ذلك ، فإن ضغط الاختيار للمقاومة يمنع بشكل كبير نمو الخلايا غير المعدلة وراثيا ، مما يؤثر بشكل مباشر على عملية تجديد النباتات المصابة. لذلك ، باستخدام التعبير العابر دون ضغط اختيار للمقاومة في الخيزران ، من الممكن تحقيق تعبير غير متكامل للجينات الخارجية ودراسة وظيفة الجينات مباشرة في أعضاء النبات. وبالتالي ، يمكن تطوير طريقة سهلة وموفرة للوقت للتعبير الجيني الخارجي وتحريره في الخيزران9.
تتميز طريقة التعبير الجيني الخارجي وتحرير الجينات المطورة ببساطتها وفعاليتها من حيث التكلفة وعدم وجود معدات باهظة الثمن أو إجراءات معقدة9. في هذه الطريقة ، تم استخدام جين الفيولاكسانثين ديبوكسيديز الداخلي من الخيزران (PeVDE) كمراسل للتعبير الجيني الخارجي دون ضغط الاختيار. وذلك لأن PeVDE المحرر في أوراق الخيزران يقلل من قدرة الحماية الضوئية تحت الضوء العالي ويوضح انخفاضا في قيمة التبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQ) ، والتي يمكن اكتشافها من خلال التصوير الفلوري بالكلوروفيل. لإثبات فعالية هذه الطريقة ، تم التخلص من جين داخلي آخر من الخيزران ، وهو جين اختزال cinnamoyl-CoA (PeCCR5) 9 ، باستخدام هذا النظام ونجح في توليد طفرات من هذا الجين. يمكن استخدام هذه التقنية للتوصيف الوظيفي للجينات التي لها وظائف في أوراق الخيزران. من خلال الإفراط في التعبير عن هذه الجينات بشكل عابر في أوراق الخيزران ، يمكن تحسين مستويات تعبيرها ، أو عن طريق تحرير الجينات ، يمكن هدم تعبيرها ، مما يسمح بدراسة مستويات التعبير الجيني في اتجاه مجرى النهر ، والأنماط الظاهرية للأوراق ، ومحتويات المنتج. وهذا يوفر نهجا أكثر كفاءة وجدوى لأبحاث وظائف الجينات في الخيزران. يمكن تطبيق هذه التقنية على التوصيف الوظيفي للجينات التي تعمل في أوراق الخيزران. من خلال الإفراط في التعبير عن هذه الجينات بشكل عابر في أوراق الخيزران ، يمكن تحسين مستويات تعبيرها ، أو عن طريق تحرير الجينات ، يمكن هدم تعبيرها ، مما يسمح بدراسة مستويات التعبير الجيني في اتجاه مجرى النهر ، والأنماط الظاهرية للأوراق ، ومحتويات المنتج. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة أنه بسبب تعدد الصبغيات على نطاق واسع ، فإن غالبية الجينات المهمة تجاريا في جينومات الخيزران موجودة في نسخ متعددة ، مما يؤدي إلى التكرار الجيني. هذا يشكل تحديا لإجراء تحرير الجينوم المتعدد في الخيزران. قبل تطبيق التحول الجيني المستقر أو تقنيات تحرير الجينات ، من الأهمية بمكان التحقق بسرعة من وظائف الجينات. في معالجة مسألة النسخ الجينية المتعددة ، يتمثل أحد الأساليب في تحليل ملفات تعريف تعبير النسخ لتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بنشاط خلال مراحل محددة. علاوة على ذلك ، فإن استهداف المجالات الوظيفية المحفوظة لهذه النسخ الجينية يسمح بتصميم تسلسلات مستهدفة مشتركة أو دمج مواقع مستهدفة متعددة في نفس ناقل CRISPR / Cas9 ، مما يتيح الضربة القاضية المتزامنة لهذه الجينات. وهذا يوفر نهجا أكثر كفاءة وجدوى لأبحاث وظائف الجينات في الخيزران.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقلل هذه الطريقة بشكل كبير من الوقت المطلوب مقارنة بطرق التحول الجيني التقليدية ، والتي تستغرق عادة 1-2 سنوات ، وتحقق تعبيرا عابرا عن الجينات الخارجية وتحرير الجينات للجينات الداخلية في غضون 5 أيام. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود لأنها لا يمكنها تحويل سوى نسبة صغيرة من الخلايا ، والأورا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (المنحة رقم 2021YFD2200502) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31971736) على الدعم المالي.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. . World Bamboo and Rattan (in Chinese). , (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
