استكشاف خيارات تاريخ الحياة: استخدام درجة الحرارة ونوع الركيزة كعوامل متفاعلة لتفضيلات يرقات الذبابة والإناث

Summary

هنا ، تم تفصيل بروتوكولين لتقييم مصدر الغذاء وتفضيلات وضع البيض في يرقات وإناث الذباب. وتشمل هذه أربعة خيارات مع عاملين متفاعلين: نوع الركيزة ودرجة الحرارة. تمكن المقايسات من تحديد تفضيل مصدر الغذاء لليرقات وتفضيل موقع وضع البيض للإناث.

Abstract

يقدم الذباب المنتفخ (Diptera: Calliphoridae) مجموعة واسعة من أنماط حياة اليرقات ، والتي تصنف عادة على أنها تطفل ملزم ، وتطفل اختياري ، و sapro-necrophagy كاملة. تعتبر العديد من الأنواع الطفيلية ، الملزمة والاختيارية ، ذات أهمية صحية واقتصادية ، حيث يمكن أن تسبب يرقاتها الانقباضات (غزو اليرقات في الأنسجة الحية). ومع ذلك ، من الجدير بالذكر أن الأنثى البالغة تلعب دورا حاسما لأنها تختار موقع وضع البيض ، وبالتالي ، تحدد إلى حد كبير عادة التغذية والظروف التنموية لليرقات. في هذه الدراسة ، تم اقتراح بروتوكولين لاختبار تفضيل تغذية اليرقات وتفضيل موقع وضع البيض الأنثوي مع مراعاة عاملين متفاعلين: نوع ركيزة اللحم ودرجة الحرارة. سمحت الإعدادات المعروضة هنا باختبار يرقات Lucilia cuprina والإناث الجاذبة في اختبار من أربعة خيارات مع درجتي حرارة (33 ± 2 درجة مئوية و 25 ± 2 درجة مئوية) ونوعين من ركائز اللحوم (اللحوم الطازجة المكملة بالدم واللحوم الفاسدة البالغة من العمر 5 أيام). يمكن لليرقات أو الإناث الجاذبة أن تختار الحفر أو وضع بيضها ، على التوالي ، في أي مما يلي: اللحوم الفاسدة عند 25 درجة مئوية (محاكاة حالة الأنواع الميتة) ، واللحوم الطازجة المكملة بالدم عند 33 درجة مئوية (محاكاة حالة الأنواع الطفيلية) ، واثنين من الضوابط ، اللحوم الفاسدة عند 33 درجة مئوية ، أو اللحوم الطازجة المكملة بالدم عند 25 درجة مئوية. يتم تقييم التفضيل عن طريق حساب عدد اليرقات أو البيض الموضوعة في كل خيار لكل نسخة مكررة. سمحت مقارنة النتائج المرصودة بالتوزيع العشوائي بتقدير الدلالة الإحصائية للتفضيل. أشارت النتائج إلى أن يرقات L. cuprina لها تفضيل قوي للركيزة الفاسدة عند 25 درجة مئوية. على العكس من ذلك ، كان تفضيل موقع وضع البيض من قبل الإناث أكثر تنوعا بالنسبة لنوع اللحوم. يمكن تكييف هذه المنهجية لاختبار تفضيل أنواع الحشرات الأخرى ذات الحجم المماثل. يمكن أيضا استكشاف أسئلة أخرى باستخدام شروط بديلة.

Introduction

الذباب ، وخاصة المسكوكات كاليبرات (بما في ذلك الذباب ، الذباب المنزلي ، ذباب الروبوت وذباب اللحم وغيرها) ، يظهر مجموعة واسعة من أنماط الحياة ، بما في ذلك السلوكيات الطفيلية والميتة¹. عادة ما تسبب الأنواع الطفيلية الانقباضات ، وهي غزو الأنسجة الحية بواسطة اليرقات (اليرقات)². في عائلة Calliphoridae ، تعتبر كل من الأنواع الطفيلية الإلزامية والاختيارية آفات حيوانية رئيسية مسؤولة عن الخسائر الاقتصادية وسوء رعاية الحيوانات بسبب تفشي اليرقات²،^3،4،⁵،^6،7. الطفيليات الملزمة ، مثل الديدان الحلزونية في العالم الجديد والعالم القديم (Cochliomyia hominivorax و Chrysomyia bezziana ، على التوالي) ، هي إشكالية خاصة⁴،⁷،⁸،⁹،¹⁰ جنبا إلى جنب مع الطفيليات الاختيارية ، مثل ذباب الأغنام (Lucilia cuprina و Lucilia sericata)²،⁵،^{6 ، 7}. تتطور الأنواع غير الطفيلية ، بما في ذلك الأنواع sapro-necrophagous ، في المواد العضوية المتحللة والميتة وتوجد عادة في البيئات غير الصحية. يمكن استخدام نمط حياتهم غير الطفيلي بشكل صارم بنجاح لعلاج اليرقات ، والذي يستخدم يرقات الذباب لتنظيف جروح الأنسجة الميتة¹¹،^12،13. تستخدم الذباب أيضا في علم الطب الشرعي ، لأنها من بين الكائنات الحية الأولى التي تحدد موقع الجثث المتوفاة حديثا واستعمارها ، حيث تعمل اليرقات النامية كوسيلة لتقدير وقت الوفاة¹⁴.

كانت أنماط حياة الذبابة موضوع دراسات بحثية مختلفة (على سبيل المثال ، ¹⁵،16،¹⁷،¹⁸،¹⁹،^20،21) نظرا لأهميتها فيما يتعلق بالمصالح البشرية. يمكن أن يوفر فهم الآليات البيولوجية التي تحكم نمط حياة الأنواع رؤى قيمة حول تحسين الأساليب التي تهدف إلى مكافحة أنواع الآفات. علاوة على ذلك ، يوفر تنوع وتطور أنماط حياة الذبابة سياقا مثاليا لدراسة أصول وآليات السمات المعقدة (مثل التطفل). تطور التطفل بسبب تغذية الديدان على الأنسجة الحية بشكل مستقل عدة مرات داخل عائلة Calliphoridae^22,23. ومع ذلك ، لا يزال التاريخ التطوري لعادات تغذية الذباب غير معروف إلى حد كبير ، حيث تقتصر الدراسات على رسم خرائط للعادات على طول السلالات (على سبيل المثال ، ¹⁶،^19،22) دون مساعدة المقايسات الوظيفية. على سبيل المثال ، من غير المؤكد ما إذا كانت الطفيليات الملزمة قد تطورت من عامة الناس (أي الطفيليات الاختيارية) أو مباشرة من الأنواع الميتة. كما أن العمليات الجزيئية والفسيولوجية والسلوكية المصاحبة للتحولات التطورية في نمط الحياة غير معروفة إلى حد كبير.

في هذا السياق ، توفر الطفيليات الاختيارية ، مثل ذبابة الأغنام Lucilia cuprina ، التي يمكن أن تتطور كطفيليات على مضيف أو كجثث على الجثث إمكانية استكشاف العوامل والآليات التي تتحكم في خيارات نمط الحياة. Lucilia cuprina هو نوع عالمي معروف بالتسبب في ذبابة الأغنام ، خاصة في أستراليا حيث يعتبر آفة ^3,16. يمكن أن يحدث الانقباض الناتج عن L. cuprina أيضا في الماشية الأخرى والحيوانات الأليفة والبشر³،²⁴،25،26،27،²⁸،^29،30. ومع ذلك ، يمكن أن تتطور يرقاتها أيضا في الأنسجة الميتة والمواد المتحللة وقد تم استخدام هذا النوع بنجاح في علم الحشرات الشرعي لأنه سريع جدا لتحديد موقع الجثث واستعمارها³¹،³²،^33،34. على الرغم من أن نمط الحياة الطفيلية مقابل غير الطفيلية للذباب يتم تحديده من خلال مرحلة اليرقات ، إلا أن الأنثى البالغة هي التي تختار موقع وضع البيض. وبالتالي ، فإن الأنثى البالغة تؤثر بشدة على نمط حياة اليرقات ، حيث أن هذه الأخيرة لديها حركة محدودة. ومع ذلك ، فإن اختيار الأنثى لا يعني بالضرورة أن اليرقات تفضل نفس الركيزة عند تقديمها مع الخيار³⁵. إحدى الفرضيات هي أن التغييرات السلوكية التي تؤدي إلى وضع الإناث بيضها على الأنسجة الحية يمكن أن تكون جزءا من التحول المبكر نحو نمط حياة طفيلي. كانت التكيفات المسبقة أو القدرات الفسيولوجية لليرقات الناتجة ضرورية لتطورها الناجح على الأنسجة الحية ، مما أدى إلى ظهور نمط الحياة الطفيلية. على هذا النحو ، قد لا تتوافق العمليات المتأثرة والمختارة بالضرورة بين مرحلتي الحياة.

في هذا السياق ، تم تطوير طريقتين لاختبار التفضيل السلوكي في الذباب ، على وجه الخصوص ، ل L. cuprina ، فيما يتعلق بركيزة تغذية اليرقات (مقايسة تفضيل اليرقات) وموقع وضع البيض (مقايسة تفضيل الإناث). تأخذ هذه الطرق في الاعتبار عاملين متفاعلين: درجة الحرارة ونضارة اللحوم. تم اختيار درجة الحرارة كعامل حاسم لأن معظم حالات الانقباضات تحدث في الحيوانات المثلية^{الحرارة 2}. ومن ثم ، تم اختيار درجة حرارة 33 درجة مئوية كبديل ل "عامل نمط الحياة الطفيلية" ، في حين أن درجة حرارة 25 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) تمثل "العامل غير الطفيلي". تم اختيار درجة حرارة 25 درجة مئوية لأنها تمثل متوسط درجة الحرارة السنوية المسجلة في البرازيل (المعهد الوطني للأرصاد الجوية ، INMET). بالإضافة إلى ذلك ، تم النظر في نوعين من ركائز اللحوم ، كلاهما من مصادر بقري: (i) اللحوم الطازجة المكملة بالدم ، والتي تحاكي الركيزة لنمط الحياة الطفيلية ، والتي تستخدم لتربية الذبابة الطفيلية Co. hominivorax في ظروف المختبر³⁶ ، و (ii) اللحوم الفاسدة البالغة من العمر 5 أيام ، والتي تحاكي الركيزة لنمط الحياة الميتة. تستخدم الركيزة البقرية بشكل شائع لتربية L. cuprina في ظروف المختبر^27،37،^38،39 لأنها توفر العديد من المزايا من حيث التوافر والفعالية من حيث التكلفة والتطبيق العملي مع كونها ركيزة مبررة بيئيا. استخدمت دراسات أخرى^40,41 تقارن تأثير الركائز الفاسدة مقابل الركائز الطازجة في الذباب ركيزة فاسدة عمرها 7 أيام (في الظروف اللاهوائية) وأظهرت تأثيرا سلبيا للركيزة الفاسدة على معدلات النمو والبقاء والنمو. نظرا لأنه من المعروف أن L. cuprina تستعمر الجثث الطازجة التي تتعرض عادة للهواء ، فقد قررنا استخدام اللحوم الفاسدة البالغة من العمر 5 أيام (اللحم المفروم) في أواني غير محكمة الغلق (التحلل الهوائي واللاهوائي) لتقليد الركيزة الميتة.

توفر التصاميم التجريبية المعروضة هنا ميزة تمييز التفضيلات للعوامل الفردية بالإضافة إلى آثارها المشتركة. علاوة على ذلك ، فإن الأنماط الظاهرية المسجلة ، وهي اختيار ركيزة تغذية اليرقات وعدد البيض الموضوعة ، لها صلة مباشرة بالجوانب البيولوجية والبيئية لأنواع الذبابة. يتم تسليط الضوء على مدى ملاءمة هذه البروتوكولات من خلال إظهار فعاليتها في L. cuprina. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير برنامج نصي للتحليل الإحصائي ، والذي يمكن استخدامه لمقارنة النتائج المرصودة التي تم الحصول عليها في L. cuprina بمحاكاة البيانات العشوائية ، مما يضمن تحليلا وتفسيرات إحصائية قوية.

Protocol

تم الحصول على عينات الذباب باستخدام الفخاخ وليس على الحيوانات المصابة. تم إصدار ترخيص SISBIO (67867-1) لجمع وحفظ ذباب عائلة Calliphoridae في الأسر في ظروف المختبر. عينات الحشرات معفاة من التقييم الأخلاقي في البحث في البرازيل. تم الحصول على لحوم الأبقار ودمها تجاريا ، ولم تكن هناك حاجة إلى تصريح أخلاقي.

1. تفضيل تغذية اليرقات

1. تحضير أطباق بتري التي تحتوي على 2٪ أجار
   1. تحضير أربعة أطباق بتري مع 2 ٪ أجار. للقيام بذلك ، أضف 6 غرام من أجار البكتريولوجي إلى 300 مل من الماء وقم بإذابة هذا المزيج في الميكروويف. بعد ذلك ، قسم الحجم بالتساوي إلى أربعة أطباق زجاجية بتري (150 × 20 مم) ، باستخدام حوالي 70 مل في كل طبق.
      ملاحظة: قم بإعداد أطباق بتري مساوية لعدد النسخ التجريبية المطلوبة. في هذه الدراسة ، تم استخدام 36 مكررا.
   2. بمجرد أن يتجمد الآجار ، استخدم أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل (قطره 3 سم) لكمة أربعة ثقوب في الأجار ، اثنان على كل جانب من طبق بتري ، باتباع نمط القطع المقدم (الشكل 1).
      ملاحظة: يشبه هذا الإعداد البروتوكولات الموصوفة سابقا بواسطة Fouche et al. (2021) ⁴⁰ و Boulay et al. (2016) ⁴².
2. تحضير ركائز
   1. لتحضير اللحم الطازج بالدم ، أضف 12 مل من دم البقر المخفف إلى 200 غرام من اللحم المفروم الطازج. تخلط جيدا. تأكد من استخدام أسطوانات وملاعق متدرجة مختلفة لكل نوع من أنواع اللحوم لتجنب التلوث المتبادل بين الركائز.
      ملاحظة: يتكون الدم المخفف من 50٪ دم نقي ممزوج بمضاد للتخثر (3.8٪ سترات الصوديوم) و 50٪ ماء مصفى.
   2. لتحضير الركيزة الفاسدة ، أضف 12 مل من الماء المصفى إلى 200 غرام من اللحم المفروم الفاسد البالغ من العمر 5 أيام واخلطه جيدا.
      ملاحظة: تم الحصول على اللحوم الفاسدة عن طريق احتضان اللحم المفروم الطازج لمدة خمسة أيام عند 25 درجة مئوية في أواني بلاستيكية غير محكمة الغلق (مزيج من التحلل الهوائي وغير الهوائي). يحتوي كل وعاء على 200 غرام من اللحم المفروم الطازج. ثم تم تجميده حتى الاستخدام.
   3. املأ فتحتين في كل طبق بتري بمزيج اللحم الطازج والدم والفتحتين المتبقيتين بمزيج اللحم الفاسد والماء.
      ملاحظة: لتجنب تحيزات الموقف ، قم بتغيير موضع أنواع اللحوم المختلفة في أطباق بتري. على سبيل المثال ، يجب أن تحتوي بعض أطباق بتري على نفس النوع من اللحوم التي تواجه بعضها البعض ، بينما في الأطباق الأخرى ، يجب عبور نوع اللحم ، كما هو موضح في الشكل 2.
3. الإعداد التجريبي
   1. عند درجة حرارة الغرفة (RT) 25 درجة مئوية ، ضع وسادة التدفئة أسفل مصدر الضوء مباشرة لإضاءة المنطقة التجريبية بالتساوي وتجنب أي تحيز سلوكي تجاه الضوء أو ضده. ضع وسادات من الورق المقوى حول وسادة التدفئة لضمان بقاء الإعداد التجريبي مستويا.
      ملاحظة: كان مصدر الضوء المستخدم عبارة عن ضوء أبيض منخفض التسخين ينبعث منه ، مثل أنبوب نيون. تم وضع وسادة التدفئة على طاولة أسفل مصابيح السقف مباشرة (الشكل 3).
   2. قم بتغطية وسادة التدفئة ووسادات الورق المقوى المستوية بالكرتون الأسود وقم بتشغيل وسادة التدفئة.
      ملاحظة: يجب استخدام غطاء الورق المقوى الأسود لتجنب الإشارات المرئية التي قد تؤدي إلى تحيز فحص السلوك.
   3. ضع ستة أطباق بتري مع الآجار وركيزة اللحم فوق الورق المقوى الأسود مع ركيزتين ، واحدة من كل نوع ، على وسادة التدفئة والاثنان الآخران على سطح وسادة التدفئة (الشكل 2). دع الركائز تسخن لمدة 10 دقائق تقريبا.
      ملاحظة: قد يتشكل التكثيف على غطاء أطباق بتري.
4. اختبار اليرقات
   1. تحقق من درجة حرارة الركائز (الجانب البارد: 25 ± 2 درجة مئوية ؛ الجانب الساخن: 33 ± 2 درجة مئوية) باستخدام مقياس حرارة الأشعة تحت الحمراء.
      ملاحظة: تبقى وسادة التدفئة مضاءة طوال مدة التجربة. تم إجراء قياسات درجة الحرارة في بداية التجربة ونهايتها. على الرغم من أن درجة الحرارة تقلبت بمقدار ± 2 درجة مئوية ، إلا أنه لا يزال هناك فرق في درجة الحرارة يبلغ 8 درجات مئوية على الأقل بين الظروف الحارة والباردة.
   2. بعد الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ، ضع خمس يرقات ثالثة في وسط كل طبق بتري باستخدام ملاقط (الشكل 2) وقم بتغطية أطباق بتري بأغطية. دع تجربة الاختيار تستمر لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: قد تزحف بعض اليرقات حول الحواف وعلى غطاء أطباق بتري. إذا هربت أي يرقة ، استخدم ملقاطا لإعادتها إلى وسط طبق بتري.
   3. بعد 10 دقائق ، أخرج جميع أطباق بتري من وسادة التدفئة وضعها على سطح مختلف لتجنب الاستمرار في تسخين الركائز. ثم ، احسب عدد اليرقات في كل ركيزة ، وكذلك تلك التي لم تختر أي ركيزة.
      ملاحظة: تبقى يرقات Lucilia cuprina في الركيزة التي اختارتها ، كما لوحظ في هذه التجربة.

2. تفضيل موقع وضع البيض الإناث

1. الإعداد التجريبي
   1. استخدم رفا عاديا مغطى مسبقا بورق مقوى أسود ومضاء بالتساوي بشرائط إضاءة LED بيضاء.
      ملاحظة: يجب استخدام أغطية الورق المقوى الأسود لتجنب الإشارات المرئية التي قد تؤدي إلى تحيز فحص السلوك. يتم تثبيت شرائط LED البيضاء بالطول في منتصف الرف فوق التجربة مباشرة. تم وضع الأرفف المستخدمة في الإعداد على بعد 45 سم.
   2. عند RT (25 درجة مئوية) ، ضع وسادة تدفئة في وسط الرف. استخدم وسادات من الورق المقوى حول وسادة التدفئة كدعم لضمان تسوية الإعداد التجريبي.
   3. قم بتغطية وسادة التدفئة ووسادات الورق المقوى المستوية بورق مقوى أسود للحفاظ على نفس النمط المرئي أسفل جميع الركائز.
   4. ضع حاويتين من الزجاج المتقاطع على رف واحد ، يجب أن يكون لكل منهما ذراعان فوق الورق المقوى الأسود ووسادة التدفئة. قم بتشغيل شرائط الإضاءة LED البيضاء ومنصات التدفئة قبل بدء التجربة.
   5. استخدم 70٪ إيثانول لتنظيف الصلبان (داخل الصليب والغطاء) لتجنب تلوث الرائحة.
2. تحضير ركائز
   1. قم بإعداد أربعة أطباق بتري (60 مم × 15 مم) لكل صليب مع 5 غرام من اللحوم الفاسدة أو الطازجة البالغة من العمر 5 أيام (اثنان من كل نوع من الركيزة).
      ملاحظة: تحضير أطباق بتري يساوي عدد التكرارات التجريبية المطلوبة مضروبة في أربعة. في هذه الدراسة ، تم استخدام 30 نسخة مكررة ، بإجمالي 120 طبقا بتري معدا.
   2. أضف 1 مل من دم البقر المخفف (50٪ دم نقي مع مضادات التخثر و 50٪ ماء مصفى) على اللحم الطازج و 1 مل من الماء المصفى على اللحم الفاسد. اخلطي اللحم جيدا (طازجا أو فاسدا) مع السائل (الدم أو الماء) باستخدام ملعقة مختلفة لكل نوع من اللحوم.
      ملاحظة: إن تحضير اللحم لفحص الإناث يشبه إلى حد كبير فحص اليرقات ، على الرغم من اختلاف الكميات لأن اختبار الإناث سيستمر لفترة أطول من اختبار اليرقات. تذكر أن تستخدم أطراف وملاعق ماصة مختلفة لكل نوع من أنواع اللحوم لتجنب أي تلوث للرائحة بين الركائز.
   3. تحقق مما إذا كان الكحول قد تبخر تماما من الصلبان. بعد ذلك ، ضع أربعة أطباق بتري (واحد من كل نوع من اللحوم على وسادة التدفئة والاثنان الآخران على سطح وسادة التدفئة) في أقصى كل ذراع من الصليب (الشكل 4). أغلق الصلبان بأغطيتها واترك الركائز تسخن لمدة 10 دقائق تقريبا.
      ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك ، لتجنب تحيزات الموضع ، قم بتغيير موضع أنواع اللحوم المختلفة في الصلبان. على سبيل المثال، يجب أن تحتوي بعض الصلبان على النوع نفسه من اللحم على أذرع متجاورة، بينما في الصلبان الأخرى، يجب أن يكون نوع اللحم نفسه متقابلا مع بعض، كما هو موضح في الشكل 4.
3. اختبار الإناث
   1. جمع الإناث الجاذبة في قفص الذباب وعزلها في أنابيب فردية.
      ملاحظة: تتميز الإناث الجاذبة بوجود بطن متضخم وأصفر مائل للبياض على عكس الإناث غير الجاذبات (الشكل 5). تم جمع الإناث الجاذبة بين 10 و 16 يوما بعد ظهورها للتجارب.
   2. تحقق من درجة حرارة الركائز في الصلبان (الجانب البارد: 25 ± 2 درجة مئوية ؛ الجانب الساخن: 33 ± 2 درجة مئوية) باستخدام مقياس حرارة الأشعة تحت الحمراء.
      ملاحظة: تماما كما هو الحال في اختبار اليرقات ، تظل وسادة التسخين مضاءة طوال مدة التجربة. تم إجراء قياسات درجة الحرارة في بداية ونهاية التجربة. على الرغم من أن درجة الحرارة تقلبت بمقدار ± 2 درجة مئوية ، إلا أنه لا يزال هناك فرق في درجة الحرارة يبلغ 8 درجات مئوية على الأقل بين الظروف الحارة والباردة.
   3. ضع الأنبوب رأسا على عقب يحتوي على أنثى واحدة في الفتحة في وسط كل صليب. بعد دخول الأنثى الصليب ، قم بإزالة الأنبوب وأغلق الفتحة بغطاءها الصغير. بعد إغلاق جميع الصلبان ، ضع كرتونا أسود في مقدمة الرف لإحاطة الإعداد التجريبي. دع التجربة تستمر لمدة 4 ساعات.
   4. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنثى ، عن طريق اصطيادها بعناية باستخدام أنبوب ، وتحقق مما إذا كان هناك أي بيض على الركائز.
   5. حدد غطاء كل طبق بتري بنوع الركيزة من كل صليب. استخدم 70٪ إيثانول لتنظيف الصلبان (داخل الصليب والغطاء) من أي رائحة من الاختبار.
      ملاحظة: في حالة تعذر عد البيض بعد التجربة مباشرة ، يمكن تخزين أطباق بتري مع ركائز في -20 درجة مئوية.
4. عدد البيض
   ملاحظة: إذا تم تجميد الركائز الموجودة في أطباق بتري ، فقم بإذابتها قبل العد.
   1. استخدم مجهرا مجسما لحساب عدد البيض الموضوعة في كل ركيزة. استخدم فرشاة وماء للمساعدة في فصل البيض لعدها.

3. تحليل البيانات والإحصاءات

1. حساب مؤشرات التفضيلات
   1. لكل تكرار لليرقات (ن = 36) والإناث (ن = 30) ، احسب مؤشر التفضيل للحوم (المعينة_كلحوم PI) عن طريق تحديد نسبة اليرقات أو البيض الموجود على ركائز طازجة (طازجة ساخنة وباردة طازجة) إلى إجمالي عدد اليرقات أو البيض على جميع الركائز (طازج ساخن + بارد طازج + فاسد ساخن + بارد فاسد).
      _لحم PI = (# يرقات أو بيض على ركائز طازجة) / # إجمالي اليرقات أو البيض
      ملاحظة: يشير المصطلحان "ساخن" و "بارد" إلى ظروف درجة حرارة 33 ± 2 درجة مئوية و 25 ± 2 درجة مئوية على التوالي.
   2. وبالمثل ، احسب مؤشر التفضيل لدرجة الحرارة (PI_temp) لكل تكرار لاختبارات اليرقات والإناث كعدد اليرقات أو البيض الموجود على الركائز الساخنة ( الطازجة الساخنة والفاسدة الساخنة) مقسوما على إجمالي عدد اليرقات أو البيض على جميع الركائز (طازج ساخن + بارد طازج + فاسد ساخن + فاسد بارد).
      PI_temp = (# اليرقات أو البيض على ركائز ساخنة) / # إجمالي اليرقات أو البيض
      ملاحظة: تعكس القيم القريبة من 1 تفضيلا للركائز الطازجة أو الساخنة وتشير القيم القريبة من الصفر إلى تفضيل الركائز الفاسدة أو الباردة. يمكن حساب مؤشرات الأداء يدويا أو باستخدام الكود المقدم (الملفات التكميلية S1 والملفات التكميلية S2).
2. مقارنة التفضيل المرصود بالبيانات العشوائية المحاكاة
   1. قم بتشغيل الكود المقدم (الملف التكميلي S1 والملف التكميلي S1) لإنشاء البيانات المحاكاة ومقارنتها بالبيانات المرصودة.
      ملاحظة: يولد هذا الرمز 1000 مجموعة بيانات عشوائية محاكاة لليرقات والإناث ويحسب مؤشرات التفضيل (PIs) لكل نسخة مكررة من المحاكاة ، والبيانات المرصودة ل L. cuprina. تفترض عمليات المحاكاة أن كلا من اليرقات والإناث لا تظهر أي تفضيل للركيزة وتقوم باختيارات عشوائية. تتضمن عمليات المحاكاة الجوانب السلوكية الرئيسية للحيوانات ، وتشمل سيناريوهات مختلفة مثل: احتمال عدم اختيار اليرقات لأي ركيزة ، وتركيز الإناث البالغات على وضع البيض على ركيزة واحدة أو توزيع بيضها إما بشكل موحد أو لا بين ركائز مختلفة. تم استخدام النماذج الخطية المعممة (GLM ، العائلة: شبه ذات الحدين ؛ الرابط: logit) لمقارنة البيانات المرصودة من مقايسات السلوك مع البيانات العشوائية المحاكاة. كان GLM المستخدم مناسبا تماما لهذا التحليل نظرا للطبيعة المحدودة لمؤشر التفضيل (PI) ، والذي يتراوح بين 0 و 1. إن GLMs بارعة في التعامل مع متغيرات الاستجابة غير الموزعة بشكل طبيعي وتسمح بإجراء مقارنات إحصائية قوية. سهل هذا الاختيار رؤى ذات مغزى من خلال تمكين مقارنة البيانات المرصودة بشكل فعال من فحوصات السلوك مع الأنماط المعقدة الناتجة عن البيانات العشوائية المحاكاة. قد يلزم إجراء تعديلات طفيفة على الشفرة لمجموعات البيانات المنظمة الأخرى.

Representative Results

لإثبات فعالية الطرق المقدمة ، أجريت التجارب باستخدام مجموعة مختبرية من Lucilia cuprina (العائلة: Calliphoridae) ، وهي ذبابة طفيلية اختيارية². يمكن العثور على مجموعة البيانات الخام الكاملة التي تم الحصول عليها لهذا النوع في الملف التكميلي S3 مع نتائج اختبارات تفضيل اليرقات والركيزة الأنثوية. لتقييم ما إذا كانت اليرقات والإناث تظهر تفضيلا لأي ركيزة ، تمت مقارنة البيانات المرصودة ب 1000 مجموعة بيانات محاكاة ، كل منها يمثل اختيارا عشوائيا (انظر الكود في الملف التكميلي S1). واستخدمت النسبة المئوية للمقارنات ذات دلالة إحصائية (p < 0.05) كمقياس لتقييم الأفضلية. من هذا التحليل ، كان من الواضح أن اليرقات أظهرت تفضيلا ملحوظا للركيزة الفاسدة عند 25 درجة مئوية (الشكل 6 أ ، الجدول 1) حيث تم العثور على جميع المقارنات البالغ عددها 1000 بين البيانات المرصودة وكل من مجموعات بيانات الاختيار العشوائي المحاكية مختلفة بشكل كبير لظروف اللحوم ودرجة الحرارة. وبالمثل ، أظهرت الإناث أيضا تفضيلا ملحوظا ل 25 درجة مئوية: 69.7٪ من المقارنات بين البيانات المرصودة والاختيار العشوائي وجدت مختلفة بشكل كبير (الشكل 6 ب ، الجدول 1). ومع ذلك ، كان تفضيلهم للحوم الفاسدة أكثر دقة (الشكل 6 ب ، الجدول 1) حيث كانت 27.1٪ فقط من مقارنات الاختيار الملاحظ مقابل الاختيار العشوائي مهمة. ملاحظة أخرى من هذه الدراسة كانت أن يرقات L. cuprina عادة ما تتخذ خيارا سريعا وتحفر في ركيزة اللحم خلال أول 2 دقيقة من التجربة. نادرا ما تغيرت إلى حالة أخرى خلال تجربة 10 دقائق.

الشكل 1: نمط قطع تفضيل تغذية اليرقات لأطباق بتري مع أجار. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: مخطط العرض العلوي لتخطيط مقايسة تفضيل تغذية اليرقات. تم وضع الخيارات بشكل عشوائي ، وتم إجراء الاختبارات في RT (25 ± 2 درجة مئوية). يمثل المستطيل الأسود وسادة التسخين ، التي تحمل درجات حرارة عند 33 ± 2 درجة مئوية. تمثل الدوائر الحمراء والزرقاء اللحوم الطازجة المكملة بالدم المخفف (50٪) واللحوم الفاسدة المكملة بالماء ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: شكل يوضح كيفية وضع الإعداد التجريبي لليرقات أسفل مصدر الضوء لتجنب الانحياز نحو الضوء أو ضده. كان مصدر الضوء المستخدم هو الضوء الأبيض المنخفض التسخين الباعث (أنبوب النيون). تم وضع وسادة التدفئة على طاولة أسفل ضوء السقف مباشرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مخطط العرض العلوي لتخطيط مقايسة تفضيل موقع وضع البيض الأنثوي. تم وضع الخيارات بشكل عشوائي ، وتم إجراء الاختبارات في RT (25 ± 2 درجة مئوية). يمثل المستطيل الأسود وسادة التسخين التي تحمل درجة الحرارة عند 33 ± 2 درجة مئوية. تمثل الدوائر الحمراء اللحوم الطازجة ذات الدم المخفف (50٪) والدوائر الزرقاء واللحوم الفاسدة بالماء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: صورة فوتوغرافية لأنثى (يمين) مقابل أنثى غير جاذبة (يسار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: متوسط مؤشرات التفضيل (PIs) لنوع اللحوم ودرجة الحرارة لليرقات (A) والإناث (B) المعروضة على المستوى الديكارتي. تمثل الدوائر السوداء متوسط PIs مع الأخذ في الاعتبار جميع النسخ التجريبية (n = 36 لليرقات و n = 30 للتجارب الأنثوية) التي تم الحصول عليها ل L. cuprina. تشير كل دائرة من الدوائر الرمادية إلى متوسط مؤشرات الأداء للحوم ودرجة حرارة مجموعة بيانات محاكاة ذات خصائص مماثلة لمجموعة البيانات المرصودة (على سبيل المثال نفس عدد النسخ المتماثلة) ولكنها تمثل اختيارا عشوائيا. تعمل الألواح الملونة كأداة مساعدة بصرية لتصوير مناطق PI المفضلة لكل خيار من الخيارات الأربعة حيث يشير اللون الأزرق إلى اللحوم الفاسدة عند 25 ± 2 درجة مئوية ، والأخضر مثل اللحوم الفاسدة عند 33 ± 2 درجة مئوية ، والأصفر مثل اللحوم الطازجة عند 25 ± 2 درجة مئوية والبرتقالي كلحم طازج عند 33 ± 2 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مرحلة	المقارنه	مقارنات مهمة ل PImeat	مقارنات مهمة ل PItemp
يرقات	الفرضية المحاكاة مقابل الفرضية الصفرية (ص < 0.05)	3.8%	2.1%
	الملاحظة مقابل المحاكاة (ص < 0.05)	100.0%	100.0%
إناث	الفرضية المحاكاة مقابل الفرضية الصفرية (ص < 0.05)	3.3%	4.6%
	الملاحظة مقابل المحاكاة (ص < 0.05)	27.1%	69.7%

الجدول 1. النسبة المئوية_للحوم PI الهامة_{ودرجة حرارة} PI (قيم p < 0.05) للمقارنات بين (i) البيانات العشوائية المحاكاة (بدون تفضيل) والفرضية الإحصائية الصفرية ، و (ii) البيانات المرصودة والبيانات العشوائية المحاكاة. يتم عرض النتائج بشكل منفصل لليرقات والإناث.

الملف التكميلي S1: الرمز المستخدم لتحليل البيانات والإحصاءات في R markdown. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي S2: تقرير التحليل الإحصائي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي S3: الأعداد الخام ل Lucilia cuprina لليرقات وتفضيل الإناث في كل من خيارات الركيزة الأربعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يتطلب فهم تطور عادات التغذية ، لا سيما في سياق التطفل في الذباب ، فحص تفضيلات الركيزة عبر مراحل الحياة المختلفة للتغذية أو وضع البيض. لذلك ، في هذه الدراسة ، تم اقتراح طرق قوية ومباشرة للتحقيق في تفضيلات الركيزة في يرقات وإناث الذباب. تم اختبار هذه الطرق في Lucilia cuprina ، وهي ذبابة طفيلية اختيارية². ومن المثير للاهتمام ، أن التجارب كشفت النقاب عن ميل واضح للحوم الفاسدة عند 25 درجة مئوية بين يرقات L. cuprina ، بما يتماشى مع الظروف التي تستخدمها عادة الأنواع الميتة. يختلف هذا عن دراسة Fouche et^{al 40} ، والتي أظهرت تفضيلا لركيزة الكبد الطازجة في Lucilia sericata و Calliphora vicina وأظهرت أن الركيزة الفاسدة أثرت سلبا على البقاء والنمو. ومع ذلك ، من الصعب مقارنة نتائج كلتا الدراستين لأن درجة تسوس اللحوم (سبعة أيام مقابل خمسة في حالتنا) وعملية التحلل (اللاهوائية البحتة مقابل الهوائية واللاهوائية في حالتنا) كانت مختلفة. الأنواع المستخدمة كانت مختلفة أيضا. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت الملاحظات من التجارب المقدمة هنا إلى أن الإناث يفضلن وضع بيضهن عند 25 درجة مئوية ، بينما يظهرن تفضيلا طفيفا فقط للحوم الفاسدة. تظهر هذه النتائج أن اليرقات وخيارات الإناث ليست هي نفسها وأن الإناث تظهر خيارا أكثر تنوعا لاختيار موقع وضع البيض من اليرقات للحفر وخيارات الطعام. هذا يشير إلى أن العادة الطفيلية في L. cuprina تقودها التغيرات في اختيار وضع البيض الأنثوي وليس عن طريق تفضيل تغذية اليرقات. والجدير بالذكر أن هذه النتائج بمثابة دليل على مفهوم فعالية وفائدة الأساليب في توضيح نمط حياة الذباب في مراحل النمو المختلفة.

تم استخدام ظروف اللحوم ودرجات الحرارة المتميزة لمحاكاة عوامل نمط الحياة الطفيلية والميتة. سهل هذا النهج تقييم تغذية اليرقات وتفضيلات موقع وضع البيض الأنثوي في مقايسة من أربعة خيارات ، باستخدام عاملين متفاعلين. تمثل البروتوكولات المعتمدة نهجا ينحرف عن تقنية الاختيار المزدوج التقليدية المستخدمة عادة في الدراسات السابقة 43،⁴⁴،45،46،47،⁴⁸،^49،50. لتقليل الاختلافات الناتجة عن العوامل البيئية التي يمكن أن تؤثر على السلوك ، مثل الإشارات الضوئية أو البصرية أو الرائحة ، تم تنفيذ تدابير تحكم صارمة. تم الحفاظ على إضاءة موحدة ومتسقة من الأعلى في المقايسات لتجنب أي تحيز نحو الضوء أو ضده ، مع استكماله باستخدام خلفية سوداء لمنع تأثير الإشارات البصرية المحتملة على تفضيلات اليرقات والإناث. علاوة على ذلك ، تم تجنب خطر التلوث المتبادل بين ركائز اللحوم الفاسدة والطازجة من خلال استخدام الزجاج أو المواد البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة والقفازات والأواني المنفصلة. وقد ثبت أن تطبيق هذه التدابير أمر حاسم في إنشاء إطار تجريبي خاضع للرقابة وجدير بالثقة، وبالتالي ضمان متانة وموثوقية النتائج التي تم الحصول عليها.

كان تصميم تجربة اليرقات مشابها للمقايسات ثنائية الاختيار الموصوفة سابقا^40,42 ، مع إجراء تعديلات لدمج عامل درجة الحرارة. أثبت بروتوكول اليرقات الموصوف هنا أنه سريع وقوي ومباشر ، بالنظر إلى أن اليرقات أظهرت ميلا قويا للبقاء مختبئا داخل الركيزة التي اختارتها ، وبالتالي القضاء على إمكانية حدوث مشكلات تسجيل غامضة ناشئة عن تبديل الركائز في نهاية التجربة. تمكن هذه الميزة الخاصة المجرب من إجراء ستة نسخ مكررة أو أكثر في وقت واحد دون التعرض لخطر النتائج غير الواضحة أو غير المؤكدة. على الرغم من أن وجود يرقات متعددة داخل نفس النسخة المتماثلة يمكن أن يؤثر على الخيارات الفردية ، إلا أن البروتوكول يسمح بتقييم تفضيل الركيزة العامة من خلال النسخ المتماثلة المستقلة. في السيناريوهات التي يحتاج فيها السلوك التجميعي المحتمل إلى تجنبه أو التحكم فيه ، يمكن تنفيذ الاختبار الفردي أو دمج تجارب التحكم لحساب التأثيرات المحتملة بين اليرقات لمواجهة أي تحيز.

من ناحية أخرى ، يوفر بروتوكول تفضيل موقع وضع البيض الأنثوي ميزة ملحوظة تتمثل في تقييم الاختيار الفردي بشكل مستقل ، خال من تأثير تفضيلات الإناث الأخريات ، وبالتالي تجنب السلوك التجميعي. في الواقع ، من المعروف أن اختيار وضع البيض الأنثوي يمكن أن يتأثر بوجود ذباب محدد^46,47. ومع ذلك ، من المهم الاعتراف بالقيود المتأصلة في الفحص التجريبي. قد لا يتم وضع البيض خلال النافذة التجريبية لمدة 4 ساعات بسبب الظروف غير المناسبة أو ، على الأرجح ، عدم نضج الإناث. ينتج عن عدم اليقين هذا مجموعة فرعية من النسخ المتماثلة بدون وضع بيض (78٪ من التجارب). علاوة على ذلك ، فإن النطاق الواسع في عدد البيض الموضوعة في كل نسخة مكررة (26 إلى 208 ، متوسط ±الانحراف المعياري = 132.4 ± 46.2) يقدم تباينا كبيرا ، مما يجعل من الصعب التمييز بين الاختلافات المدفوعة بتفضيل الإناث وتلك المتأثرة بعوامل مثل احتياطيات البيض المحدودة أو وضع البيض المتأخر أثناء التجربة. على الرغم من هذه القيود ، فإن البروتوكولات المقترحة مناسبة لتقييم تفضيل موقع وضع البيض بشكل فعال.

بشكل عام ، تحمل البروتوكولات التي تم تطويرها إمكانات كبيرة لمجموعة واسعة من التطبيقات في دراسة سلوك الذبابة. أولا ، يمكن استخدام هذه الاختبارات لفحص آثار العلاجات المختلفة ، مثل التربية المختلفة أو ظروف النمو ، على تفضيلات اليرقات أو الإناث داخل نفس النوع. يمكن أن يكشف هذا النقاب عن الآليات الأساسية التي تقود التفضيلات السلوكية وأساسها الجيني ، خاصة عندما تقترن بتقنيات التسلسل. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه الاختبارات للتحقيق في تفضيلات الركيزة لأنواع الذبابة المختلفة ، مما يوفر رؤى قيمة حول تطور التطفل داخل هذه المجموعة. من خلال الخوض في التفضيلات المتنوعة التي تظهرها الذباب ، يمكن اكتساب فهم أعمق لتكيفاتها البيئية ، مما يوفر معرفة قيمة لإدارة أنواع الآفات ومكافحتها في المستقبل.

أخيرا ، تمتد إمكانات البروتوكولات إلى ما هو أبعد من دراسة الذباب وحده. مع تعديلات طفيفة ، يمكن تطبيق هذه البروتوكولات بسهولة لتقييم أنواع الذباب من العائلات الأخرى ، مثل الذباب المنزلي وذباب اللحم ، أو حتى الحشرات ذات الحجم المماثل. كما تسمح قابلية البروتوكولات للتكيف باختيار ركائز مختلفة لتتناسب مع أهداف التحقيقات العلمية المحددة. على سبيل المثال ، يمكن للباحثين تعديل درجة تسوس اللحوم أو استبدال لحوم الأبقار بمصادر حيوانية بديلة (مثل الأسماك ولحم الخنزير) أو ركائز غير حيوانية (مثل الفاكهة) لمعالجة الأسئلة البيئية المتنوعة. لا تعزز هذه التعديلات تنوع البروتوكولات فحسب ، بل تتيح أيضا استكشاف التفضيلات في مجموعة واسعة من أنواع الحشرات والسياقات البيئية ، وبالتالي تعزيز القدرة على توضيح الجوانب الأساسية لسلوك الحشرات والتكيف البيئي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	-	-	70x50 cm
Bovine blood with anticoagulat	-	-	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	-	-	Around 7-8% of fat
Brush	-	-	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	-	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	-	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	-	30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150x20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60x15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	-	-	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	-	-	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	-	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	-	WF10X/22 lenses
Tweezer	-	-	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)