Summary
本明細書では、フクロバエの幼虫および雌の食物源および産卵嗜好を評価するための2つのプロトコルが詳述されている。これらは、基板の種類と温度という2つの相互作用する要因を持つ4つの選択肢で構成されています。このアッセイにより、幼虫の食物源の好みと雌の産卵部位の好みを決定することができます。
Abstract
フクロバエ(双翅目:Calliphoridae)は、通常、偏性寄生、通性寄生、および完全な屍姦に分類される、幅広い幼虫のライフスタイルを示します。いくつかの寄生種は、義務性および通性の両方で、幼虫がミイアシス(生きた組織へのウジの蔓延)を引き起こす可能性があるため、衛生的および経済的に重要であると考えられています。しかし、産卵部位の選択には成虫の雌が決定的な役割を果たしており、幼虫の食性や発育状況を大きく左右していることは注目に値する。この研究では、幼虫の摂食嗜好と雌の産卵部位の嗜好をテストするために、2つのプロトコルが提案されています 肉の基質の種類と温度の2つの相互作用要因を考慮します。ここで紹介するセットアップでは、2つの温度(33±2°Cと25±2°C)と2種類の肉基質(新鮮な肉に血液と5日齢の腐った肉)の4つの選択肢アッセイで、 Lucilia cuprina の幼虫と妊娠した雌を試験することができました。幼虫または妊娠中の雌は、25°Cの腐った肉(屍食性種の状態をシミュレート)、33°Cで血液を補給した新鮮な肉(寄生種の状態をシミュレート)、および2つの対照、33°Cの腐った肉、または25°Cの血液を補給した新鮮な肉のいずれかで、それぞれ穴を掘るか産卵するかを選択できます。 選好は、各反復の各オプションに産み付けられた幼虫または卵の数をカウントすることによって評価されます。観察された結果をランダム分布と比較することで、選好の統計的有意性を推定することができました。その結果、 L. cuprina の幼虫は25°Cで腐った基質を強く好むことが示された。 逆に、雌の産卵部位の嗜好は肉の種類によってより多様であった。この方法論は、同様のサイズの他の昆虫種の好みをテストするために適応させることができます。他の質問は、代替条件を使用して調べることもできます。
Introduction
ハエ、特に萼類のムコイド(フクロバエ、イエバエ、ヒツジバエ、肉バエなど)は、寄生行動や死死仙食行動など、幅広い生活様式を示す1。寄生種は通常、ウジ虫(幼虫)による生きた組織の蔓延であるミイアシスを引き起こします2。Calliphoridae科では、ウジ虫の蔓延による経済的損失と動物福祉の悪さの原因となる主要な家畜害虫です2,3,4,5,6,7。新世界と旧世界のスクリューワーム(それぞれCochliomyia hominivoraxとChrysomyia bezziana)などの偏性寄生虫は、ヒツジのフクロバエ(Lucilia cuprinaとLucilia sericata)などの通性寄生虫とともに特に問題があります4,7,8,9,102,5,6。7.屍食性を含む非寄生種は、腐敗や壊死した有機物で発生し、不衛生な環境でよく見られます。彼らの厳密に非寄生的なライフスタイルは、ハエの幼虫を使用して壊死組織の傷をきれいにするウジ虫療法にうまく使用できます11,12,13。フクロバエは、最近死亡した遺体を見つけてコロニーを形成した最初の生物の1つであり、発育中の幼虫が死亡時刻を推定する手段として機能するため、法医学でも使用されています14。
ブローフライのライフスタイルは、人間の利益に関連して重要であるため、さまざまな調査研究の対象となっています(例:15、16、17、18、19、20、21)。種のライフスタイルを支配する生物学的メカニズムを理解することは、害虫種の防除を目的とした方法を改善するための貴重な洞察を提供することができます。さらに、コガネムシのライフスタイルの多様性と進化は、複雑な形質(寄生など)の起源とメカニズムを研究するための理想的な状況を提供します。生きた組織を餌とするウジ虫による寄生は、Calliphoridae科内で数回独立して進化してきた22,23。しかし、フクロバエの食性の進化史はまだほとんど知られておらず、研究は機能アッセイの助けを借りずに系統発生に沿って習性をマッピングすることに限定されています(例:16,19,22)。例えば、義務性寄生虫がジェネラリスト(通性寄生虫)から進化したのか、それとも屍食性種から直接進化したのかは不明である。ライフスタイルの進化的変化に伴う分子的、生理学的、行動学的プロセスもほとんどわかっていません。
これに関連して、ヒツジのフクロバエLucilia cuprinaなどの通性寄生虫は、宿主の寄生虫として、または死体の屍姦虫として発生する可能性があり、ライフスタイルの選択を制御する要因とメカニズムを調査する可能性を提供します。Lucilia cuprinaは、特に害虫と見なされているオーストラリアで、羊のハエの攻撃を引き起こすことで知られるコスモポリタン種です3,16。L. cuprinaによるミヤ症は、他の家畜、ペット、および人間にも発生する可能性があります3,24,25,26,27,28,29,30。しかし、その幼虫は壊死組織や腐敗物質でも発生する可能性があり、この種は死体を見つけてコロニーを形成するのが非常に速いため、法医昆虫学で成功裏に使用されています31,32,33,34。フクロバエの寄生性と非寄生性のライフスタイルは幼虫期によって定義されますが、産卵部位を選択するのは成虫の雌です。その結果、成虫の雌は幼虫の行動が制限されているため、幼虫のライフスタイルに大きな影響を与えます。しかし、雌の選択は、幼虫が選択肢を提示されたときに同じ基質を好むことを必ずしも意味するものではない35。1つの仮説は、雌が生きた組織に卵を産むことにつながる行動の変化は、寄生的な生活様式への初期の切り替えの一部であった可能性があるというものです。得られた幼虫の事前適応または生理学的能力は、生きた組織上での発達の成功に不可欠であり、寄生生活様式の出現につながった。そのため、影響を受けるプロセスと選択されるプロセスは、必ずしも両方のライフステージ間で一致するとは限りません。
これに関連して、フクロバエ、特にL. cuprinaの幼虫の摂食基質(幼虫選好アッセイ)と産卵部位(雌の選好アッセイ)に関する行動嗜好をテストするために、2つの方法が開発されました。これらの方法では、温度と肉の鮮度という2つの相互作用する要因が考慮されます。筋虫症のほとんどの症例は恒温動物で発生するため、温度が重要な要素として選択されました2。したがって、33°Cの温度が「寄生生活因子」の代理として選択され、25°C(室温)の温度が「非寄生因子」を表します。25°Cは、ブラジルで記録された年間平均気温を表すため、選択されました(国立気象研究所、INMET)。さらに、2種類の肉基質が検討されたが、いずれもウシ由来である:(i)寄生性生活様式の基質を模倣した血液を添加した生肉(寄生性フクロバエ社ヒトボラックスを実験室条件36で飼育するために使用される)、および(ii)屍食生活様式の基質を模倣した5日齢の腐肉。ウシ基質は、生態学的に正当化可能な基質であると同時に、入手可能性、費用対効果、および実用性の点でいくつかの利点を提供するため、実験室条件27,37,38,39でL.cuprinaを飼育するために一般的に使用されます。フクロバエの腐った基質と新鮮な基質の影響を比較した他の研究40,41では、7日齢の腐った基質(嫌気性条件)を使用し、腐った基質が発生速度、生存率、および成長に悪影響を与えることを示しました。 L. cuprinaは、通常空気にさらされる新鮮な死体にコロニーを形成することが知られているため、私たちは、5日齢の腐った肉(牛ひき肉)を非密閉性の鍋(好気性および嫌気性分解)で使用し、屍食性の基質を模倣することにしました。
ここで紹介する実験計画は、個々の因子とその複合効果に対する選好を見分けるという利点があります。さらに、スコアリングされた表現型、すなわち幼虫の摂食基質の選択と産卵数は、フクロバエ種の生物学的および生態学的側面に直接関連しています。これらのプロトコルの適合性は、 L. cuprinaにおける有効性を実証することによって強調されています。さらに、 L. cuprina で得られた観察結果をシミュレートされたランダムデータと比較するために使用できる統計分析用のスクリプトが提供されており、堅牢な統計分析と解釈を保証します。
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Protocol
ハエのサンプルは、感染した動物ではなく、トラップを使用して取得しました。SISBIOライセンス(67867-1)が発行され、Calliphoridae科のハエを収集し、実験室条件で飼育しました。昆虫のサンプルは、ブラジルでの研究における倫理的評価を免除されています。ウシの肉と血液は商業的に入手され、倫理的クリアランスは必要ありませんでした。
1.幼虫の摂食の好み
- 寒天2%を含有するシャーレの調製
- 2%寒天で4つのペトリ皿を準備します。これを行うには、300mLの水に6gの細菌寒天を加え、この混合物を電子レンジで溶かします。次に、容量を4つのガラスシャーレ(150 x 20 mm)に均等に分割し、各シャーレに約70 mLを使用します。
注:必要な実験回数に等しいペトリ皿を準備します。この研究では、36回の繰り返しが使用されました。 - 寒天が固まったら、50 mLの円錐形チューブ(直径3 cm)を使用して、所定の切断パターンに従って、寒天にペトリ皿の両側に2つずつ、合計4つの穴を開けます(図1)。
注:このセットアップは、Fouche et al. (2021)40 および Boulay et al. (2016)42 によって以前に記述されたプロトコルと同様です。
- 2%寒天で4つのペトリ皿を準備します。これを行うには、300mLの水に6gの細菌寒天を加え、この混合物を電子レンジで溶かします。次に、容量を4つのガラスシャーレ(150 x 20 mm)に均等に分割し、各シャーレに約70 mLを使用します。
- 基材の調製
- 新鮮な肉を血液で調製するには、200 gの新鮮な牛ひき肉に12 mLの希釈した牛の血液を加えます。よく混ぜます。基材間の相互汚染を避けるために、肉の種類ごとに異なるメスシリンダーとスプーンを使用してください。
注:希釈された血液は、抗凝固剤(3.8%クエン酸ナトリウム)と50%ろ過水と混合された50%の純血で構成されています。 - 腐った基質を準備するには、12 mLのろ過水を5日齢の腐った牛ひき肉200 gに加え、よく混ぜます。
注:腐った肉は、新鮮なひき肉を非密閉プラスチックポット(好気性分解と非好気性分解の混合物)で25°Cで5日間インキュベートすることによって得られました。各鍋には200gの新鮮なひき肉が入っていました。その後、使用するまで冷凍しました。 - 各ペトリ皿の2つの穴を新鮮な肉と血液の混合物で満たし、残りの2つの穴を腐った肉と水の混合物で埋めます。
注:位置の偏りを避けるために、ペトリ皿の肉の種類ごとに配置を変えてください。たとえば、 図2に示すように、ペトリ皿の中には同じ種類の肉を向かい合わせにする必要がありますが、他の皿では肉の種類を交差させる必要があります。
- 新鮮な肉を血液で調製するには、200 gの新鮮な牛ひき肉に12 mLの希釈した牛の血液を加えます。よく混ぜます。基材間の相互汚染を避けるために、肉の種類ごとに異なるメスシリンダーとスプーンを使用してください。
- 実験装置
- 室温(RT)が25°Cの場合、加熱パッドを光源の真下に置いて、実験エリアを均一に照らし、光に向かおうと光に逆らう動作の偏りを回避します。加熱パッドの周囲に板紙パッドを置き、実験装置が水平に保たれるようにします。
注:使用した光源は、ネオン管などの白色低発熱発光光でした。温熱パッドは、天井の電球のすぐ下のテーブルの上に置かれました(図3)。 - 加熱パッドとレベリング板紙パッドを黒い段ボールで覆い、加熱パッドのスイッチを入れます。
注:黒い段ボールカバーは、行動アッセイに偏りを与える可能性のある視覚的な手がかりを避けるために使用する必要があります。 - 寒天と肉の基質が入った6つのシャーレを黒い段ボールの上に置き、各タイプの2つの基材を加熱パッドの上に置き、他の2つを加熱パッドの表面から離します(図2)。基板を約10分間加熱します。
注意: ペトリ皿の蓋に結露が発生する場合があります。
- 室温(RT)が25°Cの場合、加熱パッドを光源の真下に置いて、実験エリアを均一に照らし、光に向かおうと光に逆らう動作の偏りを回避します。加熱パッドの周囲に板紙パッドを置き、実験装置が水平に保たれるようにします。
- 幼虫試験
- 基板の温度(低温側:25±2°C、高温側:33±2°C)を赤外線温度計で確認します。
注:加熱パッドは、実験の全長中、オンのままです。温度測定は、実験の開始時と終了時に行われました。気温は2°C±変動しましたが、それでも暑い状態と寒い状態の間には少なくとも8°Cの温度差がありました。 - 希望の温度に達したら、ピンセットを使用して各シャーレの中央に5匹の3齢幼虫を配置し(図2)、シャーレを蓋で覆います。選択実験を 10 分間実行します。
注:一部の幼虫は、ペトリ皿の端や蓋の上を這うことがあります。幼虫が逃げた場合は、ピンセットを使用してペトリ皿の中央に戻します。 - 10分後、すべてのペトリ皿を加熱パッドから外し、基板を加熱し続けないように別の表面に置きます。次に、各基質の幼虫の数と、基質を選択しなかった幼虫の数を数えます。
注: Lucilia cuprina の幼虫は、この実験で観察されたように、選択した基質にとどまります。
- 基板の温度(低温側:25±2°C、高温側:33±2°C)を赤外線温度計で確認します。
2.女性の産卵部位の好み
- 実験装置
- 以前に黒い段ボールで覆われ、白色LEDライトストリップで均一に照らされた通常の棚を使用してください。
注:黒い段ボールカバーは、行動アッセイに偏りを与える可能性のある視覚的な手がかりを避けるために使用する必要があります。白色LEDストリップは、実験のすぐ上の棚の真ん中に縦に固定されています。セットアップに使用した棚は45cm離して配置されました。 - 室温(25°C)で、棚の中央に加熱パッドを置きます。加熱パッドの周りの板紙パッドをサポートとして使用して、実験セットアップが水平になっていることを確認します。
- 加熱パッドとレベリング板紙パッドを黒い段ボールで覆い、すべての基材の下に同じ視覚パターンを保ちます。
- 1つの棚に2つの十字型のガラス容器を置き、それぞれに黒い段ボールと加熱パッドの上に2本のアームが必要です。実験開始前に、白色LEDライトストリップと加熱パッドのスイッチを入れてください。
- 70%エタノールを使用して十字架(十字架と蓋の内側)を清掃し、臭いの汚染を防ぎます。
- 以前に黒い段ボールで覆われ、白色LEDライトストリップで均一に照らされた通常の棚を使用してください。
- 基材の調製
- 5日齢の腐った肉または新鮮な肉5g(各タイプの基質に2つ)を入れたクロスごとに4つのシャーレ(60 mm x 15 mm)を準備します。
注:ペトリ皿は、実験の反復回数に4倍の回数を合わせた量に等しくなります。この研究では、30回の繰り返しが使用され、合計120枚のペトリ皿が準備されました。 - 新鮮な肉に1mLの希釈した牛の血液(抗凝固剤と50%ろ過水を含む50%の純血)を加え、腐った肉に1mLのろ過水を加えます。肉の種類ごとに異なるスプーンを使用して、肉(新鮮または腐った)と液体(血液または水)を完全に混合します。
注:雌のアッセイのための肉の調製は幼虫のアッセイと非常によく似ていますが、雌の試験は幼虫の試験よりも長く実行されるため、量は異なります。肉の種類ごとに異なるピペットチップとスプーンを使用して、基材間の臭いの相互汚染を防ぐことを忘れないでください。 - アルコールが十字架から完全に蒸発したかどうかを確認します。次に、十字架の各腕の先端に4つのシャーレ(各種類の肉を加熱パッドに1つ、加熱パッドの表面から他の2つ)を置きます(図4)。蓋で十字架を閉じ、基板を約10分間加熱します。
注:さらに、位置の偏りを避けるために、クロスのさまざまな肉の種類の配置を変えてください。例えば、 図 4 に示すように、ある交配種では、隣接する腕に同じ種類の肉が描かれている必要がありますが、他の交配種では、同じ種類の肉が互いに向かい合っている必要があります。
- 5日齢の腐った肉または新鮮な肉5g(各タイプの基質に2つ)を入れたクロスごとに4つのシャーレ(60 mm x 15 mm)を準備します。
- 女性テスト
- ハエのケージに妊娠中の雌を集め、個々のチューブに隔離します。
注:妊娠中の女性は、妊娠していない女性とは対照的に、肥大した白っぽい黄色の腹部を持っていることを特徴としています(図5)。妊娠中の雌は、実験のために羽化後10〜16日の間に収集されました。 - 赤外線温度計を使用して、クロス内の基板の温度(低温側:25±2°C、高温側:33±2°C)を確認します。
注:幼虫試験と同様に、加熱パッドは実験の全長にわたってオンのままです。温度測定は、実験の開始時と終了時に行われました。気温は2°C±変動しましたが、それでも暑い状態と寒い状態の間には少なくとも8°Cの温度差がありました。 - 各十字架の中央の開口部に1匹の妊娠中の女性を含むチューブを逆さまに置きます。女性が十字架に入ったら、チューブを取り外し、小さな蓋で開口部を閉じます。すべての十字架を閉じた後、棚の前面に黒い段ボールを置き、実験セットアップを囲みます。実験を4時間実行します。
- その後、メスをチューブで慎重にキャッチして取り出し、基板に卵がないか確認します。
- 各ペトリ皿の蓋を、各クロスから基板タイプで識別します。70%エタノールを使用して、テストからの臭いから十字架(十字架と蓋の内側)をきれいにします。
注:実験直後に卵を数えることができない場合は、基質の入ったペトリ皿を-20°Cで保存することができます。
- ハエのケージに妊娠中の雌を集め、個々のチューブに隔離します。
- 卵の数
注:ペトリ皿の基質が凍結している場合は、カウントする前に解凍してください。- 実体顕微鏡を使用して、各基質に産卵された卵の数を数えます。ブラシと水を使用して卵を分離し、卵を数えます。
3. データ分析と統計
- 選好指数の計算
- 幼虫(n = 36)および雌(n = 30)のテストの繰り返しごとに、すべての基質(新鮮で暑い+新鮮な寒さ+腐った熱い+腐った冷たい)の幼虫または卵の合計数に対する新鮮な基質(新鮮なホットおよびフレッシュコールド)に存在する幼虫または卵の比率を決定することにより、肉(PI肉として指定)の選好指数を計算します。
PI肉 =(#新鮮な基質上の幼虫または卵)/#幼虫または卵の総数
注意: 「ホット」と「コールド」という用語は、それぞれ33±2°Cおよび25±2°Cの温度条件を示します。 - 同様に、幼虫と雌のテストの各反復の温度の選好指数(PItemp)を、高温基質に存在する幼虫または卵の数(新鮮、高温、腐った高温)を、すべての基質上の幼虫または卵の総数(新鮮、高温、新鮮、低温+腐った高温、腐った低温)で割ったものとして計算します。
PItemp = (# 高温基板上の幼虫または卵) / # 幼虫または卵の総数
注:1に近い値は、フレッシュまたはホットの基材の好みを反映し、ゼロに近い値は、腐ったまたは冷たい基材の好みを示します。PIは、手動で計算することも、提供されたコード(補足ファイルS1および補足ファイルS2)を使用して計算することもできます。
- 幼虫(n = 36)および雌(n = 30)のテストの繰り返しごとに、すべての基質(新鮮で暑い+新鮮な寒さ+腐った熱い+腐った冷たい)の幼虫または卵の合計数に対する新鮮な基質(新鮮なホットおよびフレッシュコールド)に存在する幼虫または卵の比率を決定することにより、肉(PI肉として指定)の選好指数を計算します。
- 観測された選好とシミュレートされたランダムデータとの比較
- 提供されたコード(補足ファイルS1および補足ファイルS1)を実行してシミュレーションデータを生成し、観測データと比較します。
注:このコードは、幼虫と雌の1000のシミュレートされたランダムデータセットを生成し、シミュレートされた各複製の選好指数(PI)と L.cuprinaの観察データを計算します。シミュレーションでは、幼虫と雌の両方が基質の選好を示さず、ランダムな選択を行うと仮定しています。シミュレーションには、幼虫が基質を選択しない確率、成虫の雌が単一の基質に産卵を集中させる確率、または異なる基質に卵を均一に分配する確率など、さまざまなシナリオを含む動物の重要な行動的側面が組み込まれています。一般化線形モデル(GLM、ファミリー:準二項式、リンク:ロジット)を使用して、挙動アッセイから観察されたデータとシミュレートされたランダムデータを比較しました。採用されたGLMは、選好指数(PI)が0から1の範囲で有界であるため、この分析に適していました。GLMは、非正規分布の応答変数の処理に長けており、ロバストな統計的比較を可能にします。この選択により、行動アッセイから観察されたデータと、シミュレートされたランダムデータによって生成された複雑なパターンを効果的に比較できるようになり、有意義な洞察が促進されました。他の構造化データセットでは、コードの微調整が必要になる場合があります。
- 提供されたコード(補足ファイルS1および補足ファイルS1)を実行してシミュレーションデータを生成し、観測データと比較します。
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Representative Results
提示された方法の有効性を実証するために、実験は、通性寄生性フガンバエであるLucilia cuprina(科:Calliphoridae)の実験室集団を用いて行われました2。本種について得られた生データセット全体は、幼虫および雌の基質選好性試験の結果とともに補足ファイルS3にあります。幼虫と雌が何らかの基質を好むかどうかを評価するために、観察されたデータを、それぞれがランダムな選択を表す1000のシミュレーションデータセットと比較しました(補足ファイルS1のコードを参照)。統計的に有意な比較の割合(p < 0.05)を選好を評価する尺度として使用した。この分析から、観察されたデータとシミュレートされたランダム選択データセットのそれぞれとの間の1000の比較すべてが肉と温度条件で有意に異なることがわかったため、幼虫は25°Cで腐った基質に対して顕著な好みを示したことが明らかになりました(図6A、表1)。同様に、雌も25°Cを顕著に選好しており、観察データと無作為選択の比較の69.7%で有意に異なることがわかりました(図6B、表1)。しかし、腐った肉に対する彼らの好みはより微妙であり(図6B、表1)、観察された比較とランダム選択の比較の27.1%のみが有意であった。 この研究から得られたもう一つの観察は、L. cuprinaの幼虫は通常、実験の最初の2分以内に素早い選択をし、肉の基質に穴を掘ったということでした。10分間の実験中に別の状態に変化することはほとんどありませんでした。
図1:寒天入りペトリ皿の幼虫の摂食嗜好の切断パターン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:幼虫の摂食嗜好アッセイのレイアウトの上面図。 選択肢はランダムに配置し、試験は室温(2±5〜2°C)で実施しました。黒い長方形は、温度を33±2°Cに保持する加熱パッドを表しています。 赤と青の円は、希釈した血液(50%)を補給した新鮮な肉と、水を補給した腐った肉をそれぞれ表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:光に偏ったり逆になったりしないように、幼虫の実験装置を光源の下に配置する方法を示す図。光源は白色低発熱光(ネオン管)を使用しました。温熱パッドは、シーリングライトの真下のテーブルの上に置かれていました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:雌産卵部位選好アッセイのレイアウトの上面図。 選択肢はランダムに配置し、試験は室温(2±5〜2°C)で実施しました。黒い長方形は、温度を33±2°Cに保持する加熱パッドを表しています。 赤い円は、血液が希釈された新鮮な肉(50%)を表し、青い円は、水で腐った肉を表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:妊娠した雌(右)と妊娠していない雌(左)の写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:肉の種類と温度の平均選好指数(PI)をデカルト平面で表示した幼虫(A)と雌(B)。 黒い円は、 L. cuprina について得られたすべての実験反復 (幼虫の場合は n = 36、雌の実験の場合は n = 30) を考慮した平均 PI を表しています。灰色の円はそれぞれ、観測されたデータセットと同様の特性(例:同じ反復数)を持つが、ランダムな選択を表すシミュレーションデータセットの肉と温度の平均PIを示します。色付きのペインは、4つの選択肢のそれぞれについて、青は25±2°Cで腐った肉、3±32°Cで腐った肉を示す緑、25±2°Cで新鮮な肉として黄色、33±2°Cで新鮮な肉としてオレンジで、4つの選択肢のそれぞれについて好みのPI領域を視覚的に表現するのに役立ちます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 舞台 | 比較 | PImeatの有意な比較 | PItempの有意な比較 |
| 幼生 | シミュレーション仮説 vs. 帰無仮説 (p < 0.05) | 3.8% | 2.1% |
| 観測値 vs. シミュレーション値(p < 0.05) | 100.0% | 100.0% | |
| 女性 | シミュレーション仮説 vs. 帰無仮説 (p < 0.05) | 3.3% | 4.6% |
| 観測値 vs. シミュレーション値(p < 0.05) | 27.1% | 69.7% |
表 1.(i)シミュレートされたランダムデータ(選好なし)と統計的帰無仮説、および(ii)観測データとシミュレートされたランダムデータの比較の有意なPI肉 とPI温度 (p値<0.05)の割合。結果は、幼虫と雌で別々に提示されます。
補足ファイル S1: R マークダウンでのデータ分析と統計に使用されるコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイルS2:統計解析のレポート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイルS3:4つの基質選択のそれぞれにおける幼虫と雌の好みに関するLucilia cuprinaの生のカウント。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
特にフクロバエの寄生の文脈における食性の進化を理解するには、摂食や産卵のさまざまなライフステージにわたる基質の好みを調べる必要があります。そこで、本研究では、フクロバエの幼虫や雌の基質選好性を調べるための頑健で簡便な手法を提案した。これらの方法は、通性寄生性フガンガンであるLucilia cuprinaでテストされました2。興味深いことに、この実験では、L. cuprinaの幼虫が25°Cで肉を腐らせる傾向がはっきりと見られ、これは屍食性の種が通常使用する条件と一致しています。これは、Lucilia sericataとCalliphora vicinaの新鮮な肝臓基質の好みを示し、腐った基質が生存と成長に悪影響を与えることを示したFoucheらの研究とは異なります40。しかし、肉の腐敗の程度(7日間対5日間)と分解プロセス(純粋な嫌気性と好気性および嫌気性)が異なっていたため、両方の研究の結果を比較することは困難です。使用する種も異なっていました。さらに、ここで紹介した実験からの観察結果から、雌は25°Cで卵を産むことを好み、腐った肉をわずかに好むだけであることが示されました。これらの結果は、幼虫と雌の選択が同じではなく、雌は幼虫よりも産卵場所の選択においてより多様な選択を示すことを示している。このことは、L. cuprinaの寄生習性は、幼虫の摂食嗜好ではなく、雌の産卵選択の変化によって導かれていることを示唆している。特に、これらの知見は、異なる発生段階におけるフクロバエの生活様式の解明における有効性と有用性の概念実証として役立つ。
寄生虫と屍食のライフスタイル要因を模倣するために、異なる肉と温度条件が使用されました。このアプローチにより、2つの相互作用因子を用いた4択アッセイにおいて、幼虫の摂食と雌の産卵部位の選好性の評価が容易になりました。採用されたプロトコルは、以前の研究で一般的に使用されていた従来の2択手法から逸脱したアプローチを表しています43、44、45、46、47、48、49、50。光、視覚、匂いの手がかりなど、行動に影響を与える可能性のある環境要因による変動を最小限に抑えるために、厳格な管理対策が実施されました。アッセイでは、光に偏ったり光に逆らったりしないように、上からの均一で一貫した照明が維持され、潜在的な視覚的手がかりが幼虫や雌の好みに影響を与えるのを防ぐために、黒い背景を使用することで補完されました。さらに、腐った肉と新鮮な肉の基質の間の二次汚染のリスクは、ガラスまたは使い捨てのプラスチック材料、手袋、および個別の調理器具を使用することで回避されました。これらの測定の適用は、制御された信頼できる実験フレームワークを確立する上で重要であることが証明され、それによって得られた結果の堅牢性と信頼性が保証されました。
幼虫の実験デザインは、以前に説明した2つの選択アッセイ40,42に類似しており、温度係数を組み込むように適応が行われました。ここで説明する幼虫のプロトコルは、幼虫が選択した基質内に穴を掘ったままにする強い傾向を示したため、実験終了時の基質の切り替えから生じるあいまいなスコアリングの問題の可能性を排除し、迅速で堅牢かつ簡単であることが証明されました。この特定の機能により、実験者は、不明瞭または不確実な結果のリスクなしに、6つ以上の反復を同時に行うことができます。同じ複製内に複数の幼虫が存在すると、個々の選択に影響を与える可能性がありますが、このプロトコルでは、独立した複製を通じて一般的な基質の好みを評価することができます。集合的な行動を回避または制御する必要があるシナリオでは、個々のテストを実施するか、幼虫間の潜在的な影響を説明するための対照実験を組み込んで、バイアスに対抗することができます。
一方、雌の産卵部位選好プロトコルは、他の雌の嗜好の影響から解放され、個々の選択を独立して評価するという顕著な利点を提供し、したがって集約的な行動を回避します。実際、カリフォリドの雌の産卵の選択は、同種のハエの存在によって影響を受けることが知られている46,47。それにもかかわらず、実験的アッセイの本質的な限界を認識することが重要です。卵は、不適切な条件または、より可能性が高いが、雌の未熟さのために、4時間の実験ウィンドウ内に産まれない可能性があります。この不確実性により、卵が産まれていない反復のサブセット(試行の78%)が生じます。さらに、各反復で産卵される卵の数に大きな幅がある(26〜208、平均±標準偏差= 132.4 ± 46.2)は、かなりのばらつきをもたらし、雌の好みによって引き起こされる変動と、卵の蓄えの少なさや実験中の産卵の遅れなどの要因の影響を受ける変動を区別することを困難にしています。これらの制限にもかかわらず、提案されたプロトコルは、産卵部位の好みを効果的に評価するのに適しています。
全体として、開発されたプロトコルは、ブローフライの行動を研究する上での幅広いアプリケーションに大きな可能性を秘めています。第一に、これらのテストは、同じ種内の幼虫または雌の嗜好に対する、異なる飼育条件や発達条件などのさまざまな処理の効果を調べるために使用できます。これは、行動選好とその遺伝的基盤を駆動する根本的なメカニズムを、特にシーケンシング技術と組み合わせた場合に明らかにする可能性がある。さらに、これらの試験を拡張して、さまざまなフバエ種の基質の好みを調査することができ、このグループ内の寄生の進化に関する貴重な洞察を提供します。フクロバエが示す多様な嗜好を掘り下げることで、その生態学的適応をより深く理解し、将来の害虫種の管理と防除のための貴重な知識を得ることができます。
最後に、プロトコルの可能性は、ブローフライの研究だけにとどまりません。これらのプロトコルは、わずかな修正で、イエバエや肉バエ、さらには同様のサイズの昆虫など、他の科のハエ種を評価するために容易に適用できます。また、プロトコルの適応性により、特定の科学的調査の目的に合わせてさまざまな基質を選択することもできます。例えば、研究者は肉の腐敗の程度を変えたり、牛肉を代替動物源(魚、豚肉など)や非動物性基質(果物など)に置き換えたりして、さまざまな生態学的問題に取り組むことができます。これらの適応は、プロトコルの多様性を高めるだけでなく、幅広い昆虫種と生態学的文脈における嗜好の探求を可能にし、それによって昆虫の行動と生態学的適応の基本的な側面を解明する能力を高めます。
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Disclosures
どれも宣言されていません。
Acknowledgments
Patrícia J. Thyssen氏、Gabriela S. Zampim氏、Lucas de Almeida Carvalho氏には、 L. cuprina のコロニーを提供し、実験の立ち上げに協力していただいたことに感謝します。また、ビデオの撮影と編集をしてくれたラファエル・バロス・デ・オリベイラにも感謝します。この研究は、動物行動学会からV.A.S.C.への発展途上国研究助成金と、T.T.T.へのFAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo助成金(20/05636-4)の支援を受けました。STとDLFは、FAPESP(それぞれ19/07285-7ポスドク助成金と21/10022-8博士奨学金)によって支援されました。V.A.S.C.とAVRは、CNPq博士課程奨学金(それぞれ141391/2019-7、140056/2019-0)の支援を受けました。T.T.T. は CNPq (310906/2022-9) によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
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