Summary
Her er to protokoller for vurdering av matkilde og oviposisjonspreferanser hos larver og hunner av blåfluer detaljert. Disse består av fire valg med to samvirkende faktorer: substrattype og temperatur. Analysene gjør det mulig å bestemme larvenes matkildepreferanse og oviposisjonspreferansen for hunnene.
Abstract
Blåfluer (Diptera: Calliphoridae) presenterer et bredt spekter av larvelivsstil, vanligvis klassifisert som obligatorisk parasittisme, fakultativ parasittisme og fullstendig sapro-nekrofagi. Flere parasittiske arter, både obligatoriske og fakultative, anses å være av hygienisk og økonomisk betydning, da larvene deres kan forårsake myiasis (maggotangrep i levende vev). Det er imidlertid bemerkelsesverdig at den voksne kvinnen spiller en avgjørende rolle når hun velger oviposisjonsstedet, og derfor i stor grad bestemmer larvenes fôringsvane og utviklingsforhold. I denne studien foreslås to protokoller for å teste larvefôringspreferanse og hunnens oviposisjonspreferanse med tanke på to samvirkende faktorer: kjøttsubstrattype og temperatur. Oppsettene som presenteres her tillot å teste Lucilia cuprina larver og gravide hunner i en firevalgsanalyse med to temperaturer (33 ± 2 ° C og 25 ± 2 ° C) og to typer kjøttsubstrater (ferskt kjøtt supplert med blod og 5 dager gammelt råttent kjøtt). Larver eller drektige hunner kan velge å grave eller legge eggene sine henholdsvis i ett av følgende: råttent kjøtt ved 25 °C (simulerer en nekrofagøs artstilstand), ferskt kjøtt tilsatt blod ved 33 °C (simulerer parasittisk artstilstand) og to kontroller, råttent kjøtt ved 33 °C eller ferskt kjøtt tilsatt blod ved 25 °C. Preferansen vurderes ved å telle antall larver eller egg lagt i hvert alternativ for hver replikasjon. Sammenligning av de observerte resultatene med en tilfeldig fordeling gjorde det mulig å estimere den statistiske signifikansen av preferansen. Resultatene indikerte at L. cuprina-larver har en sterk preferanse for det råtne substratet ved 25 °C. Omvendt var oviposisjonspreferanse av kvinner mer variert for kjøtttypen. Denne metoden kan tilpasses for å teste preferansen til andre insektarter av tilsvarende størrelse. Andre spørsmål kan også utforskes ved å bruke alternative betingelser.
Introduction
Fluer, spesielt calyptrate muscoids (inkludert blowflies, house fluer, bot fluer og kjøtt fluer blant andre), utviser et bredt spekter av livsstil, som omfatter parasittiske og necro-saprophagous atferd1. Parasittiske arter forårsaker vanligvis myiasis, et angrep av levende vev av (larver)2. I familien Calliphoridae er både obligatoriske og fakultative parasittiske arter store på husdyr som er ansvarlige for økonomiske tap og dårlig dyrevelferd på grunn av maggot angrep 2,3,4,5,6,7. Obligate parasitter, som New World og Old World skrueorm (Cochliomyia hominivorax og Chrysomyia bezziana, henholdsvis), er spesielt problematiske 4,7,8,9,10 sammen med fakultative parasitter, som saueblåsefluer (Lucilia cuprina og Lucilia sericata) 2,5,6, 7. Ikke-parasittiske arter, inkludert sapro-nekrofagøse, utvikler seg i forfall og nekrotisk organisk materiale og finnes ofte i uhygieniske miljøer. Deres strengt ikke-parasittiske livsstil kan med hell brukes til maggotterapi, som bruker fluelarver til å rense sår av nekrotisk vev11,12,13. Blowflies brukes også i rettsmedisin, da de er blant de første organismer som finner og koloniserer nylig avdøde kropper, med de utviklende larver som tjener som et middel til å estimere dødstidspunktet14.
Blowfly livsstil har vært gjenstand for ulike forskningsstudier (f.eks. 15,16,17,18,19,20,21) på grunn av deres betydning i forhold til menneskelige interesser. Å forstå de biologiske mekanismene som styrer en arts livsstil kan gi verdifull innsikt i å forbedre metoder som tar sikte på å kontrollere skadedyrarter. Videre tilbyr mangfoldet og utviklingen av blowfly livsstil en ideell kontekst for å studere opprinnelsen og mekanismene til komplekse egenskaper (f.eks. Parasitisme). Parasittisme på grunn av som spiser på levende vev har utviklet seg uavhengig flere ganger i familien Calliphoridae22,23. Imidlertid er den evolusjonære historien til fôringsvanene til blåfluer fortsatt stort sett ukjent, med studier begrenset til å kartlegge vanene langs fylogenier (f.eks. 16,19,22) uten hjelp av funksjonelle analyser. For eksempel er det usikkert om obligatoriske parasitter utviklet seg fra generalister (dvs. fakultative parasitter) eller direkte fra nekrofagøse arter. De molekylære, fysiologiske og atferdsmessige prosessene som følger med de evolusjonære skiftene i livsstil er også stort sett ukjente.
I denne sammenheng gir fakultative parasitter, som saueblåseren Lucilia cuprina, som kan utvikle seg som parasitter på en vert eller som nekrofager på, muligheten til å utforske faktorene og mekanismene som styrer livsstilsvalg. Lucilia cuprina er en kosmopolitisk art kjent for å forårsake saueflueangrep, spesielt i Australia hvor den regnes som et 3,16. Myiasis forårsaket av L. cuprina kan også forekomme hos andre husdyr, kjæledyr og mennesker 3,24,25,26,27,28,29,30. Imidlertid kan larvene også utvikle seg i nekrotisk vev og råtnende materiale, og denne arten har blitt vellykket brukt i rettsmedisinsk entomologi, da det er veldig raskt å lokalisere og kolonisere lik31,32,33,34. Selv om den parasittiske versus ikke-parasittiske livsstilen til blowflies er definert av larvalstadiet, er det den voksne kvinnen som velger oviposisjonsstedet. Følgelig påvirker den voksne hunnen larvenes livsstil sterkt, da sistnevnte har begrenset mobilitet. Hunnens valg betyr imidlertid ikke nødvendigvis at larvene foretrekker det samme substratet når de presenteres for et valg35. En hypotese er at atferdsendringer som fører til at kvinner legger eggene sine på levende vev, kan ha vært en del av en tidlig overgang til en parasittisk livsstil. Pre-tilpasninger eller fysiologiske evner av de resulterende larver ville ha vært avgjørende for deres vellykkede utvikling på levende vev, noe som førte til fremveksten av den parasittiske livsstilen. Som sådan kan prosessene som påvirkes og velges, ikke nødvendigvis samsvare mellom begge livsstadiene.
I denne sammenheng ble det utviklet to metoder for å teste atferdspreferanse hos blowflies, spesielt for L. cuprina, angående larvefôringssubstrat (larvepreferanseanalyse) og oviposisjonssted (kvinnelig preferanseanalyse). Disse metodene tar hensyn til to samvirkende faktorer: temperatur og kjøttfriskhet. Temperatur ble valgt som en avgjørende faktor siden de fleste tilfeller av myiasis forekommer hos homeoterme dyr2. Derfor ble en temperatur på 33 °C valgt som proxy for den "parasittiske livsstilsfaktoren", mens en temperatur på 25 °C (romtemperatur) representerer den "ikke-parasittiske faktoren". En temperatur på 25 °C ble valgt fordi den er representativ for den gjennomsnittlige årlige temperaturen registrert i Brasil (National Institute of Meteorology, INMET). I tillegg ble to typer kjøttsubstrater vurdert, begge fra storfekilder: (i) ferskt kjøtt supplert med blod, som etterligner substratet for den parasittiske livsstilen, som brukes til å oppdra den parasittiske blåsefluen Co. hominivorax i laboratorieforhold36, og (ii) 5 dager gammelt råttent kjøtt, som etterligner substratet for nekrofagøs livsstil. Storfesubstratet brukes ofte til å heve L. cuprina under laboratorieforhold 27,37,38,39, da det gir flere fordeler når det gjelder tilgjengelighet, kostnadseffektivitet og praktisk, samtidig som det er et økologisk forsvarlig substrat. Andre studier40,41 som sammenligner effekten av råtne versus friske substrater i blåfluer har brukt 7 dager gammelt råttent substrat (under anaerobe forhold) og viste en negativ effekt av det råtne substratet på utviklingsrater, overlevelse og vekst. Siden L. cuprina er kjent for å kolonisere ferske som vanligvis utsettes for luft, bestemte vi oss for å bruke 5 dager gammelt råttent kjøtt (kjøttdeig) i ikke-hermetiske gryter (aerob og anaerob nedbrytning) for å etterligne et nekrofagøst substrat.
De eksperimentelle designene som presenteres her, gir fordelen av kresne preferanser for individuelle faktorer, så vel som deres kombinerte effekter. Videre er fenotypene som er scoret, nemlig valg av larvefôringssubstrat og antall egg lagt, direkte relevante for de biologiske og økologiske aspektene ved blåsefluearter. Egnetheten til disse protokollene er fremhevet ved å demonstrere deres effektivitet i L. cuprina. I tillegg er det gitt et skript for statistisk analyse, som kan brukes til å sammenligne de observerte resultatene oppnådd i L. cuprina med simulerte tilfeldige data, noe som sikrer robust statistisk analyse og tolkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flueprøver ble tatt ved hjelp av feller og ikke på infiserte dyr. En SISBIO-lisens (67867-1) ble utstedt for å samle inn og holde fluer av Calliphoridae-familien i fangenskap under laboratorieforhold. Insektprøver er unntatt fra etisk evaluering i forskning i Brasil. Storfekjøtt og blod ble oppnådd kommersielt, og ingen etisk klarering var nødvendig.
1. Larvefôringspreferanse
- Tilberedning av petriskålene som inneholder 2% agar
- Forbered fire petriskåler med 2% agar. For å gjøre det, tilsett 6 g bakteriologisk agar til 300 ml vann og smelt denne blandingen i en mikrobølgeovn. Del deretter volumet jevnt i fire petriskåler i glass (150 x 20 mm), med ca. 70 ml i hver tallerken.
MERK: Forbered petriskåler lik antall eksperimentelle replikater ønsket. I denne studien ble 36 replikater brukt. - Når agaren har størknet, bruk et 50 ml konisk rør (3 cm diameter) til å stanse fire hull i agar, to på hver side av petriskålen, etter det medfølgende skjæremønsteret (figur 1).
MERK: Dette oppsettet ligner på tidligere beskrevne protokoller av Fouche et al. (2021) 40 og Boulay et al. (2016) 42.
- Forbered fire petriskåler med 2% agar. For å gjøre det, tilsett 6 g bakteriologisk agar til 300 ml vann og smelt denne blandingen i en mikrobølgeovn. Del deretter volumet jevnt i fire petriskåler i glass (150 x 20 mm), med ca. 70 ml i hver tallerken.
- Klargjøring av underlag
- For å tilberede det ferske kjøttet med blod, tilsett 12 ml fortynnet storfeblod til 200 g ferskt kjøttdeig. Bland godt. Sørg for å bruke forskjellige graderte sylindere og skjeer for hver type kjøtt for å unngå krysskontaminering mellom underlag.
MERK: Det fortynnede blodet består av 50% rent blod blandet med en antikoagulant (3,8% natriumcitrat) og 50% filtrert vann. - For å forberede det råtne substratet, tilsett 12 ml filtrert vann til 200 g 5 dager gammelt råttent kjøttdeig og bland det godt.
MERK: Råttent kjøtt ble oppnådd ved å inkubere ferskt kjøttdeig i fem dager ved 25 ° C i ikke-hermetiske plastpotter (blanding av aerob og ikke-aerob nedbrytning). Hver gryte inneholdt 200 g ferskt kjøttdeig. Deretter ble den frosset ned til bruk. - Fyll to hull i hver petriskål med ferskt kjøtt og blodblanding og de resterende to hullene med råttent kjøtt og vannblanding.
MERK: For å unngå posisjonsskjevheter bør du variere plasseringen av de ulike kjøtttypene i petriskålene. For eksempel bør noen petriskåler ha samme type kjøtt vendt mot hverandre, mens i andre retter skal kjøtttypen krysses, som vist i figur 2.
- For å tilberede det ferske kjøttet med blod, tilsett 12 ml fortynnet storfeblod til 200 g ferskt kjøttdeig. Bland godt. Sørg for å bruke forskjellige graderte sylindere og skjeer for hver type kjøtt for å unngå krysskontaminering mellom underlag.
- Eksperimentelt oppsett
- Ved en romtemperatur (RT) på 25 °C, plasser varmeputen rett under en lyskilde for å belyse eksperimentområdet jevnt og unngå atferdsforstyrrelser mot eller mot lyset. Plasser pappputer rundt varmeputen for å sikre at det eksperimentelle oppsettet forblir i vater.
MERK: Lyskilden som ble brukt var hvitt lys med lav oppvarming, for eksempel et neonrør. Varmeputen ble plassert på et bord rett under lyspærene i taket (figur 3). - Dekk varmeputen og utjevningsputene med svart papp og slå på varmeputen.
MERK: Det svarte pappdekselet bør brukes for å unngå visuelle signaler som kan forstyrre atferdsanalysen. - Legg seks petriskåler med agar og kjøttsubstrat over den svarte pappen med to underlag, ett av hver type, på varmeputen og de to andre på overflaten av varmeputen (figur 2). La underlagene varmes i ca. 10 min.
MERK: Det kan dannes kondens på lokket på petriskålene.
- Ved en romtemperatur (RT) på 25 °C, plasser varmeputen rett under en lyskilde for å belyse eksperimentområdet jevnt og unngå atferdsforstyrrelser mot eller mot lyset. Plasser pappputer rundt varmeputen for å sikre at det eksperimentelle oppsettet forblir i vater.
- Larveprøve
- Kontroller temperaturen på underlagene (kald side: 25 ± 2 °C; hot side: 33 ± 2 °C) med et infrarødt termometer.
MERK: Varmeputen forblir på under hele eksperimentets lengde. Temperaturmålinger ble gjort i begynnelsen og på slutten av forsøket. Selv om temperaturen varierte med ± 2 °C, var det fortsatt minst 8 °C temperaturforskjell mellom varme og kalde forhold. - Etter å ha nådd ønsket temperatur, plasser fem tredjeinstar larver i midten av hver petriskål ved hjelp av pinsett (figur 2) og dekk petriskålene med lokkene. La valgeksperimentet gå i 10 min.
MERK: Noen larver kan krype rundt kantene og på lokket på petriskålene. Hvis noen larver rømmer, bruk en pinsett for å plassere den tilbake til midten av petriskålen. - Etter 10 min, ta alle petriskålene av varmeputen og legg dem på en annen overflate for å unngå å fortsette å varme opp underlagene. Deretter teller antall larver i hvert substrat, så vel som de som ikke valgte noe substrat.
MERK: Lucilia cuprina larver forblir i sitt valgte substrat, som observert i dette eksperimentet.
- Kontroller temperaturen på underlagene (kald side: 25 ± 2 °C; hot side: 33 ± 2 °C) med et infrarødt termometer.
2. Kvinnelig oviposisjonspreferanse
- Eksperimentelt oppsett
- Bruk en vanlig hylle som tidligere er dekket med svart papp og jevnt opplyst med hvite LED-lysstrimler.
MERK: De svarte pappdekslene bør brukes for å unngå visuelle signaler som kan forstyrre atferdsanalysen. De hvite LED-stripene er festet på langs midt på hyllen rett over forsøket. Hyllene som ble brukt i oppsettet ble plassert 45 cm fra hverandre. - Ved RT (25 °C) plasserer du en varmepute midt på hyllen. Bruk pappputer rundt varmeputen som en støtte for å sikre at det eksperimentelle oppsettet er nivellert.
- Dekk varmeputen og utjevning pappputer med en svart papp for å holde det samme visuelle mønsteret under alle underlagene.
- Plasser to kryssformede glassbeholdere på en hylle, hver skal ha to armer over den svarte pappen og varmeputen. Slå på de hvite LED-lyslistene og varmeputene før eksperimentet starter.
- Bruk 70% etanol til å rengjøre kryssene (inne i korset og lokket) for å unngå luktforurensning.
- Bruk en vanlig hylle som tidligere er dekket med svart papp og jevnt opplyst med hvite LED-lysstrimler.
- Klargjøring av underlag
- Forbered fire petriskåler (60 mm x 15 mm) per kryss med 5 g 5 dager gammelt råttent eller ferskt kjøtt (to av hver type underlag).
MERK: Forbered petriskåler lik antall eksperimentelle replikater ønsket ganger fire. I denne studien ble det brukt 30 replikater, totalt 120 tilberedte petriskåler. - Tilsett 1 ml fortynnet storfeblod (50% rent blod med antikoagulant og 50% filtrert vann) på det ferske kjøttet og 1 ml filtrert vann på det råtne kjøttet. Bland kjøttet grundig (ferskt eller råttent) med væsken (blod eller vann) med en annen skje for hver type kjøtt.
MERK: Tilberedningen av kjøttet til hunnanalysen er svært lik larveanalysen, selv om mengdene er forskjellige fordi hunntesten vil pågå lenger enn larvetesten. Husk å bruke forskjellige pipettespisser og skjeer for hver type kjøtt for å unngå krysskontaminering av lukt mellom underlag. - Sjekk om alkoholen har fordampet helt fra kryssene. Legg deretter fire petriskåler (en av hver type kjøtt på varmeputen og de to andre av varmeputens overflate) ytterst på hver arm av korset (figur 4). Lukk kryssene med lokkene og la underlagene varme i ca. 10 minutter.
MERK: I tillegg, for å unngå posisjonsskjevheter, varier plasseringen av de forskjellige kjøtttypene i kryssene. For eksempel skal noen krysninger ha samme type kjøtt på tilstøtende armer, mens i andre kryss skal samme kjøtttype stå overfor hverandre, som vist i figur 4.
- Forbered fire petriskåler (60 mm x 15 mm) per kryss med 5 g 5 dager gammelt råttent eller ferskt kjøtt (to av hver type underlag).
- Kvinnelig test
- Samle drektige hunner i flueburet og isoler dem i individuelle rør.
MERK: Gravide kvinner er preget av å ha en forstørret og hvitaktig-gul mage i motsetning til ikke-gravide kvinner (figur 5). Drektige hunner ble samlet inn mellom 10 og 16 dager etter at forsøkene dukket opp. - Kontroller temperaturen på underlagene i kryssene (kald side: 25 ± 2 °C; hot side: 33 ± 2 °C) ved hjelp av et infrarødt termometer.
MERK: Akkurat som i larvetesten, forblir varmeputen på under hele forsøkets lengde. Temperaturmålinger ble gjort i begynnelsen og slutten av forsøket. Selv om temperaturen varierte med ± 2 °C, var det fortsatt minst 8 °C temperaturforskjell mellom varme og kalde forhold. - Plasser røret opp ned med en kvinnelig kvinne i åpningen i midten av hvert kors. Etter at kvinnen kommer inn i korset, fjern røret og lukk åpningen med det lille lokket. Etter å ha lukket alle kryssene, plasser en svart papp foran på hyllen for å omslutte det eksperimentelle oppsettet. La eksperimentet løpe i 4 timer.
- Deretter fjerner du kvinnen ved å fange den forsiktig med et rør, og kontroller om det var egg på underlagene.
- Identifiser lokket på hver petriskål med substrattype fra hvert kryss. Bruk 70% etanol til å rengjøre kryssene (inne i korset og lokket) fra lukt fra testen.
MERK: Hvis eggene ikke kan telles rett etter forsøket, kan petriskålene med substrater lagres ved -20 °C.
- Samle drektige hunner i flueburet og isoler dem i individuelle rør.
- Eggtelling
MERK: Hvis underlagene i petriskålene var frosne, tine dem før telling.- Bruk et stereomikroskop for å telle antall egg som legges i hvert substrat. Bruk en børste og vann for å skille eggene for å telle dem.
3. Dataanalyse og statistikk
- Beregning av preferanseindekser
- For hver replikasjon av larvetester (n = 36) og hunntester (n = 30) beregner du preferanseindeksen for kjøtt (betegnet som PI-kjøtt) ved å bestemme forholdet mellom larver eller egg som finnes på ferske substrater (fersk varm og frisk kulde) til det totale antallet larver eller egg på alle underlag (fersk varm + fersk kulde + råtten varm + råtten kulde).
PIkjøtt = (# larver eller egg på ferske underlag) / # Totalt larver eller egg
MERK: Betegnelsene "varmt" og "kaldt" indikerer temperaturforhold på henholdsvis 33 ± 2 °C og 25 ± 2 °C. - På samme måte beregner du preferanseindeksen for temperatur (PItemp) for hver replikat av larve- og hunntester som antall larver eller egg som finnes på varme substrater (fersk varm og råtten varm) delt på totalt antall larver eller egg på alle underlag (fersk varm + frisk kulde + råtten varm + råtten kulde).
PItemp = (# larver eller egg på Hot substrates) / # Totalt larver eller egg
MERK: Verdier nær 1 gjenspeiler en preferanse for ferske eller varme substrater, og verdier nær null indikerer en preferanse for råtne eller kalde substrater. PIene kan beregnes manuelt eller ved hjelp av koden som følger med (tilleggsfiler S1 og tilleggsfiler S2).
- For hver replikasjon av larvetester (n = 36) og hunntester (n = 30) beregner du preferanseindeksen for kjøtt (betegnet som PI-kjøtt) ved å bestemme forholdet mellom larver eller egg som finnes på ferske substrater (fersk varm og frisk kulde) til det totale antallet larver eller egg på alle underlag (fersk varm + fersk kulde + råtten varm + råtten kulde).
- Sammenligning av observert preferanse for simulerte tilfeldige data
- Kjør den medfølgende koden (tilleggsfil S1 og tilleggsfil S1) for å generere de simulerte dataene og sammenligne dem med de observerte dataene.
MERK: Denne koden genererer 1000 simulerte tilfeldige datasett for larver og hunner og beregner preferanseindeksene (PI) for hver replikasjon av de simulerte og de observerte dataene til L. cuprina. Simuleringene forutsetter at både larver og hunner ikke viser substratpreferanse og gjør tilfeldige valg. Simuleringene inkorporerer viktige atferdsaspekter hos dyrene, som omfatter ulike scenarier som: sannsynligheten for at larver ikke velger noe substrat, og voksne hunner konsentrerer eggleggingen på et enkelt substrat eller fordeler eggene sine enten jevnt eller ikke mellom forskjellige substrater. Generaliserte lineære modeller (GLM, familie: kvasibinomisk; lenke: logit) ble brukt til å sammenligne de observerte dataene fra atferdsanalysene med de simulerte tilfeldige dataene. Den anvendte GLM var godt egnet for denne analysen på grunn av Preferanseindeksens (PI) avgrensede natur, som varierte mellom 0 og 1. GLM er flinke til å håndtere ikke-normalfordelte responsvariabler og gir mulighet for robuste statistiske sammenligninger. Dette valget muliggjorde meningsfull innsikt ved å gjøre det mulig å effektivt sammenligne observerte data fra atferdsanalyser med komplekse mønstre generert av simulerte tilfeldige data. Mindre justeringer av koden kan være nødvendig for andre strukturerte datasett.
- Kjør den medfølgende koden (tilleggsfil S1 og tilleggsfil S1) for å generere de simulerte dataene og sammenligne dem med de observerte dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere effektiviteten av de presenterte metodene ble forsøkene utført ved hjelp av en laboratoriepopulasjon av Lucilia cuprina (familie: Calliphoridae), en fakultativ parasittisk blowfly2. Hele rådatasettet som er oppnådd for denne arten, finnes i tilleggsfil S3 med resultatene for larve- og hunnsubstratpreferansetestene. For å vurdere om larver og hunner viser en preferanse for noe substrat, ble de observerte dataene sammenlignet med 1000 simulerte datasett, som hver representerer et tilfeldig valg (se kode i tilleggsfil S1). Andel statistisk signifikante sammenlikninger (p < 0,05) ble brukt som mål for å vurdere preferanse. Fra denne analysen var det tydelig at larver viste en markert preferanse for det råtne substratet ved 25 °C (figur 6A, tabell 1), da alle 1000 sammenligninger mellom de observerte dataene og hvert av de simulerte tilfeldige valgdatasettene ble funnet signifikant forskjellige for kjøtt- og temperaturforholdene. På samme måte viste hunnene også en merkbar preferanse for 25 °C: 69,7 % av sammenligningene mellom de observerte dataene og det tilfeldige valget ble funnet signifikant forskjellige (figur 6B, tabell 1). Imidlertid var deres preferanse for råttent kjøtt mer nyansert (figur 6B, tabell 1), da bare 27,1% av de observerte versus tilfeldige valgsammenligningene var signifikante. En annen observasjon fra denne studien var at larver av L. cuprina vanligvis gjorde et raskt valg og gravde seg ned i kjøttsubstratet i løpet av de første 2 minuttene av forsøket. De endret sjelden til en annen tilstand i løpet av 10 minutters eksperimentet.
Figur 1: Larvefôringspreferanseskjæremønster for petriskåler med agar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Toppvisningsdiagram over utformingen av larvefôringsanalysen. Valgene var tilfeldig plassert, og testene ble utført ved RT (25 ± 2 °C). Det svarte rektangelet representerer varmeputen, som holder temperaturer på 33 ± 2 °C. Røde og blå sirkler representerer ferskt kjøtt supplert med fortynnet blod (50%) og råttent kjøtt supplert med vann, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Diagram som illustrerer hvordan larvens eksperimentelle oppsett kan plasseres under lyskilden for å unngå skjevheter mot eller mot lys. Lyskilden som ble brukt var hvitt lavvarmeavgivende lys (neonrør). Varmeputen ble plassert på et bord rett under taklampen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Toppvisningsdiagram over utformingen av preferanseanalysen for hunnoviposisjon. Valgene var tilfeldig plassert, og testene ble utført ved RT (25 ± 2 °C). Det svarte rektangelet representerer varmeputen som holder temperaturen på 33 ± 2 °C. Røde sirkler representerer ferskt kjøtt med fortynnet blod (50%) og blå sirkler, rått kjøtt med vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fotografi av en gravid (høyre) versus en ikke-gravid (venstre) kvinne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Gjennomsnittlig preferanseindeks (PI) for kjøtttype og temperatur for larver (A) og hunner (B) vist på kartesisk plan. De svarte sirklene representerer gjennomsnittlige PIer som tar hensyn til alle eksperimentelle replikater (n = 36 for larver og n = 30 for kvinnelige eksperimenter) oppnådd for L. cuprina. Hver av de grå sirklene angir gjennomsnittlig PI for kjøtt og temperatur i et simulert datasett med lignende egenskaper som det observerte datasettet (f.eks. samme antall replikater), men representerer et tilfeldig valg. De fargede rutene fungerer som et visuelt hjelpemiddel for å vise PI-preferanseområdene for hvert av de fire valgene, med blått som indikerer råttent kjøtt ved 25 ± 2 °C, grønt som råttent kjøtt ved 33 ± 2 °C, gult som ferskt kjøtt ved 25 ± 2 °C og oransje som ferskt kjøtt ved 33 ± 2 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Stadium | Sammenligning | Viktige sammenligninger for PImeat | Viktige sammenligninger for PItemp |
| Larver | Simulert vs. nullhypotese (p < 0,05) | 3.8% | 2.1% |
| Observert vs. simulert (p < 0,05) | 100.0% | 100.0% | |
| Kvinner | Simulert vs. nullhypotese (p < 0,05) | 3.3% | 4.6% |
| Observert vs. simulert (p < 0,05) | 27.1% | 69.7% |
Tabell 1. Prosentandel av signifikant PIkjøtt og PItemp (p-verdier < 0,05) av sammenligningene mellom (i) de simulerte tilfeldige dataene (ingen preferanse) og den statistiske nullhypotesen, og (ii) de observerte dataene og de simulerte tilfeldige dataene. Resultatene presenteres separat for larver og kvinner.
Tilleggsfil S1: Kode som brukes til dataanalyse og statistikk i R-markdown. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil S2: Rapport fra den statistiske analysen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil S3: Råtellinger av Lucilia cuprina for larve- og hunnpreferanse på hvert av de fire substratvalgene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å forstå utviklingen av fôringsvaner, spesielt i sammenheng med parasittisme hos blåfluer, krever undersøkelse av substratpreferanser gjennom ulike livsstadier for fôring eller oviposisjon. Derfor ble det i denne studien foreslått robuste og enkle metoder for å undersøke substratpreferanser hos larver og hunner av blåfluer. Disse metodene ble testet i Lucilia cuprina, en fakultativ parasittisk blowfly2. Interessant nok avslørte eksperimentene en tydelig tilbøyelighet til råttent kjøtt ved 25 ° C blant L. cuprina larver, i samsvar med forhold som vanligvis brukes av nekrofagøse arter. Dette skilte seg fra en studie av Fouche et al40, som viste en preferanse for ferskt leversubstrat i Lucilia sericata og Calliphora vicina og viste at det råtne substratet påvirket overlevelse og vekst negativt. Det er imidlertid vanskelig å sammenligne resultatene fra begge studiene, da graden av kjøttråte (syv dager versus fem i vårt tilfelle) og nedbrytningsprosessen (rent anaerob versus aerob og anaerob i vårt tilfelle) var forskjellig. Artene som ble brukt var også forskjellige. I tillegg indikerte observasjoner fra forsøkene som ble presentert her at hunnene foretrakk å legge eggene sine ved 25 °C, mens de bare viste en liten preferanse for råttent kjøtt. Disse resultatene viser at larver og hunnvalg ikke er det samme, og at hunnene viser et mer variert valg for valg av oviposisjonssted enn larvene for graving og matvalg. Dette antyder at den parasittiske vanen i L. cuprina ledes av endringer i det kvinnelige oviposisjonsvalget og ikke av larvefôringspreferanse. Spesielt tjener disse funnene som en proof-of-concept demonstrasjon av effektiviteten og nytten av metodene for å belyse livsstilen til blowflies på ulike utviklingsstadier.
Distinkte kjøtt- og temperaturforhold ble brukt til å etterligne parasittiske og nekrofagøse livsstilsfaktorer. Denne tilnærmingen gjorde det lettere å evaluere larvefôring og hunnens oviposisjonspreferanser i en firevalgsanalyse, ved hjelp av to samvirkende faktorer. De vedtatte protokollene representerer en tilnærming som avviker fra den tradisjonelle tovalgsteknikken som vanligvis brukes i tidligere studier 43,44,45,46,47,48,49,50. For å minimere variasjoner som følge av miljøfaktorer som kan påvirke atferd, for eksempel lys-, visuelle- eller luktsignaler, ble strenge kontrolltiltak implementert. Ensartet og konsistent belysning ovenfra ble opprettholdt i analysene for å unngå skjevheter mot eller mot lys, supplert med bruk av svart bakgrunn for å forhindre potensielle visuelle signalers innvirkning på larver og kvinnelige preferanser. Videre ble risikoen for krysskontaminering mellom råtne og ferske kjøttsubstrater unngått ved å bruke glass eller engangs plastmateriale, hansker og separate redskaper. Anvendelsen av disse tiltakene viste seg å være avgjørende for å etablere et kontrollert og pålitelig eksperimentelt rammeverk, og dermed sikre robustheten og påliteligheten til de oppnådde resultatene.
Larveeksperimentets design var lik tidligere beskrevne tovalgsanalyser40,42, med tilpasninger gjort for å innlemme temperaturfaktoren. Larveprotokollen beskrevet her viste seg å være rask, robust og grei, gitt at larvene viste en sterk tendens til å forbli gravd innenfor det valgte substratet, og dermed eliminere muligheten for tvetydige scoringsproblemer som følge av bytte av substrater på slutten av forsøket. Denne spesielle funksjonen gjør det mulig for eksperimentøren å utføre seks eller flere replikater samtidig uten risiko for uklare eller usikre resultater. Selv om tilstedeværelsen av flere larver i samme replikat kan påvirke individuelle valg, tillater protokollen vurdering av generell substratpreferanse gjennom uavhengige replikater. I scenarier der mulig aggregert atferd må unngås eller kontrolleres, kan individuell testing eller inkorporering av kontrolleksperimenter for å ta hensyn til potensielle påvirkninger mellom larver implementeres for å motvirke eventuelle skjevheter.
På den annen side gir den kvinnelige oviposisjonspreferanseprotokollen den bemerkelsesverdige fordelen av å vurdere det individuelle valget uavhengig, fri for påvirkning av andre kvinners preferanser, og dermed unngå aggregert oppførsel. Faktisk er det kjent at kalliforid kvinnelig oviposisjonsvalg kan påvirkes av tilstedeværelsen av konspesifikke fluer46,47. Likevel er det viktig å erkjenne den iboende begrensningen av den eksperimentelle analysen. Egg kan ikke legges innenfor 4-timers eksperimentelt vindu på grunn av uegnede forhold eller, mer sannsynlig, hunnens umodenhet. Denne usikkerheten resulterer i en delmengde av replikatene uten egg lagt (78% av forsøkene). Videre introduserer det store spekteret i antall egg lagt i hver replikat (26 til 208, gjennomsnittlig ± standardavvik = 132,4 ± 46,2) betydelig variasjon, noe som gjør det utfordrende å skille mellom variasjoner drevet av hunnens preferanse og de som påvirkes av faktorer som begrensede eggreserver eller sen egglegging under forsøket. Til tross for disse begrensningene er de foreslåtte protokollene egnet til effektivt å vurdere oviposisjonspreferanse.
Samlet sett har de utviklede protokollene betydelig potensial for et bredt spekter av applikasjoner for å studere blowfly-oppførsel. For det første kan disse testene brukes til å undersøke effekten av ulike behandlinger, for eksempel forskjellige dyrehold eller utviklingsforhold, på larve- eller hunnpreferanser innen samme art. Dette kan potensielt avdekke de underliggende mekanismene som driver atferdspreferanser og deres genetiske grunnlag, spesielt når de kombineres med sekvenseringsteknikker. Videre kan disse testene utvides til å undersøke substratpreferansene til forskjellige blowfly-arter, noe som gir verdifull innsikt i utviklingen av parasittisme i denne gruppen. Ved å dykke inn i de ulike preferansene som blåfluer viser, kan man få en dypere forståelse av deres økologiske tilpasninger, noe som gir verdifull kunnskap for fremtidig forvaltning og kontroll av skadedyrsarter.
Til slutt strekker potensialet i protokollene seg utover studiet av blowflies alene. Med mindre modifikasjoner kan disse protokollene lett brukes til å vurdere fluearter fra andre familier, for eksempel husfluer og kjøttfluer, eller til og med insekter av tilsvarende størrelse. Tilpasningsevnen til protokollene gjør det også mulig å velge forskjellige substrater for å matche målene for spesifikke vitenskapelige undersøkelser. For eksempel kan forskere endre graden av kjøttforfall eller erstatte storfekjøtt med alternative animalske kilder (f.eks. Fisk, svinekjøtt) eller ikke-animalske substrater (f.eks. Frukt) for å løse ulike økologiske spørsmål. Disse tilpasningene forbedrer ikke bare allsidigheten til protokollene, men muliggjør også utforskning av preferanser i et bredt spekter av insektarter og økologiske sammenhenger, og forbedrer dermed kapasiteten til å belyse grunnleggende aspekter ved insektadferd og økologisk tilpasning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen erklærte.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim og Lucas de Almeida Carvalho for å ha levert L. cuprina-kolonien og for deres hjelp med å sette opp eksperimentet. Vi vil også takke Rafael Barros de Oliveira for filming og redigering av videoen. Denne forskningen ble støttet av Developing Nation Research Grant fra Animal Behavior Society til VASC og av et FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo stipend til TT (20/05636-4). ST og DLF ble støttet av en FAPESP (henholdsvis 19/07285-7 postdoktorstipend og 21/10022-8 PhD-stipend). V.A.S.C. og A.V.R. ble støttet av CNPq PhD-stipend (henholdsvis 141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. ble støttet av CNPq (310906/2022-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
References
- Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
- Zumpt, F. Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , Butterworths. London. (1965).
- Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
- Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
- Mullen, G. R., Durden, L. A. Medical and veterinary entomology. , Academic press. (2009).
- Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
- World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , Paris. (2013).
- Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45 (2018).
- Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30 (2016).
- Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551 (2020).
- Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
- Greenberg, B.
- Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
- Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
- McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
- Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
- Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230 (2021).
- Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
- Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598 (2016).
- Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
- Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
- Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
- Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
- Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
- Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
- Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
- Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
- Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
- Smith, K. G. V. A manual of forensic entomology. , Cornell University Press. UK. (1986).
- Goff, M. L. A Fly for the Prosecution. , Harvard University Press. Cambridge, MA and London, England. (2001).
- CRC Press. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , CRC Press. Boca Raton. (2001).
- Greenberg, B., Kunich, J. C. Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
- Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
- Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
- Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
- Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
- Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
- Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791 (2021).
- Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
- Boulay, J., Deneubourg, J. -L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676 (2016).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
- Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
- Yang, S. -T., Shiao, S. -F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
- Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
- Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
- Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420 (2017).
- Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).
