Summary
Neste trabalho, são detalhados dois protocolos para avaliação da fonte alimentar e preferências de oviposição em larvas e fêmeas de moscas-varejeiras. Estes compreendem quatro opções com dois fatores interagentes: tipo de substrato e temperatura. Os ensaios permitem determinar a preferência da fonte alimentar das larvas e a preferência do sítio de oviposição para as fêmeas.
Abstract
As moscas-varejeiras (Diptera: Calliphoridae) apresentam uma ampla variedade de estilos de vida larval, tipicamente classificados como parasitismo obrigatório, parasitismo facultativo e sapro-necrofagia completa. Várias espécies parasitárias, obrigatórias e facultativas, são consideradas de importância sanitária e econômica, pois suas larvas podem causar miíase (infestação de larvas em tecidos vivos). No entanto, vale ressaltar que a fêmea adulta desempenha um papel decisivo na escolha do local de oviposição e, portanto, determina em grande parte o hábito alimentar e as condições de desenvolvimento das larvas. Neste estudo, dois protocolos são propostos para testar a preferência alimentar das larvas e a preferência do local de oviposição das fêmeas, considerando dois fatores que interagem: tipo de substrato da carne e temperatura. Os dispositivos aqui apresentados permitiram testar larvas e fêmeas grávidas de Lucilia cuprina em um ensaio de quatro escolhas com duas temperaturas (33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C) e dois tipos de substratos cárneos (carne fresca suplementada com sangue e carne podre de 5 dias de idade). Larvas ou fêmeas grávidas podem optar por escavar ou colocar seus ovos, respectivamente, em qualquer um dos seguintes: carne podre a 25 °C (simulando uma condição de espécie necrófaga), carne fresca suplementada com sangue a 33 °C (simulando uma condição de espécie parasita) e dois controles, carne podre a 33 °C ou carne fresca suplementada com sangue a 25 °C. A preferência é avaliada contando-se o número de larvas ou ovos postos em cada opção para cada repetição. A comparação dos resultados observados com uma distribuição aleatória permitiu estimar a significância estatística da preferência. Os resultados indicaram que as larvas de L. cuprina têm forte preferência pelo substrato podre a 25 °C. Por outro lado, a preferência pelo local de oviposição pelas fêmeas foi mais variada para o tipo de carne. Esta metodologia pode ser adaptada para testar a preferência de outras espécies de insetos de tamanho semelhante. Outras questões também podem ser exploradas usando condições alternativas.
Introduction
As moscas, particularmente os muscóides caliptratos (incluindo moscas-varejeiras, moscas domésticas, moscas-bot e moscas-da-carne, entre outros), exibem uma ampla gama de estilos de vida, englobando comportamentos parasitários e necrossaprófagos1. As espécies parasitárias tipicamente causam miíase, uma infestação de tecidos vivos por larvas (larvas)2. Na família Calliphoridae, tanto as espécies parasitárias obrigatórias quanto as facultativas são as principais pragas pecuárias responsáveis por perdas econômicas e precários de bem-estar animal devido às infestações de larvas 2,3,4,5,6,7. Parasitas obrigatórios, como as bicheiras do Novo Mundo e do Velho Mundo (Cochliomyia hominivorax e Chrysomyia bezziana, respectivamente), são especialmente problemáticos4,7,8,9,10 juntamente com parasitas facultativos, como as moscas-varejeiras (Lucilia cuprina e Lucilia sericata)2,5,6, 7º. Espécies não parasitárias, incluindo as sapronecrófagas, desenvolvem-se em matéria orgânica em decomposição e necrótica e são comumente encontradas em ambientes insalubres. Seu estilo de vida estritamente não parasitário pode ser usado com sucesso para a terapia de larvas, que usa larvas de moscas para limpar feridas de tecidos necróticos11,12,13. As moscas-varejeiras também são utilizadas na ciência forense, pois estão entre os primeiros organismos a localizar e colonizar corpos recentemente falecidos, sendo que as larvas em desenvolvimento servem como meio de estimar o tempo da morte14.
O estilo de vida da mosca-varejeira tem sido objeto de várias pesquisas (e.g.,15,16,17,18,19,20,21) devido à sua importância em relação aos interesses humanos. A compreensão dos mecanismos biológicos que regem o estilo de vida de uma espécie pode fornecer informações valiosas para melhorar os métodos destinados ao controle de espécies-praga. Além disso, a diversidade e a evolução dos estilos de vida das moscas-varejeiras oferecem um contexto ideal para estudar as origens e os mecanismos de características complexas (por exemplo, parasitismo). O parasitismo devido às larvas que se alimentam de tecidos vivos evoluiu independentemente várias vezes dentro da família Calliphoridae22,23. No entanto, a história evolutiva dos hábitos alimentares das moscas-varejeiras ainda é pouco conhecida, com estudos restritos ao mapeamento dos hábitos ao longo de filogenias (e.g.,16,19,22) sem o auxílio de ensaios funcionais. Por exemplo, é incerto se os parasitas obrigatórios evoluíram de generalistas (isto é, parasitas facultativos) ou diretamente de espécies necrófagas. Os processos moleculares, fisiológicos e comportamentais que acompanham as mudanças evolutivas no estilo de vida também são amplamente desconhecidos.
Nesse contexto, parasitas facultativos, como a mosca-varejeira Lucilia cuprina, que podem se desenvolver como parasitas em um hospedeiro ou como necrófagos em cadáveres, oferecem a possibilidade de explorar os fatores e mecanismos que controlam as escolhas de estilo de vida. Lucilia cuprina é uma espécie cosmopolita conhecida por causar moscas de ovelhas, especialmente na Austrália, onde é considerada uma praga 3,16. A miíase por L. cuprina também pode ocorrer em outros animais de criação, animais de estimação e humanos 3,24,25,26,27,28,29,30. No entanto, suas larvas também podem se desenvolver em tecidos necróticos e matéria em decomposição e esta espécie tem sido usada com sucesso em entomologia forense por ser muito rápida para localizar e colonizar cadáveres31,32,33,34. Embora o estilo de vida parasitário versus não parasitário das moscas-varejeiras seja definido pelo estágio larval, é a fêmea adulta que seleciona o local de oviposição. Consequentemente, a fêmea adulta influencia fortemente o estilo de vida das larvas, uma vez que estas têm mobilidade limitada. No entanto, a escolha da fêmea não implica necessariamente que as larvas prefiram o mesmo substrato quando apresentadas com uma escolha35. Uma hipótese é que mudanças comportamentais que levam as fêmeas a colocar seus ovos em tecidos vivos poderiam ter sido parte de uma mudança precoce para um estilo de vida parasitário. Pré-adaptações ou capacidades fisiológicas das larvas resultantes teriam sido essenciais para o seu desenvolvimento bem-sucedido no tecido vivo, levando ao surgimento do estilo de vida parasitário. Como tal, os processos afetados e selecionados podem não necessariamente se alinhar entre as duas fases da vida.
Neste contexto, dois métodos foram desenvolvidos para testar a preferência comportamental em moscas-varejeiras, em particular, para L. cuprina, em relação ao substrato alimentar larval (ensaio de preferência larval) e ao local de oviposição (ensaio de preferência de fêmeas). Esses métodos levam em conta dois fatores que interagem: temperatura e frescor da carne. A temperatura foi escolhida como fator crucial, uma vez que a maioria dos casos de miíase ocorre em animaishomeotérmicos2. Assim, uma temperatura de 33 °C foi selecionada como proxy para o "fator de estilo de vida parasitário", enquanto uma temperatura de 25 °C (temperatura ambiente) representa o "fator não parasitário". A temperatura de 25 °C foi escolhida por ser representativa da temperatura média anual registrada no Brasil (Instituto Nacional de Meteorologia, INMET). Adicionalmente, dois tipos de substratos cárneos foram considerados, ambos de origem bovina: (i) carne fresca suplementada com sangue, mimetizando o substrato para o estilo de vida parasitário, que é utilizado para criar a mosca-varejeira parasita Co. hominivorax em condições de laboratório36, e (ii) carne podre de 5 dias de idade, emulando o substrato para o estilo de vida necrófago. O substrato bovino é comumente utilizado para criar L. cuprina em condições de laboratório27,37,38,39 por oferecer diversas vantagens em termos de disponibilidade, custo-benefício e praticidade, além de ser um substrato ecologicamente justificável. Outros estudos40,41 comparando o efeito de substratos podres versus frescos em moscas-varejeiras utilizaram substrato podre com 7 dias de idade (em condições anaeróbias) e mostraram um efeito adverso do substrato podre sobre as taxas de desenvolvimento, sobrevivência e crescimento. Como L. cuprina é conhecida por colonizar cadáveres frescos que geralmente são expostos ao ar, resolvemos usar carne podre de 5 dias de idade (carne moída) em vasos não herméticos (decomposição aeróbia e anaeróbia) para mimetizar um substrato necrófago.
Os desenhos experimentais aqui apresentados oferecem a vantagem de discernir preferências por fatores individuais, bem como seus efeitos combinados. Além disso, os fenótipos pontuados, a saber, a escolha do substrato alimentar larval e o número de ovos colocados, são diretamente relevantes para os aspectos biológicos e ecológicos das espécies de moscas-varejeiras. A adequação desses protocolos é destacada pela demonstração de sua eficácia em L. cuprina. Adicionalmente, é fornecido um roteiro de análise estatística, que pode ser utilizado para comparar os resultados observados obtidos em L. cuprina com dados aleatórios simulados, garantindo análises e interpretações estatísticas robustas.
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Protocol
As amostras de moscas foram obtidas utilizando-se armadilhas e não em animais infestados. Uma licença SISBIO (67867-1) foi emitida para coletar e manter moscas da família Calliphoridae em cativeiro em condições de laboratório. Amostras de insetos são isentas de avaliação ética em pesquisas no Brasil. Carne e sangue bovinos foram obtidos comercialmente, e nenhuma autorização ética foi necessária.
1. Preferência alimentar das larvas
- Preparo das placas de Petri contendo ágar 2%
- Prepare quatro pratos de Petri com 2% de ágar. Para isso, adicione 6 g de ágar bacteriológico a 300 mL de água e derreta essa mistura no micro-ondas. Em seguida, divida o volume uniformemente em quatro placas de Petri de vidro (150 x 20 mm), utilizando cerca de 70 mL em cada placa.
OBS: Preparar placas de Petri igual ao número de repetições experimentais desejadas. Neste estudo, foram utilizadas 36 repetições. - Uma vez solidificado o ágar, utilizar um tubo cônico de 50 mL (3 cm de diâmetro) para perfurar quatro orifícios no ágar, dois de cada lado da placa de Petri, seguindo o padrão de corte fornecido (Figura 1).
NOTA: Esta configuração é semelhante aos protocolos descritos anteriormente por Fouche et al (2021)40 e Boulay et al (2016)42.
- Prepare quatro pratos de Petri com 2% de ágar. Para isso, adicione 6 g de ágar bacteriológico a 300 mL de água e derreta essa mistura no micro-ondas. Em seguida, divida o volume uniformemente em quatro placas de Petri de vidro (150 x 20 mm), utilizando cerca de 70 mL em cada placa.
- Preparo de substratos
- Para preparar a carne fresca com sangue, adicione 12 ml de sangue bovino diluído a 200 g de carne fresca moída de bovino. Homogeneizar. Certifique-se de usar cilindros e colheres graduadas diferentes para cada tipo de carne para evitar a contaminação cruzada entre substratos.
NOTA: O sangue diluído é composto por 50% de sangue puro misturado com um anticoagulante (3,8% de citrato de sódio) e 50% de água filtrada. - Para preparar o substrato podre, adicione 12 mL de água filtrada a 200 g de carne bovina moída podre de 5 dias e misture bem.
OBS: A carne podre foi obtida incubando-se a carne moída fresca por cinco dias a 25 °C em potes plásticos não herméticos (mistura de decomposição aeróbia e não aeróbia). Cada pote continha 200 g de carne moída fresca. Em seguida, foi congelado até o uso. - Preencha dois buracos em cada placa de Petri com a mistura de carne fresca e sangue e os dois buracos restantes com a mistura de carne podre e água.
OBS: Para evitar vieses de posição, varie a colocação dos diferentes tipos de carne nas placas de Petri. Por exemplo, algumas placas de Petri devem ter o mesmo tipo de carne voltada uma para a outra, enquanto em outros pratos, o tipo de carne deve ser cruzado, como mostra a Figura 2.
- Para preparar a carne fresca com sangue, adicione 12 ml de sangue bovino diluído a 200 g de carne fresca moída de bovino. Homogeneizar. Certifique-se de usar cilindros e colheres graduadas diferentes para cada tipo de carne para evitar a contaminação cruzada entre substratos.
- Arranjo experimental
- A uma temperatura ambiente (TR) de 25 °C, posicione a almofada de aquecimento diretamente abaixo de uma fonte de luz para iluminar uniformemente a área experimental e evitar qualquer viés de comportamento em direção ou contra a luz. Coloque almofadas de cartão ao redor da almofada de aquecimento para garantir que a configuração experimental permaneça nivelada.
NOTA: A fonte de luz utilizada foi a luz branca de baixa emissão de aquecimento, como um tubo de néon. A almofada térmica foi posicionada sobre uma mesa logo abaixo das lâmpadas de teto (Figura 3). - Cubra a almofada de aquecimento e as almofadas de cartão niveladoras com cartão preto e ligue a almofada de aquecimento.
NOTA: A capa de papelão preta deve ser usada para evitar sinais visuais que possam enviesar o ensaio de comportamento. - Coloque seis placas de Petri com ágar e substrato de carne sobre o papelão preto com dois substratos, um de cada tipo, sobre a almofada de aquecimento e os outros dois fora da superfície da almofada de aquecimento (Figura 2). Deixe os substratos aquecerem por aproximadamente 10 min.
NOTA: Pode formar-se condensação na tampa das placas de Petri.
- A uma temperatura ambiente (TR) de 25 °C, posicione a almofada de aquecimento diretamente abaixo de uma fonte de luz para iluminar uniformemente a área experimental e evitar qualquer viés de comportamento em direção ou contra a luz. Coloque almofadas de cartão ao redor da almofada de aquecimento para garantir que a configuração experimental permaneça nivelada.
- Teste larval
- Verifique a temperatura dos substratos (lado frio: 25 ± 2 °C; lado quente: 33 ± 2 °C) com um termômetro infravermelho.
NOTA: A almofada de aquecimento permanece ligada durante toda a duração do experimento. As medições de temperatura foram realizadas no início e no final do experimento. Embora a temperatura tenha flutuado em ± 2 °C, ainda havia pelo menos uma diferença de temperatura de 8 °C entre as condições quente e fria. - Após atingir a temperatura desejada, colocar cinco larvas de terceiro ínstar no centro de cada placa de Petri com uma pinça (Figura 2) e cobrir as placas de Petri com as tampas. Deixe o experimento de escolha durar 10 min.
NOTA: Algumas larvas podem rastejar ao redor das bordas e na tampa das placas de Petri. Se alguma larva escapar, use uma pinça para colocá-la de volta ao centro da placa de Petri. - Após 10 min, retire todas as placas de Petri da almofada de aquecimento e coloque-as em uma superfície diferente para evitar continuar aquecendo os substratos. Em seguida, conte o número de larvas em cada substrato, bem como aquelas que não escolheram nenhum substrato.
OBS: Larvas de Lucilia cuprina permanecem no substrato escolhido, como observado neste experimento.
- Verifique a temperatura dos substratos (lado frio: 25 ± 2 °C; lado quente: 33 ± 2 °C) com um termômetro infravermelho.
2. Preferência do local de oviposição das fêmeas
- Arranjo experimental
- Use uma prateleira comum previamente coberta com papelão preto e uniformemente iluminada com tiras de luz LED brancas.
NOTA: As capas de papelão pretas devem ser usadas para evitar sinais visuais que possam enviesar o ensaio de comportamento. As tiras de LED brancas são fixadas longitudinalmente no meio da prateleira logo acima do experimento. As prateleiras utilizadas na montagem foram colocadas a 45 cm de distância. - Em RT (25 °C), coloque uma almofada de aquecimento no centro da prateleira. Use almofadas de papelão ao redor da almofada de aquecimento como suporte para garantir que a configuração experimental seja nivelada.
- Cubra a almofada de aquecimento e as almofadas de cartão niveladoras com um cartão preto para manter o mesmo padrão visual abaixo de todos os substratos.
- Coloque dois recipientes de vidro em forma de cruz em uma prateleira, cada um deve ter dois braços sobre o papelão preto e a almofada de aquecimento. Ligue as tiras de luz LED brancas e as almofadas de aquecimento antes do início do experimento.
- Use etanol 70% para limpar as cruzes (dentro da cruz e da tampa) para evitar a contaminação do odor.
- Use uma prateleira comum previamente coberta com papelão preto e uniformemente iluminada com tiras de luz LED brancas.
- Preparo de substratos
- Prepare quatro placas de Petri (60 mm x 15 mm) por cruz com 5 g de carne podre ou fresca de 5 dias (duas de cada tipo de substrato).
OBS: Preparar placas de Petri igual ao número de repetições experimentais desejadas vezes quatro. Neste estudo foram utilizadas 30 repetições, totalizando 120 placas de Petri preparadas. - Adicionar 1 ml de sangue bovino diluído (50% de sangue puro com anticoagulante e 50% de água filtrada) à carne fresca e 1 ml de água filtrada à carne podre. Misture bem a carne (fresca ou podre) com o líquido (sangue ou água) usando uma colher diferente para cada tipo de carne.
NOTA: O preparo da carne para o ensaio de fêmeas é muito semelhante ao ensaio de larvas, embora as quantidades sejam diferentes, pois o teste de fêmeas será executado por mais tempo do que o teste de larvas. Lembre-se de usar pontas e colheres de pipeta diferentes para cada tipo de carne para evitar qualquer contaminação cruzada de odor entre os substratos. - Verifique se o álcool evaporou completamente das cruzes. Em seguida, coloque quatro placas de Petri (uma de cada tipo de carne na almofada de aquecimento e as outras duas fora da superfície da almofada de aquecimento) na extremidade de cada braço da cruz (Figura 4). Feche as cruzes com suas tampas e deixe os substratos aquecerem por aproximadamente 10 min.
OBS: Além disso, para evitar vieses de posicionamento, varie a colocação dos diferentes tipos de carne nos cruzamentos. Por exemplo, algumas cruzes devem ter o mesmo tipo de carne nos braços adjacentes, enquanto em outras cruzes, o mesmo tipo de carne deve estar em frente um do outro, como mostrado na Figura 4.
- Prepare quatro placas de Petri (60 mm x 15 mm) por cruz com 5 g de carne podre ou fresca de 5 dias (duas de cada tipo de substrato).
- Teste feminino
- Coletar fêmeas grávidas na gaiola de mosca e isolá-las em tubos individuais.
NOTA: As fêmeas grávidas são caracterizadas por terem um abdome aumentado e amarelo-esbranquiçado em contraste com as fêmeas não grávidas (Figura 5). Fêmeas grávidas foram coletadas entre 10 e 16 dias após a emergência para os experimentos. - Verifique a temperatura dos substratos nas cruzes (lado frio: 25 ± 2 °C; lado quente: 33 ± 2 °C) usando um termômetro infravermelho.
NOTA: Assim como no teste larval, a almofada de aquecimento permanece ligada durante toda a duração do experimento. As medidas de temperatura foram realizadas no início e no final do experimento. Embora a temperatura tenha flutuado em ± 2 °C, ainda havia pelo menos uma diferença de temperatura de 8 °C entre as condições quente e fria. - Coloque o tubo de cabeça para baixo contendo uma fêmea grávida na abertura no centro de cada cruz. Depois que a fêmea entrar na cruz, retire o tubo e feche a abertura com sua pequena tampa. Após fechar todas as cruzes, coloque um papelão preto na frente da prateleira para fechar o arranjo experimental. Deixe o experimento durar 4 h.
- Depois disso, retire a fêmea, pegando-a cuidadosamente com um tubo, e verifique se havia ovos nos substratos.
- Identifique a tampa de cada placa de Petri com o tipo de substrato de cada cruz. Use etanol 70% para limpar as cruzes (dentro da cruz e da tampa) de qualquer odor do teste.
NOTA: Caso os ovos não possam ser contados logo após o experimento, as placas de Petri com substratos podem ser armazenadas a -20 °C.
- Coletar fêmeas grávidas na gaiola de mosca e isolá-las em tubos individuais.
- Contagem de ovos
OBS: Se os substratos das placas de Petri foram congelados, descongele-os antes da contagem.- Use um estereomicroscópio para contar o número de ovos postos em cada substrato. Use uma escova e água para ajudar a separar os ovos para contá-los.
3. Análise de dados e estatística
- Cálculo de índices de preferência
- Para cada repetição de testes de larvas (n = 36) e fêmeas (n = 30), calcule o Índice de Preferência para carne (designada comocarne PI) determinando a razão entre larvas ou ovos presentes nos substratos frescos (quente fresco e frio fresco) e a contagem total de larvas ou ovos em todos os substratos (quente fresco + frio fresco + quente podre + frio podre).
PIcarne = (# larvas ou ovos em substratos frescos) / # Total de larvas ou ovos
NOTA: Os termos "Quente" e "Frio" são indicativos de condições de temperatura de 33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C, respectivamente. - Da mesma forma, calcule o Índice de Preferência por temperatura (PItemp) para cada repetição de testes de larvas e fêmeas como o número de larvas ou ovos presentes nos substratos quentes (quente fresco e quente podre) dividido pelo número total de larvas ou ovos em todos os substratos (quente fresco + frio fresco + quente podre + frio podre).
PItemp = (# larvas ou ovos em substratos quentes) / # Total de larvas ou ovos
NOTA: Valores próximos de 1 refletem uma preferência por substratos frescos ou quentes e valores próximos a zero indicam uma preferência por substratos podres ou frios. Os PIs podem ser calculados manualmente ou usando o código fornecido (Arquivos suplementares S1 e Arquivos suplementares S2).
- Para cada repetição de testes de larvas (n = 36) e fêmeas (n = 30), calcule o Índice de Preferência para carne (designada comocarne PI) determinando a razão entre larvas ou ovos presentes nos substratos frescos (quente fresco e frio fresco) e a contagem total de larvas ou ovos em todos os substratos (quente fresco + frio fresco + quente podre + frio podre).
- Comparação da preferência observada com dados aleatórios simulados
- Execute o código fornecido (Arquivo Suplementar S1 e Arquivo Suplementar S1) para gerar os dados simulados e compará-los com os dados observados.
NOTA: Este código gera 1000 dados aleatórios simulados para larvas e fêmeas e calcula os Índices de Preferência (PIs) para cada réplica do simulado, e os dados observados de L. cuprina. As simulações partem do princípio de que tanto larvas quanto fêmeas não apresentam preferência por substrato e fazem escolhas aleatórias. As simulações incorporam aspectos comportamentais chave dos animais, englobando vários cenários, tais como: a probabilidade de as larvas não selecionarem nenhum substrato, e as fêmeas adultas concentrarem sua postura de ovos em um único substrato ou distribuírem seus ovos uniformemente ou não entre diferentes substratos. Modelos lineares generalizados (GLM, família: quasibinomial; link: logit) foram utilizados para comparar os dados observados nos ensaios de comportamento com os dados aleatórios simulados. O GLM empregado mostrou-se adequado para esta análise devido à natureza limitada do Índice de Preferência (IP), variando entre 0 e 1. GLMs são hábeis em lidar com variáveis de resposta não normalmente distribuídas e permitem comparações estatísticas robustas. Essa escolha facilitou insights significativos, permitindo comparar efetivamente dados observados de ensaios de comportamento com padrões complexos gerados por dados aleatórios simulados. Pequenos ajustes no código podem ser necessários para outros conjuntos de dados estruturados.
- Execute o código fornecido (Arquivo Suplementar S1 e Arquivo Suplementar S1) para gerar os dados simulados e compará-los com os dados observados.
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Representative Results
Para demonstrar a eficácia dos métodos apresentados, os experimentos foram conduzidos utilizando uma população de laboratório de Lucilia cuprina (família: Calliphoridae), uma mosca-varejeira parasita facultativa2. Todo o conjunto de dados brutos obtidos para esta espécie pode ser encontrado no Arquivo Suplementar S3 com os resultados para os testes de preferência larval e fêmea de substrato. Para avaliar se as larvas e fêmeas apresentam preferência por algum substrato, os dados observados foram comparados com 1000 conjuntos de dados simulados, cada um representando uma escolha aleatória (ver código no Arquivo Suplementar S1). O percentual de comparações estatisticamente significativas (p < 0,05) foi utilizado como medida para avaliar a preferência. A partir desta análise, ficou evidente que as larvas exibiram uma preferência marcada pelo substrato podre a 25 °C (Figura 6A, Tabela 1), uma vez que todas as 1000 comparações entre os dados observados e cada um dos conjuntos de dados simulados de escolha aleatória foram significativamente diferentes para as condições de carne e temperatura. Da mesma forma, as fêmeas também apresentaram uma preferência notável por 25 °C: 69,7% das comparações entre os dados observados e a escolha aleatória foram significativamente diferentes (Figura 6B, Tabela 1). No entanto, sua preferência por carne podre foi mais nuançada (Figura 6B, Tabela 1), pois apenas 27,1% das comparações observadas versus escolha aleatória foram significativas. Outra observação deste estudo foi que as larvas de L. cuprina geralmente fizeram uma escolha rápida e escavaram no substrato de carne nos primeiros 2 min do experimento. Eles raramente mudaram para outra condição durante o experimento de 10 minutos.
Figura 1: Padrão de corte da preferência alimentar das larvas para placas de Petri com ágar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama de visualização superior do layout do ensaio de preferência alimentar de larvas. As escolhas foram posicionadas aleatoriamente, e os testes foram realizados em TR (25 ± 2 °C). O retângulo preto representa a almofada de aquecimento, que mantém as temperaturas em 33 ± 2 °C. Os círculos vermelho e azul representam carne fresca suplementada com sangue diluído (50%) e carne podre suplementada com água, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diagrama ilustrando como posicionar o arranjo experimental larval abaixo da fonte de luz para evitar vieses em direção ou contra a luz. A fonte de luz utilizada foi a branca de baixa aquecimento emissora de luz (tubo de néon). A almofada de aquecimento foi posicionada sobre uma mesa logo abaixo da luz do teto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diagrama de visualização superior do layout do ensaio de preferência de local de oviposição feminina. As escolhas foram posicionadas aleatoriamente, e os testes foram realizados em TR (25 ± 2 °C). O retângulo preto representa a almofada de aquecimento que mantém a temperatura em 33 ± 2 °C. Círculos vermelhos representam carne fresca com sangue diluído (50%) e círculos azuis, carne podre com água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fotografia de uma fêmea grávida (direita) versus uma fêmea não grávida (esquerda). Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 6: Índices de Preferência Médios (IPs) para tipo de carne e temperatura para larvas (A) e fêmeas (B) dispostas em plano cartesiano. Os círculos pretos representam os IP médios levando em consideração todas as repetições experimentais (n = 36 para larvas e n = 30 para experimentos femininos) obtidas para L. cuprina. Cada um dos círculos cinzentos denota os PIs médios para carne e temperatura de um conjunto de dados simulado com características semelhantes ao conjunto de dados observado (por exemplo, mesmo número de repetições), mas representando uma escolha aleatória. Os painéis coloridos servem como um auxílio visual para imaginar as áreas de preferência do IP para cada uma das quatro opções, com azul indicando carne podre a 25 ± 2 °C, verde como carne podre a 33 ± 2 °C, amarelo como carne fresca a 25 ± 2 °C e laranja como carne fresca a 33 ± 2 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Palco | Comparação | Comparações significativas para PImeat | Comparações significativas para PItemp |
| Larvas | Hipótese simulada x hipótese nula (p < 0,05) | 3.8% | 2.1% |
| Observado vs. simulado (p < 0,05) | 100.0% | 100.0% | |
| Fêmeas | Hipótese simulada x hipótese nula (p < 0,05) | 3.3% | 4.6% |
| Observado vs. simulado (p < 0,05) | 27.1% | 69.7% |
Tabela 1. Porcentagem de PI significativa ePI temp (p-valores < 0,05) das comparações entre (i) os dados aleatórios simulados (sem preferência) e a hipótese estatística nula, e (ii) os dados observadose os dados aleatórios simulados. Os resultados são apresentados separadamente para larvas e fêmeas.
Arquivo Suplementar S1: Código usado para análise de dados e estatísticas em R markdown. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar S2: Relatório da análise estatística. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar S3: Contagem bruta de Lucilia cuprina para preferência larval e feminina em cada uma das quatro escolhas de substrato. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A compreensão da evolução dos hábitos alimentares, particularmente no contexto do parasitismo em moscas-varejeiras, requer o exame das preferências de substrato ao longo de diferentes fases da vida para alimentação ou oviposição. Portanto, neste estudo, métodos robustos e diretos foram propostos para investigar preferências de substrato em larvas e fêmeas de moscas-varejeiras. Esses métodos foram testados em Lucilia cuprina, uma mosca varejeira parasita facultativa2. Curiosamente, os experimentos revelaram uma inclinação distinta para carne podre a 25 °C entre larvas de L. cuprina, alinhando-se com condições tipicamente usadas por espécies necrófagas. Isso diferiu do estudo de Fouche ecols.40, que mostrou preferência por substrato hepático fresco em Lucilia sericata e Calliphora vicina e mostrou que o substrato podre impactou negativamente a sobrevivência e o crescimento. No entanto, é difícil comparar os resultados de ambos os estudos, pois o grau de decomposição da carne (sete dias versus cinco em nosso caso) e o processo de decomposição (puramente anaeróbio versus aeróbio e anaeróbio em nosso caso) foram diferentes. As espécies utilizadas também foram diferentes. Além disso, as observações dos experimentos aqui apresentados indicaram que as fêmeas preferiram colocar seus ovos a 25 °C, enquanto exibiram apenas uma ligeira preferência por carne podre. Estes resultados mostram que as escolhas de larvas e fêmeas não são as mesmas e que as fêmeas apresentam uma escolha mais variada para sua seleção de local de oviposição do que as larvas para escavação e escolhas alimentares. Isso sugere que o hábito parasitário em L. cuprina é liderado por mudanças na escolha da oviposição feminina e não pela preferência alimentar das larvas. Notavelmente, esses achados servem como uma demonstração de prova de conceito da eficácia e utilidade dos métodos na elucidação do estilo de vida de moscas-varejeiras em diferentes estágios de desenvolvimento.
Condições distintas de carne e temperatura foram usadas para mimetizar fatores parasitários e necrófagos do estilo de vida. Esta abordagem facilitou a avaliação da alimentação larval e das preferências do local de oviposição das fêmeas em um ensaio de quatro escolhas, usando dois fatores interagentes. Os protocolos adotados representam uma abordagem que se afasta da técnica tradicional de dupla escolha tipicamente utilizada em estudos anteriores 43,44,45,46,47,48,49,50. Para minimizar as variações resultantes de fatores ambientais que poderiam influenciar o comportamento, como sinais luminosos, visuais ou de odor, medidas rigorosas de controle foram implementadas. A iluminação uniforme e consistente de cima foi sustentada nos ensaios para evitar qualquer viés em relação ou contra a luz, complementada pelo uso de um fundo preto para evitar o impacto de possíveis pistas visuais nas preferências larvais e femininas. Além disso, o risco de contaminação cruzada entre substratos de carne podre e fresca foi evitado empregando-se vidro ou material plástico descartável, luvas e utensílios separados. A aplicação dessas medidas mostrou-se fundamental para o estabelecimento de um arcabouço experimental controlado e confiável, garantindo a robustez e confiabilidade dos resultados obtidos.
O planejamento do experimento larval foi semelhante aos ensaios de duas escolhas descritosanteriormente40,42, com adaptações feitas para incorporar o fator temperatura. O protocolo larval aqui descrito mostrou-se rápido, robusto e direto, uma vez que as larvas exibiram uma forte tendência a permanecer escavadas dentro do substrato escolhido, eliminando a possibilidade de problemas ambíguos de pontuação decorrentes da troca de substratos ao final do experimento. Essa característica específica permite que o experimentador conduza seis ou mais réplicas simultaneamente sem o risco de resultados pouco claros ou incertos. Embora a presença de múltiplas larvas dentro de uma mesma réplica possa influenciar as escolhas individuais, o protocolo permite a avaliação da preferência geral do substrato através de réplicas independentes. Em cenários onde o possível comportamento agregativo precisa ser evitado ou controlado, testes individuais ou a incorporação de experimentos de controle para levar em conta possíveis influências entre larvas podem ser implementados para combater qualquer viés.
Por outro lado, o protocolo de preferência do sítio de oviposição das fêmeas oferece a notável vantagem de avaliar a escolha individual de forma independente, livre da influência das preferências de outras fêmeas, evitando assim o comportamento agregativo. De fato, sabe-se que a escolha da oviposição de fêmeas califorídeos pode ser influenciada pela presença de moscas conespecíficas46,47. No entanto, é importante reconhecer a limitação inerente ao ensaio experimental. Os ovos não podem ser postos dentro da janela experimental de 4 horas devido a condições inadequadas ou, mais provavelmente, à imaturidade das fêmeas. Essa incerteza resulta em um subconjunto das réplicas sem ovos postos (78% dos ensaios). Além disso, a ampla variação no número de ovos postos em cada repetição (26 a 208, média ± desvio padrão = 132,4 ± 46,2) introduz considerável variabilidade, tornando difícil distinguir entre as variações impulsionadas pela preferência das fêmeas e aquelas influenciadas por fatores como reservas limitadas de ovos ou oviposição tardia durante o experimento. Apesar dessas limitações, os protocolos propostos são adequados para avaliar efetivamente a preferência pelo local de oviposição.
De modo geral, os protocolos desenvolvidos possuem potencial significativo para uma ampla gama de aplicações no estudo do comportamento da mosca-varejeira. Em primeiro lugar, esses testes podem ser empregados para examinar os efeitos de vários tratamentos, como diferentes condições de criação ou desenvolvimento, sobre as preferências larvais ou femininas dentro da mesma espécie. Isso poderia potencialmente desvendar os mecanismos subjacentes que impulsionam as preferências comportamentais e sua base genética, particularmente quando acoplado a técnicas de sequenciamento. Além disso, esses testes podem ser estendidos para investigar as preferências de substrato de diferentes espécies de moscas-varejeiras, fornecendo informações valiosas sobre a evolução do parasitismo dentro deste grupo. Ao se aprofundar nas diversas preferências exibidas pelas moscas-varejeiras, pode-se obter uma compreensão mais profunda de suas adaptações ecológicas, fornecendo conhecimento valioso para o futuro manejo e controle de espécies de pragas.
Por fim, o potencial dos protocolos vai além do estudo apenas de moscas-varejeiras. Com pequenas modificações, esses protocolos podem ser prontamente aplicados para avaliar as espécies de moscas de outras famílias, como moscas domésticas e moscas-da-carne, ou mesmo insetos de tamanho semelhante. A adaptabilidade dos protocolos também permite a seleção de diferentes substratos para atender aos objetivos de investigações científicas específicas. Por exemplo, os pesquisadores podem modificar o grau de decomposição da carne ou substituir a carne bovina por fontes animais alternativas (por exemplo, peixe, carne de porco) ou substratos não animais (por exemplo, frutas) para abordar diversas questões ecológicas. Essas adaptações não só aumentam a versatilidade dos protocolos, mas também permitem a exploração de preferências em uma ampla gama de espécies de insetos e contextos ecológicos, aumentando a capacidade de elucidar aspectos fundamentais do comportamento e adaptação ecológica dos insetos.
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Disclosures
Nenhum declarou.
Acknowledgments
Agradecemos a Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim e Lucas de Almeida Carvalho pela criação da colônia de L. cuprina e pelo auxílio na montagem do experimento. Agradecemos também a Rafael Barros de Oliveira pela filmagem e edição do vídeo. Esta pesquisa foi apoiada pelo Developing Nation Research Grant da Animal Behavior Society para V.A.S.C. e por uma bolsa FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo para T.T.T. (20/05636-4). S.T. e D.L.F. foram apoiados pela FAPESP (19/07285-7 bolsa de pós-doutorado e 21/10022-8 bolsa de doutorado, respectivamente). V.A.S.C. e A.V.R. foram apoiados por bolsas de doutorado do CNPq (141391/2019-7, 140056/2019-0, respectivamente). O T.T.T. foi apoiado pelo CNPq (310906/2022-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
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