Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Изучение вариантов жизненного цикла: использование температуры и типа субстрата в качестве взаимодействующих факторов для предпочтений личинок и самок мух

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65835
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Genetics and Evolutionary Biology, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 2Department of Zoology, Institute of Biosciences, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

В данной работе подробно описаны два протокола оценки предпочтений в отношении источников пищи и яйцекладок у личинок и самок мух. Они включают в себя четыре варианта с двумя взаимодействующими факторами: типом субстрата и температурой. Анализы позволяют определить предпочтительный источник пищи для личинок и предпочтительное место для яйцекладки для самок.

Abstract

Мухи (Diptera: Calliphoridae) представляют широкий спектр образа жизни личинок, обычно классифицируемых как облигатный паразитизм, факультативный паразитизм и полная сапронекрофагия. Некоторые виды паразитов, как облигатные, так и факультативные, считаются имеющими санитарное и хозяйственное значение, так как их личинки могут вызывать миаз (заражение живых тканей личинками). Однако примечательно, что решающую роль при выборе места яйцекладки играет взрослая самка, а, следовательно, во многом определяет характер питания и условия развития личинок. В данном исследовании предложены два протокола для проверки предпочтений кормления личинок и предпочтений самки по месту откладки яиц с учетом двух взаимодействующих факторов: типа мясного субстрата и температуры. Представленные здесь установки позволили протестировать личинок Lucilia cuprina и самок гравида в четырехвариантном анализе с двумя температурами (33 ± 2 °C и 25 ± 2 °C) и двумя типами мясных субстратов (свежее мясо с добавлением крови и 5-дневное тухлое мясо). Личинки или гравидные самки могут закапывать или откладывать яйца, соответственно, в одном из следующих способов: тухлое мясо при 25 °C (имитация состояния некрофагов), свежее мясо с добавлением крови при 33 °C (имитация состояния паразитических видов) и две контрольные группы, тухлое мясо при 33 °C или свежее мясо с кровью при 25 °C. Предпочтение оценивается путем подсчета количества личинок или яиц, отложенных в каждом варианте для каждого репликанта. Сравнение наблюдаемых результатов со случайным распределением позволило оценить статистическую значимость предпочтения. Результаты показали, что личинки L. cuprina отдают предпочтение перепревшему субстрату при температуре 25 °C. И наоборот, предпочтения самок к месту откладки яиц были более разнообразными в зависимости от типа мяса. Эта методика может быть адаптирована для проверки предпочтений других видов насекомых аналогичного размера. Другие вопросы также могут быть исследованы с помощью альтернативных условий.

Introduction

Мухи, особенно мускоидные калиптраты (в том числе светлячки, домашние мухи, мухи-боты и мясные мухи), демонстрируют широкий спектр образа жизни, включая паразитическое и некро-сапрофагическоеповедение. Паразитические виды, как правило, вызывают миаз — заражение живых тканей личинками2. В семействе Calliphoridae как облигатные, так и факультативные паразитические виды являются основными вредителями домашнего скота, ответственными за экономические потери и плохое самочувствие животных из-за заражения личинками 2,3,4,5,6,7. Облигатные паразиты, такие как черви Нового и Старого Света (Cochliomyia hominivorax и Chrysomyia bezziana, соответственно), особенно опасны 4,7,8,9,10 наряду с факультативными паразитами, такими как овечьи мухи (Lucilia cuprina и Lucilia sericata)2,5,6, 7. См. Непаразитические виды, в том числе сапронекрофаги, развиваются в разлагающемся и некротизированном органическом веществе и обычно встречаются в антисанитарных условиях. Их строго непаразитарный образ жизни может быть успешно использован для терапии личинок, которая использует личинки мух для очистки ран от некротических тканей11,12,13. Мухи также используются в криминалистике, поскольку они являются одними из первых организмов, которые обнаруживают и колонизируют недавно умершие тела, а развивающиеся личинки служат средством оценкивремени смерти.

Образ жизни мух был предметом различных исследований (например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21) из-за их значимости по отношению к интересам человека. Понимание биологических механизмов, управляющих образом жизни вида, может дать ценную информацию об улучшении методов, направленных на борьбу с видами вредителей. Кроме того, разнообразие и эволюция образа жизни мух создают идеальный контекст для изучения происхождения и механизмов сложных признаков (например, паразитизма). Паразитизм, обусловленный личинками, питающимися живыми тканями, несколько раз эволюционировал независимо в пределах семейства Calliphoridae22,23. Тем не менее, эволюционная история пищевых привычек мух до сих пор в значительной степени неизвестна, и исследования ограничиваются картированием привычек по филогенезу (например, 16,19,22) без помощи функциональных анализов. Например, неясно, произошли ли облигатные паразиты от универсалов (т.е. факультативных паразитов) или непосредственно от некрофагов. Молекулярные, физиологические и поведенческие процессы, сопровождающие эволюционные сдвиги в образе жизни, также в значительной степени неизвестны.

В этом контексте факультативные паразиты, такие как овечья муха Lucilia cuprina, которые могут развиваться как паразиты на хозяине или как некрофаги на трупах, дают возможность изучить факторы и механизмы, контролирующие выбор образа жизни. Lucilia cuprina - космополитичный вид, известный тем, что вызывает овечью муху, особенно в Австралии, где она считается вредителем 3,16. Миаз, вызванный L. cuprina, также может возникать у других домашних животных, домашних животных и человека 3,24,25,26,27,28,29,30. Тем не менее, его личинки также могут развиваться в некротических тканях и разлагающемся веществе, и этот вид успешно используется в судебной энтомологии, поскольку он очень быстро находит и колонизирует трупы31,32,33,34. Несмотря на то, что паразитический и непаразитический образ жизни мух определяется личиночной стадией, место яйцекладки выбирает взрослая самка. Следовательно, взрослая самка сильно влияет на образ жизни личинок, так как последние имеют ограниченную подвижность. Однако выбор самки не обязательно означает, что личинки предпочтут тот же субстрат, когда им будет предоставлен выбор35. Одна из гипотез заключается в том, что поведенческие изменения, приводящие к тому, что самки откладывают яйца на живые ткани, могли быть частью раннего перехода к паразитическому образу жизни. Предадаптация или физиологические возможности образовавшихся личинок были необходимы для их успешного развития на живой ткани, что привело бы к возникновению паразитического образа жизни. Таким образом, затронутые и отобранные процессы могут не совпадать между обоими жизненными стадиями.

В связи с этим были разработаны два метода для проверки поведенческих предпочтений у мух, в частности, у L. cuprina, в отношении субстрата питания личинок (анализ предпочтений личинок) и места яйцекладки (анализ предпочтений самок). Эти методы учитывают два взаимодействующих фактора: температуру и свежесть мяса. Температура была выбрана в качестве решающего фактора, поскольку большинство случаев миаза встречается у гомеотермических животных2. Таким образом, температура 33 °C была выбрана в качестве показателя «паразитарного фактора образа жизни», в то время как температура 25 °C (комнатная температура) представляет собой «непаразитарный фактор». Была выбрана температура 25 °C, поскольку она является репрезентативной для среднегодовой температуры, зарегистрированной в Бразилии (Национальный институт метеорологии, INMET). Кроме того, были рассмотрены два типа мясных субстратов, оба из коровьих источников: (i) свежее мясо с добавлением крови, имитирующее субстрат для паразитического образа жизни, который используется для выращивания паразитической мухи Co. hominivorax в лабораторных условиях36, и (ii) 5-дневное гнилое мясо, имитирующее субстрат для некрофагического образа жизни. Субстрат для крупного рогатого скота обычно используется для выращивания L. cuprina в лабораторных условиях 27,37,38,39, поскольку он имеет ряд преимуществ с точки зрения доступности, экономичности и практичности, являясь при этом экологически оправданным субстратом. В других исследованиях40,41, сравнивающих влияние гнилых и свежих субстратов на мух, использовали 7-дневный гнилой субстрат (в анаэробных условиях) и показали неблагоприятное влияние гнилого субстрата на скорость развития, выживаемость и рост. Поскольку известно, что L. cuprina колонизирует свежие трупы, которые обычно подвергаются воздействию воздуха, мы решили использовать 5-дневное тухлое мясо (говяжий фарш) в негерметичных горшках (аэробное и анаэробное разложение), чтобы имитировать субстрат некрофагов.

Преимущество представленных здесь экспериментальных схем заключается в выявлении предпочтений как для отдельных факторов, так и для их комбинированных эффектов. Кроме того, оцениваемые фенотипы, а именно выбор кормового субстрата для личинок и количество откладываемых яиц, имеют непосредственное отношение к биологическим и экологическим аспектам видов мух. Пригодность этих протоколов подчеркивается демонстрацией их эффективности на L. cuprina. Кроме того, предоставляется сценарий для статистического анализа, который может быть использован для сравнения наблюдаемых результатов, полученных у L. cuprina , с смоделированными случайными данными, обеспечивая надежный статистический анализ и интерпретацию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Образцы мух были получены с помощью ловушек, а не на зараженных животных. Выдана лицензия SISBIO (67867-1) на сбор и содержание мух семейства Calliphoridae в неволе в лабораторных условиях. Образцы насекомых не подлежат этической оценке в исследованиях в Бразилии. Говядина и кровь были получены коммерческим путем, и никакого этического разрешения не требовалось.

1. Предпочтения личинок в питании

  1. Приготовление чашек Петри, содержащих 2% агара
    1. Приготовьте четыре чашки Петри с 2% агаром. Для этого добавьте 6 г бактериологического агара в 300 мл воды и растопите эту смесь в микроволновой печи. Затем равномерно разделите объем на четыре стеклянные чашки Петри (150 x 20 мм), используя около 70 мл в каждой чашке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте чашки Петри, равные желаемому количеству экспериментальных повторений. В данном исследовании было использовано 36 репликаций.
    2. После того, как агар затвердеет, используйте коническую трубку объемом 50 мл (диаметром 3 см), чтобы пробить четыре отверстия в агаре, по два с каждой стороны чашки Петри, следуя предоставленной схеме резки (Рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта схема аналогична ранее описанным протоколам Fouche et al. (2021)40 и Boulay et al. (2016)42.
  2. Подготовка субстратов
    1. Чтобы приготовить свежее мясо с кровью, добавьте 12 мл разбавленной бычьей крови к 200 г свежего говяжьего фарша. Тщательно перемешайте. Обязательно используйте разные градуированные цилиндры и ложки для каждого вида мяса, чтобы избежать перекрестного загрязнения между субстратами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленная кровь состоит на 50% из чистой крови, смешанной с антикоагулянтом (3,8% цитрата натрия) и на 50% из фильтрованной воды.
    2. Для приготовления перепревшего субстрата к 200 г 5-дневного гнилого говяжьего фарша добавить 12 мл фильтрованной воды и хорошо перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тухлое мясо было получено путем инкубации свежего мясного фарша в течение пяти дней при 25 °C в негерметичных пластиковых горшках (смесь аэробного и неаэробного разложения). В каждой кастрюле находилось по 200 г свежего мясного фарша. Затем его замораживали до использования.
    3. Заполните два отверстия в каждой чашке Петри смесью свежего мяса и крови, а оставшиеся два отверстия - смесью тухлого мяса и воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать смещения положения, варьируйте размещение различных типов мяса в чашках Петри. Например, в некоторых чашках Петри один и тот же тип мяса должен быть обращен друг к другу, в то время как в других чашках тип мяса должен быть скрещен, как показано на рисунке 2.
  3. Экспериментальная установка
    1. При комнатной температуре (RT) 25 °C расположите электрогрелку прямо под источником света, чтобы равномерно освещать экспериментальную зону и избегать каких-либо отклонений в сторону или против света. Поместите картонные прокладки вокруг грелки, чтобы экспериментальная установка оставалась ровной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве источника света использовался белый свет с низким нагревом, например, неоновая трубка. Грелка располагалась на столе прямо под потолочными лампочками (рис. 3).
    2. Накройте грелку и выравнивающие картонные прокладки черным картоном и включите грелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать черную картонную обложку, чтобы избежать визуальных подсказок, которые могут повлиять на анализ поведения.
    3. Поместите шесть чашек Петри с агаром и мясным субстратом на черный картон с двумя подложками, по одной каждого типа, на грелку, а две другие с поверхности грелки (Рисунок 2). Дайте субстратам нагреться примерно 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На крышке чашек Петри может образовываться конденсат.
  4. Личиночный тест
    1. Проверьте температуру подложек (холодная сторона: 25 ± 2 °C; горячая сторона: 33 ± 2 °C) с помощью инфракрасного термометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грелка остается включенной в течение всего эксперимента. Измерения температуры проводились в начале и в конце эксперимента. Несмотря на то, что температура колебалась на ± 2 °C, разница температур между жаркими и холодными условиями все еще составляла не менее 8 °C.
    2. После достижения желаемой температуры поместите пять личинок третьего возраста в центр каждой чашки Петри с помощью пинцета (рисунок 2) и накройте чашки Петри крышками. Дайте эксперименту с выбором поработать в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые личинки могут ползать по краям и на крышке чашек Петри. Если какая-либо личинка сбежала, используйте пинцет, чтобы поместить ее обратно в центр чашки Петри.
    3. Через 10 минут снимите все чашки Петри с грелки и положите их на другую поверхность, чтобы избежать дальнейшего нагрева субстратов. Затем подсчитайте количество личинок в каждом субстрате, а также тех, которые не выбрали никакого субстрата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки Lucilia cuprina остаются в выбранном субстрате, как и наблюдалось в этом эксперименте.

2. Предпочтительное место для яйцекладки самки

  1. Экспериментальная установка
    1. Используйте обычную полку, предварительно застеленную черным картоном и равномерно освещенную белыми светодиодными лентами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать черные картонные обложки, чтобы избежать визуальных подсказок, которые могут повлиять на анализ поведения. Белые светодиодные ленты закреплены вдоль в середине полки прямо над экспериментом. Полки, использованные в установке, были размещены на расстоянии 45 см друг от друга.
    2. При температуре RT (25 °C) поместите грелку в центр полки. Используйте картонные прокладки вокруг электрогрелки в качестве опоры, чтобы экспериментальная установка была выровнена.
    3. Накройте грелку и картонные салфетки черным картоном, чтобы сохранить одинаковый визуальный рисунок под всеми подложками.
    4. Поставьте на одну полку два крестообразных стеклянных контейнера, у каждого должно быть по два рукава над черным картоном и грелкой. Перед началом эксперимента включите белые светодиодные ленты и грелки.
    5. Используйте 70% этиловый спирт для очистки крестов (внутри креста и крышки), чтобы избежать загрязнения запахом.
  2. Подготовка субстратов
    1. Приготовьте четыре чашки Петри (60 мм х 15 мм) на крест с 5 г 5-дневного гнилого или свежего мяса (по две от каждого вида субстрата).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте чашки Петри, равные количеству экспериментальных повторений, умноженному на четыре. В этом исследовании было использовано 30 повторов, всего 120 приготовленных чашек Петри.
    2. Добавьте 1 мл разбавленной бычьей крови (50% чистой крови с антикоагулянтом и 50% фильтрованной воды) на свежее мясо и 1 мл фильтрованной воды на тухлое мясо. Тщательно перемешайте мясо (свежее или тухлое) с жидкостью (кровью или водой), используя разные ложки для каждого вида мяса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление мяса для женского теста очень похоже на анализ личинок, хотя количество отличается, потому что женский тест будет выполняться дольше, чем личиночный тест. Не забывайте использовать разные наконечники и ложки для каждого вида мяса, чтобы избежать перекрестного загрязнения запахом между субстратами.
    3. Проверьте, полностью ли испарился спирт с крестов. Затем поместите четыре чашки Петри (по одной каждого вида мяса на грелку, а две другие с поверхности грелки) на край каждого плеча креста (рисунок 4). Закройте крестики крышками и дайте субстратам нагреться примерно 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, чтобы избежать смещения положения, варьируйте размещение различных типов мяса в кроссах. Например, некоторые кроссы должны иметь одинаковый тип мяса на соседних плечах, в то время как в других скрещиваниях один и тот же тип мяса должен находиться друг напротив друга, как показано на рисунке 4.
  3. Женский тест
    1. Соберите самок гравида в клетку с мухами и изолируйте их в индивидуальные пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гравидные самки характеризуются увеличенным и беловато-желтым брюшком, в отличие от негравидных самок (рис. 5). Гравидные самки были собраны между 10 и 16 днями после появления для экспериментов.
    2. Проверьте температуру субстратов в крестовиках (холодная сторона: 25 ± 2 °C; горячая сторона: 33 ± 2 °C) с помощью инфракрасного термометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в личиночном тесте, грелка остается включенной в течение всего эксперимента. Измерения температуры проводились в начале и в конце эксперимента. Несмотря на то, что температура колебалась на ± 2 °C, разница температур между жаркими и холодными условиями все еще составляла не менее 8 °C.
    3. Поместите пробирку вверх дном, содержащую одну гравидную самку, в отверстие в центре каждого креста. После того, как самка войдет в крест, выньте трубку и закройте отверстие ее маленькой крышкой. Закрыв все крестики, положите черный картон в переднюю часть полки, чтобы закрыть экспериментальную установку. Дайте опыту поработать в течение 4 часов.
    4. После этого извлеките самку, аккуратно поймав ее трубкой, и проверьте, не было ли икринки на субстратах.
    5. Определите крышку каждой чашки Петри с типом субстрата от каждого скрещивания. Используйте 70% этиловый спирт для очистки крестиков (внутри крестовины и крышки) от любого запаха теста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если яйца не могут быть подсчитаны сразу после эксперимента, чашки Петри с субстратами можно хранить при температуре -20 °C.
  4. Количество яиц
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если субстраты в чашках Петри были заморожены, разморозьте их перед подсчетом.
    1. Используйте стереомикроскоп, чтобы подсчитать количество яиц, отложенных в каждом субстрате. Используйте щетку и воду, чтобы отделить яйца, чтобы сосчитать их.

3. Анализ данных и статистика

  1. Расчет индексов предпочтений
    1. Для каждого повторного теста личинок (n = 36) и самок (n = 30) рассчитайте индекс предпочтения для мяса (обозначаемого какPI-мясо), определив отношение личинок или яиц, присутствующих на свежих субстратах (свежих горячих и свежих холодных), к общему количеству личинок или яиц на всех субстратах (свежие горячие + свежие холодные + тухлые горячие + тухлые холодные).
      Мясо PI = (# личинки или яйца на свежих субстратах) / # Всего личинок или яиц
      ПРИМЕЧАНИЕ: Термины «горячий» и «холодный» обозначают температурные условия 33 ± 2 °C и 25 ± 2 °C соответственно.
    2. Аналогичным образом, рассчитайте индекс предпочтения температуры (PItemp) для каждого повторения тестов на личинок и самок как количество личинок или яиц, присутствующих на горячих субстратах (свежих горячих и тухлых горячих), разделенное на общее количество личинок или яиц на всех субстратах (свежие горячие + свежие холодные + тухлые горячие + тухлые холодные).
      PItemp = (# личинки или яйца на горячих субстратах) / # Всего личинок или яиц
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, близкие к 1, отражают предпочтение свежих или горячих субстратов, а значения, близкие к нулю, указывают на предпочтение гнилых или холодных субстратов. PI могут быть рассчитаны вручную или с использованием предоставленного кода (Supplemental Files S1 и Supplemental Files S2).
  2. Сравнение наблюдаемых предпочтений с смоделированными случайными данными
    1. Запустите предоставленный код (Дополнительный файл S1 и Дополнительный файл S1), чтобы сгенерировать смоделированные данные и сравнить их с наблюдаемыми данными.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот код генерирует 1000 смоделированных случайных наборов данных для личинок и самок и вычисляет индексы предпочтений (PI) для каждой репликации смоделированных и наблюдаемых данных L. cuprina. Моделирование предполагает, что как личинки, так и самки не проявляют никаких предпочтений в отношении субстрата и делают случайный выбор. Моделирование включает в себя ключевые поведенческие аспекты животных, охватывающие различные сценарии, такие как: вероятность того, что личинки не выберут какой-либо субстрат, и взрослые самки концентрируют свою яйцекладку на одном субстрате или распределяют свои яйца равномерно или нет между различными субстратами. Обобщенные линейные модели (GLM, family: quasibinomial; link: logit) были использованы для сравнения наблюдаемых данных поведенческих тестов с смоделированными случайными данными. Используемый GLM хорошо подходит для этого анализа из-за ограниченного характера индекса предпочтения (PI), находящегося в диапазоне от 0 до 1. GLM умеют работать с ненормально распределенными переменными отклика и позволяют проводить надежные статистические сравнения. Этот выбор способствовал получению значимой информации, позволяя эффективно сравнивать наблюдаемые данные, полученные с помощью поведенческих анализов, со сложными паттернами, сгенерированными смоделированными случайными данными. Для других структурированных наборов данных могут потребоваться незначительные корректировки кода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для демонстрации эффективности представленных методов эксперименты были проведены с использованием лабораторной популяции Lucilia cuprina (семейство: Calliphoridae), факультативной паразитической мухи2. Полный набор исходных данных, полученных для этого вида, можно найти в дополнительном файле S3 с результатами тестов на предпочтения личинок и самок субстрата. Чтобы оценить, проявляют ли личинки и самки предпочтение к какому-либо субстрату, наблюдаемые данные сравнивались с 1000 смоделированных наборов данных, каждый из которых представлял собой случайный выбор (см. код в дополнительном файле S1). В качестве меры оценки предпочтения использовали процент статистически значимых сравнений (р < 0,05). Из этого анализа было очевидно, что личинки проявляли заметное предпочтение гнилого субстрата при 25 °C (рис. 6A, таблица 1), поскольку все 1000 сравнений между наблюдаемыми данными и каждым из смоделированных наборов данных случайного выбора были значительно различающимися для мяса и температурных условий. Аналогичным образом, женщины также продемонстрировали заметное предпочтение 25 °C: 69,7% сравнений между наблюдаемыми данными и случайным выбором оказались достоверно отличающимися (рис. 6B, табл. 1). Тем не менее, их предпочтение тухлому мясу было более тонким (Рисунок 6B, Таблица 1), поскольку только 27,1 % наблюдаемых сравнений со случайным выбором были значимыми. Еще одно наблюдение из этого исследования заключалось в том, что личинки L. cuprina обычно делали быстрый выбор и закапывались в мясной субстрат в течение первых 2 минут эксперимента. Они редко переходили в другое состояние в течение 10-минутного эксперимента.

Figure 1
Рисунок 1: Схема нарезки предпочтений кормления личинок для чашек Петри с агаром. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема расположения анализа предпочтений кормления личинок сверху. Варианты были расположены случайным образом, и испытания проводились при RT (25 ± 2 °C). Черный прямоугольник представляет грелку, которая удерживает температуру 33 ± 2 °C. Красные и синие круги обозначают свежее мясо с добавлением разбавленной крови (50%) и тухлое мясо с добавлением воды соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Диаграмма, показывающая, как расположить экспериментальную установку для личинок под источником света, чтобы избежать смещения в сторону или против света. В качестве источника света использовался белый свет с низким нагревом (неоновая трубка). Грелка располагалась на столе прямо под потолочным светильником. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Схема расположения самки по предпочтительному месту яйцекладки сверху. Варианты были расположены случайным образом, и испытания проводились при RT (25 ± 2 °C). Черный прямоугольник представляет собой грелку, которая удерживает температуру на уровне 33 ± 2 °C. Красные круги обозначают свежее мясо с разбавленной кровью (50%), а синие кружочки – тухлое мясо с водой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Фотография гравида (справа) в сравнении с негравидной (слева) самкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Индексы средних предпочтений (PI) по типу мяса и температуре для личинок (A) и самок (B), отображаемые на декартовой плоскости. Черными кружками показаны средние ПИ с учетом всех экспериментальных репликаций (n = 36 для личинок и n = 30 для самок), полученных для L. cuprina. Каждый из серых кругов обозначает средние PI для мяса и температуры смоделированного набора данных с характеристиками, аналогичными наблюдаемому набору данных (например, такое же количество репликаций), но представляющие собой случайный выбор. Цветные панели служат наглядным пособием для отображения областей предпочтения PI для каждого из четырех вариантов: синим цветом обозначено тухлое мясо при температуре 25 ± 2 °C, зеленым — тухлое мясо при температуре 33 ± 2 °C, желтым — свежее мясо при температуре 25 ± 2 °C и оранжевым — свежее мясо при температуре 33 ± 2 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сцена Сравнение Значимые сравнения для PImeat Значимые сравнения для PItemp
Личинки Смоделированная и нулевая гипотеза (p < 0,05) 3.8% 2.1%
Наблюдаемые и смоделированные (p < 0,05) 100.0% 100.0%
Женщин Смоделированная и нулевая гипотеза (p < 0,05) 3.3% 4.6%
Наблюдаемые и смоделированные (p < 0,05) 27.1% 69.7%

Таблица 1. Процент значимого ПИмяса иПИ температуры (p-значения < 0,05) сравнений между (i) смоделированными случайными данными (без предпочтения) и статистической нулевой гипотезой и (ii) наблюдаемыми данными и смоделированными случайными данными. Результаты представлены отдельно для личинок и самок.

Дополнительный файл S1: код, используемый для анализа данных и статистики в R markdown. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл S2: Отчет о статистическом анализе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл S3: Необработанные подсчеты Lucilia cuprina для предпочтений личинок и самок по каждому из четырех вариантов субстрата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Понимание эволюции пищевых привычек, особенно в контексте паразитизма у мух, требует изучения предпочтений субстрата на разных этапах жизни для питания или яйцекладки. Поэтому в данном исследовании были предложены надежные и простые методы изучения субстратных предпочтений у личинок и самок мух. Эти методы были опробованы на Lucilia cuprina, факультативной паразитической мухе2. Интересно, что эксперименты выявили явную склонность к гнилому мясу при температуре 25 °C среди личинок L. cuprina, что соответствует условиям, обычно используемым некрофагами. Это отличалось от исследования Fouche et al40, которое показало предпочтение свежего печеночного субстрата у Lucilia sericata и Calliphora vicina и показало, что гнилой субстрат негативно влияет на выживание и рост. Однако сравнивать результаты обоих исследований сложно, так как степень разложения мяса (семь дней против пяти в нашем случае) и процесс разложения (чисто анаэробный против аэробного и анаэробного в нашем случае) были разными. Использовались и различные виды. Кроме того, наблюдения в экспериментах, представленных здесь, показали, что самки предпочитают откладывать яйца при температуре 25 °C, в то время как тухлое мясо проявляет лишь незначительное предпочтение. Эти результаты показывают, что выбор личинок и самок не одинаков, и что самки демонстрируют более разнообразный выбор места для откладки яиц, чем личинки для роющих нор и выбора пищи. Это говорит о том, что паразитический образ жизни у L. cuprina обусловлен изменениями в выборе яйцекладки самками, а не предпочтениями личинок в питании. Примечательно, что эти результаты служат доказательством эффективности и полезности методов для выяснения образа жизни мух на разных стадиях развития.

Различные условия мяса и температуры использовались для имитации паразитических и некрофагических факторов образа жизни. Такой подход облегчил оценку питания личинок и предпочтений самок в местах откладки яиц в анализе с четырьмя вариантами ответов с использованием двух взаимодействующих факторов. Принятые протоколы представляют собой подход, который отклоняется от традиционной методики двух вариантов, обычно используемой в предыдущих исследованиях 43,44,45,46,47,48,49,50. Чтобы свести к минимуму изменения, вызванные факторами окружающей среды, которые могут влиять на поведение, такими как световые, визуальные или запаховые сигналы, были приняты строгие меры контроля. Равномерное и последовательное освещение сверху поддерживалось в тестах, чтобы избежать каких-либо смещений в сторону или против света, дополненное использованием черного фона для предотвращения потенциального влияния визуальных сигналов на предпочтения личинок и самок. Кроме того, риск перекрестного загрязнения между гнилыми и свежими мясными субстратами был предотвращен за счет использования стеклянных или одноразовых пластиковых материалов, перчаток и отдельной посуды. Применение этих мер оказалось критически важным для создания контролируемой и заслуживающей доверия экспериментальной базы, тем самым гарантируя устойчивость и надежность полученных результатов.

Дизайн эксперимента с личинками был аналогичен ранее описанным анализам с двумя вариантами ответов40,42, с адаптацией, сделанной для включения температурного фактора. Описанный здесь протокол для личинок оказался быстрым, надежным и простым, учитывая, что личинки демонстрировали сильную тенденцию оставаться зарытыми в выбранный ими субстрат, что исключало возможность неоднозначных проблем с подсчетом баллов, возникающих при смене субстратов в конце эксперимента. Эта особенность позволяет экспериментатору проводить шесть или более повторений одновременно без риска получения неясных или неопределенных результатов. Несмотря на то, что присутствие нескольких личинок в одном и том же репликате может влиять на индивидуальный выбор, протокол позволяет оценить общие предпочтения субстрата с помощью независимых репликаций. В сценариях, где необходимо избегать или контролировать возможное агрегационное поведение, для противодействия любой систематической ошибке может быть реализовано индивидуальное тестирование или включение контрольных экспериментов для учета потенциальных влияний между личинками.

С другой стороны, протокол предпочтения места яйцекладки самки предлагает заметное преимущество, заключающееся в том, что он оценивает индивидуальный выбор независимо, свободно от влияния предпочтений других самок, что позволяет избежать агрегативного поведения. Действительно, известно, что на выбор самок каллифорид может влиять присутствие конвидовых мух46,47. Тем не менее, важно признать неотъемлемую ограниченность экспериментального анализа. Яйца не могут быть отложены в течение 4-часового экспериментального окна из-за неподходящих условий или, что более вероятно, незрелости самок. Эта неопределенность приводит к тому, что в подгруппе репликатов яйца не откладываются (78% испытаний). Кроме того, широкий диапазон количества яиц, снесенных в каждой репликации (от 26 до 208, среднее ± стандартное отклонение = 132,4 ± 46,2) вносит значительную изменчивость, затрудняя различение между вариациями, обусловленными предпочтениями самки, и теми, на которые влияют такие факторы, как ограниченные запасы яиц или поздняя яйцекладка во время эксперимента. Несмотря на эти ограничения, предложенные протоколы подходят для эффективной оценки предпочтительного места для яйцекладки.

В целом, разработанные протоколы обладают значительным потенциалом для широкого спектра применений в изучении поведения мух. Во-первых, эти тесты могут быть использованы для изучения влияния различных методов лечения, таких как различные условия содержания или развития, на предпочтения личинок или самок в пределах одного вида. Это потенциально может раскрыть основные механизмы, управляющие поведенческими предпочтениями, и их генетическую основу, особенно в сочетании с методами секвенирования. Более того, эти тесты могут быть расширены для изучения субстратных предпочтений различных видов мух, что дает ценную информацию об эволюции паразитизма в этой группе. Углубляясь в разнообразные предпочтения, проявляемые мухами, можно получить более глубокое понимание их экологических адаптаций, что дает ценные знания для будущего управления и борьбы с видами вредителей.

Наконец, потенциал протоколов выходит за рамки изучения только мух. С незначительными изменениями эти протоколы могут быть легко применены для оценки видов мух из других семейств, таких как домашние мухи и мясные мухи, или даже насекомых аналогичного размера. Адаптивность протоколов также позволяет выбирать различные субстраты в соответствии с целями конкретных научных исследований. Например, исследователи могут изменить степень разложения мяса или заменить говядину альтернативными источниками животного происхождения (например, рыбой, свининой) или неживотными субстратами (например, фруктами) для решения различных экологических вопросов. Эти адаптации не только повышают универсальность протоколов, но и позволяют исследовать предпочтения в широком спектре видов насекомых и экологических контекстов, тем самым расширяя возможности для выяснения фундаментальных аспектов поведения насекомых и экологической адаптации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никто не заявил.

Acknowledgments

Выражаем признательность Патрисии Х. Тиссен, Габриэле С. Зампим и Лукасу де Алмейде Карвалью за предоставление колонии L. cuprina и помощь в организации эксперимента. Мы также хотели бы поблагодарить Рафаэля Барроса де Оливейру за съемку и монтаж видео. Это исследование было поддержано грантом Developing Nation Research Grant от Animal Behavior Society для V.A.S.C. и грантом FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo для T.T.T. (20/05636-4). S.T. и D.L.F. были поддержаны FAPESP (19/07285-7 постдокторский грант и 21/10022-8 PhD стипендия соответственно). V.A.S.C. и A.V.R. были поддержаны стипендиями CNPq PhD (141391/2019-7, 140056/2019-0 соответственно). T.T.T. был поддержан CNPq (310906/2022-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich 05038-500G For microbiology
Black cardboards - - 70x50 cm
Bovine blood with anticoagulat  - - 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat - - Around 7-8% of fat
Brush - - Made with plastic
Conical tube Falcon or Generic - 50 mL
Cross-shaped glass containers Handmade NA 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer Vidrolabor NA 500 mL
70% Ethanol Synth A1084.01.BL 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder Nalgon or Generic - 500 mL and 50 mL
Heating pad Thermolux - 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer HeTaiDa HTD8808 Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S,
Accuracy: ±0.2 °C,
Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass) Precision NA 150x20 mm dimensions
             (Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS Cralplast 18130 60x15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette - - 3 mL (total volume)
Sodium citrate Synth C11033.01.AG 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons - - More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula Generic - Flat end and spoon end
Stereomicroscope Bioptika - WF10X/22 lenses
Tweezer - - Metal made and fine point
White led light strips NA NA 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
  2. Zumpt, F. Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , Butterworths. London. (1965).
  3. Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
  4. Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
  5. Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
  6. Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
  7. Mullen, G. R., Durden, L. A. Medical and veterinary entomology. , Academic press. (2009).
  8. Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
  9. World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , Paris. (2013).
  10. Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45 (2018).
  11. Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30 (2016).
  12. Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551 (2020).
  13. Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
  14. Greenberg, B. Flies as forensic indicators. Journal of Medical Entomology. 28 (5), 565-577 (1991).
  15. Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
  16. Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
  17. McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
  18. Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
  19. Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230 (2021).
  20. Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
  21. Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598 (2016).
  22. Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
  23. Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
  24. Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
  25. Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
  26. Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
  27. Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
  28. Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
  29. Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
  30. Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
  31. Smith, K. G. V. A manual of forensic entomology. , Cornell University Press. UK. (1986).
  32. Goff, M. L. A Fly for the Prosecution. , Harvard University Press. Cambridge, MA and London, England. (2001).
  33. CRC Press. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , CRC Press. Boca Raton. (2001).
  34. Greenberg, B., Kunich, J. C. Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
  35. Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
  36. Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
  37. Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
  38. Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
  39. Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
  40. Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791 (2021).
  41. Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
  42. Boulay, J., Deneubourg, J. -L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676 (2016).
  43. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  44. Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
  45. Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
  46. Yang, S. -T., Shiao, S. -F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
  47. Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
  48. Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
  49. Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420 (2017).
  50. Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 201
Изучение вариантов жизненного цикла: использование температуры и типа субстрата в качестве взаимодействующих факторов для предпочтений личинок и самок мух
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cunha, V. A. S., Tandonnet, S.,… More

Cunha, V. A. S., Tandonnet, S., Ferreira, D. L., Rodrigues, A. V., Torres, T. T. Exploring Life History Choices: Using Temperature and Substrate Type as Interacting Factors for Blowfly Larval and Female Preferences. J. Vis. Exp. (201), e65835, doi:10.3791/65835 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter