Summary
여기에서, 날파리의 유충과 암컷에서 먹이 공급원과 산란 선호도를 평가하기 위한 두 가지 프로토콜이 상세히 설명된다. 이들은 두 가지 상호 작용 요소, 즉 기판 유형과 온도의 네 가지 선택으로 구성됩니다. 이 분석을 통해 유충의 먹이 공급원 선호도와 암컷의 산란 부위 선호도를 결정할 수 있습니다.
Abstract
날파리(Diptera: Calliphoridae)는 일반적으로 의무 기생, 통성 기생 및 완전한 사프로-네크로파지로 분류되는 광범위한 유충 생활 방식을 나타냅니다. 의무 및 통성 기생 종의 여러 기생 종은 유충이 myiasis (살아있는 조직의 구더기 감염)를 유발할 수 있기 때문에 위생 및 경제적으로 중요한 것으로 간주됩니다. 그러나 성인 암컷이 산란 장소를 선택할 때 결정적인 역할을하므로 유충의 섭식 습관과 발달 조건을 크게 결정한다는 점은 주목할 만합니다. 이 연구에서는 육류 기질 유형과 온도라는 두 가지 상호 작용 요인을 고려하여 유충 섭식 선호도와 암컷 산란 부위 선호도를 테스트하기 위해 두 가지 프로토콜을 제안합니다. 여기에 제시된 설정을 통해 두 가지 온도(33 ± 2 °C 및 25 ± 2 °C)와 두 가지 유형의 육류 기질(혈액이 보충된 신선한 고기와 5일 된 썩은 고기)의 4가지 선택 분석에서 Lucilia cuprina 유충 및 gravid 암컷을 테스트할 수 있었습니다. 유충 또는 중력 암컷은 각각 25 °C에서 썩은 고기 (necrophagous 종 조건 시뮬레이션), 33 °C에서 혈액이 보충 된 신선한 고기 (기생 종 조건 시뮬레이션) 및 33 °C에서 썩은 고기 또는 25 °C에서 혈액이 보충 된 신선한 고기 중 하나에서 굴을 파거나 알을 낳을 수 있습니다. 선호도는 각 반복에 대한 각 옵션에 낳은 유충 또는 알의 수를 계산하여 평가됩니다. 관측된 결과를 무작위 분포와 비교하면 선호도의 통계적 유의성을 추정할 수 있습니다. 그 결과 L. cuprina 유충은 25°C에서 썩은 기질을 매우 선호하는 것으로 나타났습니다. 반대로, 암컷의 산란 부위 선호도는 육류 종류에 따라 더 다양했습니다. 이 방법론은 비슷한 크기의 다른 곤충 종의 선호도를 테스트하는 데 적용할 수 있습니다. 대체 조건을 사용하여 다른 질문을 탐색할 수도 있습니다.
Introduction
파리, 특히 꽃받침 백운충(날파리, 집파리, 봇파리, 살파리 등)은 기생충 행동과 괴사포식증 행동을 포함하는 다양한 생활 방식을 보인다1. 기생 종은 일반적으로 구더기(유충)에 의해 살아있는 조직이 감염되는 마이아시스(myiasis)를 일으킵니다.2. Calliphoridae 계통에서 의무 기생 종과 통성 기생 종은 구더기 침입으로 인한 경제적 손실과 열악한 동물 복지를 담당하는 주요 가축 해충입니다 2,3,4,5,6,7. 신세계 및 구세계 나사벌레(각각 Cochliomyia hominivorax 및 Chrysomyia bezziana)와 같은 의무 기생충은 양날파리(Lucilia cuprina 및 Lucilia sericata)와 같은 통성 기생충과 함께 특히 문제가 됩니다.4,7,8,9,10 7. 사프로-네크로파구스를 포함한 비기생 종은 부패 및 괴사성 유기물에서 발생하며 비위생적인 환경에서 흔히 발견됩니다. 기생충이 아닌 그들의 생활방식은 파리 유충을 사용하여 괴사성 조직의 상처를 청소하는 구더기 치료에 성공적으로 사용될 수 있다11,12,13. 날파리는 법의학에서도 사용되는데, 최근에 죽은 시체를 찾아 식민지화하는 최초의 유기체 중 하나이며, 발달 중인 유충은 사망 시간을 추정하는 수단으로 사용된다14.
날파리의 생활양식은 인간의 이익과 관련된 중요성 때문에 다양한 연구 조사(예: 15,16,17,18,19,20,21)의 대상이 되어 왔습니다. 종의 생활 방식을 지배하는 생물학적 메커니즘을 이해하면 해충 종을 통제하기 위한 방법을 개선하는 데 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 더욱이, 날파리 생활 방식의 다양성과 진화는 복잡한 형질(예: 기생)의 기원과 메커니즘을 연구할 수 있는 이상적인 맥락을 제공합니다. 살아있는 조직을 먹는 구더기로 인한 기생은 Calliphoridae 계통 내에서 여러 번 독립적으로 진화했습니다22,23. 그러나 날파리의 먹이 습관에 대한 진화 역사는 여전히 크게 알려져 있지 않으며, 연구는 기능적 분석의 도움 없이 계통 발생(예: 16,19,22)을 따라 습관을 매핑하는 것으로 제한되어 있습니다. 예를 들어, 의무 기생충이 일반인(즉, 통성 기생충)에서 진화했는지 아니면 네크로파구스 종에서 직접 진화했는지는 불확실합니다. 생활 방식의 진화적 변화에 수반되는 분자적, 생리적, 행동적 과정도 대부분 알려져 있지 않습니다.
이러한 맥락에서 숙주에서 기생충으로 발생하거나 사체에서 괴사로 발생할 수 있는 양 날파리 Lucilia cuprina와 같은 통성 기생충은 생활 방식 선택을 통제하는 요인과 메커니즘을 탐구할 수 있는 가능성을 제공합니다. Lucilia cuprina는 특히 해충으로 간주되는 호주에서 양 파리 파업을 일으키는 것으로 알려진 국제적인 종입니다 3,16. L. cuprina에 의한 Myiasis는 다른 가축, 애완 동물 및 인간에서도 발생할 수 있습니다 3,24,25,26,27,28,29,30. 그러나 유충은 괴사 조직과 부패 물질에서도 발생할 수 있으며 이 종은 시체를 찾고 식민지화하는 것이 매우 빠르기 때문에 법의학 곤충학에서 성공적으로 사용되었습니다31,32,33,34. 날파리의 기생 대 비 기생 생활 방식은 유충 단계에 의해 정의되지만 산란 장소를 선택하는 것은 성인 암컷입니다. 결과적으로, 성인 암컷은 유충의 생활 방식에 큰 영향을 미치며, 후자는 이동성이 제한되어 있습니다. 그러나, 암컷의 선택은 선택지(35)가 제시될 때 유충이 동일한 기질을 선호한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 한 가지 가설은 암컷이 살아있는 조직에 알을 낳게 하는 행동 변화가 기생 생활 방식으로의 초기 전환의 일부일 수 있다는 것입니다. 결과 유충의 사전 적응 또는 생리적 능력은 살아있는 조직에서 성공적으로 발달하는 데 필수적이었을 것이며, 이는 기생 생활 방식의 출현으로 이어졌습니다. 따라서 영향을 받고 선택된 과정이 반드시 두 수명 단계 사이에 일치하지는 않을 수 있습니다.
이러한 맥락에서 유충 섭식 기질(유충 선호도 분석)과 산란 부위(암컷 선호도 분석)와 관련하여 특히 L. cuprina의 경우 송풍의 행동 선호도를 테스트하기 위해 두 가지 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법은 온도와 육류의 신선도라는 두 가지 상호 작용 요소를 고려합니다. 대부분의 근육증 사례가 동종성 동물에서 발생하기 때문에 온도가 중요한 요인으로 선택되었다2. 따라서 33°C의 온도는 "기생충 생활 요인"의 대용으로 선택되었으며 25°C(실온)의 온도는 "비기생충 요인"을 나타냅니다. 25 °C의 온도는 브라질에서 기록 된 연평균 기온을 대표하기 때문에 선택되었습니다 (National Institute of Meteorology, INMET). 추가적으로, 두 가지 유형의 육류 기질이 고려되었는데, 둘 다 소의 공급원에서 유래했다: (i) 실험실 조건36에서 기생 날파리 Co. hominivorax를 기르는 데 사용되는 기생충 생활양식의 기질을 모방한 혈액으로 보충된 신선한 고기, (ii) 네크로파구스 생활양식의 기질을 모방한 5일 된 썩은 고기. 소 기질은 생태학적으로 정당화 가능한 기질이면서 가용성, 비용 효율성 및 실용성 측면에서 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 실험실 조건 27,37,38,39에서 L. cuprina를 기르는 데 일반적으로 사용됩니다. 날파리에서 썩은 기질과 신선한 기질의 효과를 비교한 다른 연구40,41에서는 7일 된 썩은 기질(혐기성 조건에서)을 사용했으며 썩은 기질이 발달 속도, 생존 및 성장에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. L. cuprina는 일반적으로 공기에 노출되는 신선한 시체를 식민지화하는 것으로 알려져 있기 때문에 우리는 괴사 기질을 모방하기 위해 5일 된 썩은 고기(갈은 쇠고기)를 밀폐되지 않은 냄비(호기성 및 혐기성 분해)에 사용하기로 결정했습니다.
여기에 제시된 실험 설계는 개별 요인과 결합된 효과에 대한 선호도를 식별할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한, 점수가 매겨진 표현형, 즉 유충 먹이 기질의 선택과 낳은 알의 수는 날파리 종의 생물학적 및 생태학적 측면과 직접적인 관련이 있습니다. 이러한 프로토콜의 적합성은 L. cuprina에서 효과를 입증함으로써 강조됩니다. 또한 L. cuprina 에서 얻은 관찰 결과를 시뮬레이션된 무작위 데이터와 비교하는 데 사용할 수 있는 통계 분석을 위한 스크립트가 제공되어 강력한 통계 분석 및 해석을 보장합니다.
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Protocol
파리 샘플은 감염된 동물이 아닌 덫을 사용하여 획득했습니다. SISBIO 라이선스(67867-1)가 발급되어 Calliphoridae 계통의 파리를 수집하여 실험실 조건에서 사육했습니다. 곤충 표본은 브라질 연구에서 윤리적 평가에서 면제됩니다. 소의 고기와 피는 상업적으로 얻어졌으며 윤리적 허가가 필요하지 않았습니다.
1. 애벌레 먹이 선호도
- 2 % 한천을 함유 한 페트리 접시 준비
- 2% 한천으로 4개의 페트리 접시를 준비합니다. 이렇게 하려면 물 300mL에 세균 한천 6g을 넣고 이 혼합물을 전자레인지에 녹입니다. 그런 다음 부피를 4개의 유리 페트리 접시(150 x 20mm)에 고르게 나누고 각 접시에 약 70mL를 사용합니다.
알림: 원하는 실험 반복 횟수와 동일한 페트리 접시를 준비합니다. 이 연구에서는 36번의 반복실험이 사용되었습니다. - 한천이 응고되면 50mL 원뿔형 튜브(직경 3cm)를 사용하여 제공된 절단 패턴에 따라 페트리 접시의 양쪽에 2개씩 한천에 4개의 구멍을 뚫습니다(그림 1).
참고: 이 설정은 Fouche et al. (2021)40 및 Boulay et al. (2016)42에서 이전에 설명한 프로토콜과 유사합니다.
- 2% 한천으로 4개의 페트리 접시를 준비합니다. 이렇게 하려면 물 300mL에 세균 한천 6g을 넣고 이 혼합물을 전자레인지에 녹입니다. 그런 다음 부피를 4개의 유리 페트리 접시(150 x 20mm)에 고르게 나누고 각 접시에 약 70mL를 사용합니다.
- 기판의 제조
- 신선한 고기를 피와 함께 준비하려면 희석한 소 혈액 12mL를 신선한 소 다진 고기 200g에 넣으십시오. 잘 섞는다. 고기 종류별로 눈금이 매겨진 실린더와 스푼을 사용하여 기질 간의 교차 오염을 방지하십시오.
알림: 희석된 혈액은 항응고제(3.8% 구연산나트륨) 및 50% 여과수와 혼합된 50% 순수 혈액으로 구성됩니다. - 썩은 기질을 준비하기 위해 5일 된 썩은 소 다진 고기 200g에 여과수 12mL를 넣고 잘 섞습니다.
참고: 썩은 고기는 밀폐되지 않은 플라스틱 냄비(호기성 및 비호기성 분해의 혼합)에서 25°C에서 5일 동안 신선한 다진 고기를 배양하여 얻었습니다. 각 냄비에는 200g의 신선한 다진 고기가 들어 있습니다. 그런 다음 사용할 때까지 냉동되었습니다. - 각 페트리 접시의 두 구멍은 신선한 고기와 혈액 혼합물로 채우고 나머지 두 개의 구멍은 썩은 고기와 물 혼합물로 채웁니다.
알림: 위치 편향을 피하려면 페트리 접시에 다양한 고기 유형의 배치를 변경하십시오. 예를 들어, 일부 페트리 접시는 그림 2와 같이 동일한 유형의 고기가 서로 마주 보여야 하는 반면 다른 접시에서는 고기 유형이 교차해야 합니다.
- 신선한 고기를 피와 함께 준비하려면 희석한 소 혈액 12mL를 신선한 소 다진 고기 200g에 넣으십시오. 잘 섞는다. 고기 종류별로 눈금이 매겨진 실린더와 스푼을 사용하여 기질 간의 교차 오염을 방지하십시오.
- 실험 설정
- 25°C의 실온(RT)에서 가열 패드를 광원 바로 아래에 배치하여 실험 영역을 고르게 비추고 빛에 대한 동작 편향을 방지합니다. 가열 패드 주위에 판지 패드를 놓아 실험 설정이 수평을 유지하도록 합니다.
알림: 사용된 광원은 네온 튜브와 같은 백색 저열 방출광이었습니다. 가열 패드는 천장 전구 바로 아래의 테이블 위에 배치되었습니다(그림 3). - 가열 패드와 수평 판지 패드를 검은색 판지로 덮고 가열 패드를 켭니다.
알림: 검은색 판지 덮개는 행동 분석을 편향시킬 수 있는 시각적 단서를 피하기 위해 사용해야 합니다. - 한천과 고기 기질이 있는 6개의 페트리 접시를 가열 패드에 놓고 다른 두 개는 가열 패드 표면에서 떨어진 두 개의 기질이 있는 검은색 판지 위에 놓습니다(그림 2). 기판을 약 10분 동안 가열합니다.
알림: 페트리 접시의 뚜껑에 결로가 형성될 수 있습니다.
- 25°C의 실온(RT)에서 가열 패드를 광원 바로 아래에 배치하여 실험 영역을 고르게 비추고 빛에 대한 동작 편향을 방지합니다. 가열 패드 주위에 판지 패드를 놓아 실험 설정이 수평을 유지하도록 합니다.
- 유충 검사
- 적외선 온도계로 기판의 온도(차가운 쪽: 25 ± 2 °C, 뜨거운 쪽: 33 ± 2 °C)를 확인하십시오.
알림: 가열 패드는 실험이 진행되는 동안 계속 켜져 있습니다. 온도 측정은 실험의 시작과 끝에서 이루어졌습니다. 기온은 2°C ± 변동했지만, 더운 날씨와 추운 날씨 사이에는 여전히 최소 8°C의 온도 차이가 있었습니다. - 원하는 온도에 도달한 후 핀셋(그림 2)을 사용하여 각 페트리 접시의 중앙에 5마리의 3분의 1 유충을 놓고 뚜껑으로 페트리 접시를 덮습니다. 선택 실험을 10분 동안 실행합니다.
알림: 일부 유충은 페트리 접시의 가장자리와 뚜껑을 기어 다닐 수 있습니다. 유충이 탈출하면 핀셋을 사용하여 페트리 접시 중앙으로 다시 놓습니다. - 10분 후 가열 패드에서 모든 페트리 접시를 꺼내 기판이 계속 가열되지 않도록 다른 표면에 놓습니다. 그런 다음 각 기질의 유충 수와 기질을 선택하지 않은 유충의 수를 계산합니다.
참고: Lucilia cuprina 유충은 이 실험에서 관찰된 바와 같이 선택한 기질에 머뭅니다.
- 적외선 온도계로 기판의 온도(차가운 쪽: 25 ± 2 °C, 뜨거운 쪽: 33 ± 2 °C)를 확인하십시오.
2. 여성 산란 부위 선호
- 실험 설정
- 이전에 검은색 판지로 덮고 흰색 LED 조명 스트립으로 균일하게 조명한 일반 선반을 사용하십시오.
알림: 검은색 판지 덮개는 행동 분석을 편향시킬 수 있는 시각적 신호를 피하기 위해 사용해야 합니다. 흰색 LED 스트립은 실험 바로 위의 선반 중앙에 세로로 고정됩니다. 설치에 사용된 선반은 45cm 간격으로 배치되었습니다. - RT(25°C)에서 선반 중앙에 가열 패드를 놓습니다. 가열 패드 주변의 판지 패드를 지지대로 사용하여 실험 설정이 수평을 이루도록 합니다.
- 가열 패드와 수평 판지 패드를 검은색 판지로 덮어 모든 기판 아래에 동일한 시각적 패턴을 유지합니다.
- 하나의 선반에 두 개의 십자형 유리 용기를 놓고 각각 검은색 판지와 가열 패드 위에 두 개의 팔이 있어야 합니다. 실험을 시작하기 전에 흰색 LED 조명 스트립과 가열 패드를 켭니다.
- 냄새 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올을 사용하여 십자가(십자가 내부와 뚜껑)를 청소하십시오.
- 이전에 검은색 판지로 덮고 흰색 LED 조명 스트립으로 균일하게 조명한 일반 선반을 사용하십시오.
- 기판의 제조
- 십자가 당 4 개의 페트리 접시 (60mm x 15mm)를 5 일 된 썩거나 신선한 고기 5g (각 유형의 기질 2 개)과 함께 준비합니다.
참고: 원하는 실험 반복 횟수에 4를 곱한 것과 동일한 페트리 접시를 준비합니다. 이 연구에서는 30개의 복제가 사용되어 총 120개의 준비된 페트리 접시가 사용되었습니다. - 희석한 소의 혈액 1mL(항응고제가 함유된 순혈 50%, 여과수 50%)를 신선한 고기에 넣고 여과수 1mL를 썩은 고기에 넣습니다. 고기의 종류마다 다른 숟가락을 사용하여 고기(신선 또는 썩은 고기)와 액체(혈액 또는 물)를 완전히 섞습니다.
참고: 암컷 분석을 위한 고기 준비는 유충 분석과 매우 유사하지만 암컷 테스트가 유충 테스트보다 더 오래 실행되기 때문에 양이 다릅니다. 각 고기 유형에 대해 다른 피펫 팁과 스푼을 사용하여 기질 간의 냄새 교차 오염을 방지하는 것을 잊지 마십시오. - 십자가에서 알코올이 완전히 증발했는지 확인하십시오. 그런 다음 4 개의 페트리 접시 (각 유형의 고기 중 하나는 가열 패드에, 다른 두 개는 가열 패드 표면에서)를 십자가의 각 팔 끝에 놓습니다 (그림 4). 뚜껑으로 십자가를 닫고 기판을 약 10분 동안 가열합니다.
알림: 또한 위치 편향을 피하려면 십자가에 다양한 고기 유형의 배치를 변경하십시오. 예를 들어, 일부 십자가는 인접한 팔에 동일한 유형의 고기가 있어야 하는 반면, 다른 십자가에서는 그림 4와 같이 동일한 유형의 고기가 서로 마주보고 있어야 합니다.
- 십자가 당 4 개의 페트리 접시 (60mm x 15mm)를 5 일 된 썩거나 신선한 고기 5g (각 유형의 기질 2 개)과 함께 준비합니다.
- 여성 테스트
- 플라이 케이지에서 임신한 암컷을 모아 개별 튜브로 분리합니다.
참고: Gravid 암컷은 Gravid가 없는 암컷과 달리 복부가 커지고 희끄무레한 노란색을 갖는 것이 특징입니다(그림 5). Gravid 암컷은 실험을 위해 출현 후 10 일에서 16 일 사이에 수집되었습니다. - 적외선 온도계를 사용하여 십자가의 기판 온도를 확인하십시오 (차가운 쪽 : 25 ± 2 °C, 뜨거운 쪽 : 33 ± 2 °C).
알림: 유충 테스트와 마찬가지로 가열 패드는 실험의 전체 기간 동안 켜져 있습니다. 온도 측정은 실험의 시작과 끝에서 이루어졌습니다. 기온은 2°C ± 변동했지만, 더운 날씨와 추운 날씨 사이에는 여전히 최소 8°C의 온도 차이가 있었습니다. - 각 십자가 중앙의 구멍에 하나의 gravid 암컷이 들어있는 튜브를 거꾸로 놓습니다. 암컷이 십자가에 들어간 후 튜브를 제거하고 작은 뚜껑으로 구멍을 닫으십시오. 모든 십자가를 닫은 후 선반 앞쪽에 검은색 판지를 놓아 실험 설정을 둘러쌉니다. 실험을 4시간 동안 실행합니다.
- 그런 다음 튜브로 조심스럽게 잡아 암컷을 제거하고 기질에 알이 있는지 확인하십시오.
- 각 십자가의 기질 유형으로 각 페트리 접시의 뚜껑을 식별합니다. 70% 에탄올을 사용하여 테스트에서 발생하는 냄새로부터 십자가(십자가 내부와 뚜껑 내부)를 청소합니다.
알림: 실험 직후 계란을 셀 수 없는 경우 기질이 있는 페트리 접시를 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 플라이 케이지에서 임신한 암컷을 모아 개별 튜브로 분리합니다.
- 달걀 개수
알림: 페트리 접시의 기질이 얼었다면 계산하기 전에 해동하십시오.- 실체현미경을 사용하여 각 기질에 낳은 알의 수를 계산합니다. 브러시와 물을 사용하여 계란을 분리하여 계산하십시오.
3. 데이터 분석 및 통계
- 기본 설정 지수 계산
- 유충(n = 36) 및 암컷(n = 30) 검정의 각 반복실험에 대해 모든 기질(신선 고온 및 신선 냉기)에 존재하는 유충 또는 알의 총 수(신선 핫 + 신선 냉기+썩은 핫 + 썩은 핫 + 썩은 콜드)에 존재하는 유충 또는 알의 비율을 결정하여 육류(PI육류로 지정됨)에 대한 선호도 지수를 계산합니다.
PI고기 = (# 신선한 기질의 유충 또는 알) / # 총 유충 또는 알
알림: "뜨거운" 및 "차가운"이라는 용어는 각각 33 ± 2°C 및 25 ± 2°C의 온도 조건을 나타냅니다. - 마찬가지로, 유충 및 암컷 테스트의 각 반복실험에 대한 온도에 대한 선호도 지수(PI온도)를 뜨거운 기질(신선한 뜨겁고 썩은 뜨거움)에 존재하는 유충 또는 알의 수를 모든 기질의 총 유충 또는 알 수(신선한 뜨겁게 + 신선한 냉기 + 썩은 뜨겁게 달궈진 것+썩은 차갑게)로 나눈 값으로 계산합니다.
PI온도 = (# 뜨거운 기질의 유충 또는 알) / # 총 유충 또는 알
참고: 값이 1에 가까우면 신선 또는 핫 기판에 대한 선호도를 나타내고 0에 가까운 값은 썩은 기판 또는 차가운 기판에 대한 선호도를 나타냅니다. PI는 수동으로 계산하거나 제공된 코드(추가 파일 S1 및 추가 파일 S2)를 사용하여 계산할 수 있습니다.
- 유충(n = 36) 및 암컷(n = 30) 검정의 각 반복실험에 대해 모든 기질(신선 고온 및 신선 냉기)에 존재하는 유충 또는 알의 총 수(신선 핫 + 신선 냉기+썩은 핫 + 썩은 핫 + 썩은 콜드)에 존재하는 유충 또는 알의 비율을 결정하여 육류(PI육류로 지정됨)에 대한 선호도 지수를 계산합니다.
- 시뮬레이션된 랜덤 데이터에 대한 관찰된 선호도 비교
- 제공된 코드(보조 파일 S1 및 보조 파일 S1)를 실행하여 시뮬레이션된 데이터를 생성하고 관찰된 데이터와 비교합니다.
참고: 이 코드는 유충과 암컷에 대해 1000개의 시뮬레이션된 무작위 데이터 세트를 생성하고 시뮬레이션된 각 반복실험에 대한 선호도 지수(PI)와 L. cuprina의 관측 데이터를 계산합니다. 시뮬레이션은 유충과 암컷 모두 기질 선호도를 나타내지 않고 무작위 선택을 한다고 가정합니다. 시뮬레이션은 유충이 기질을 선택하지 않을 확률, 성체 암컷이 단일 기질에 알을 낳는 데 집중하거나 알을 다른 기질에 균일하게 또는 분배하지 않을 확률과 같은 다양한 시나리오를 포함하는 동물의 주요 행동 측면을 통합합니다. 일반화 선형 모델(GLM, 패밀리: 준이항, 링크: 로짓)을 사용하여 행동 분석에서 관찰된 데이터를 시뮬레이션된 무작위 데이터와 비교했습니다. 사용된 GLM은 0과 1 사이의 선호도 지수(PI)의 제한된 특성으로 인해 이 분석에 매우 적합했습니다. GLM은 비정규 분포 반응 변수를 처리하는 데 능숙하며 강력한 통계적 비교를 허용합니다. 이 선택은 행동 분석에서 관찰된 데이터를 시뮬레이션된 무작위 데이터에 의해 생성된 복잡한 패턴과 효과적으로 비교할 수 있도록 하여 의미 있는 통찰력을 촉진했습니다. 다른 구조화된 데이터 세트의 경우 코드를 약간 조정해야 할 수 있습니다.
- 제공된 코드(보조 파일 S1 및 보조 파일 S1)를 실행하여 시뮬레이션된 데이터를 생성하고 관찰된 데이터와 비교합니다.
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Representative Results
제시된 방법의 효과를 입증하기 위해, 실험은 통성 기생 날파리2 인 Lucilia cuprina (가족 : Calliphoridae)의 실험실 집단을 사용하여 수행되었습니다. 이 종에 대해 얻은 전체 원시 데이터 세트는 유충 및 암컷 기질 선호도 테스트에 대한 결과와 함께 보충 파일 S3에서 찾을 수 있습니다. 유충과 암컷이 기질에 대한 선호도를 보이는지 평가하기 위해 관찰된 데이터를 각각 무작위 선택을 나타내는 1000개의 시뮬레이션된 데이터 세트와 비교했습니다(보충 파일 S1의 코드 참조). 통계적으로 유의한 비교의 비율(p < 0.05)은 선호도를 평가하는 척도로 사용되었습니다. 이 분석에서 유충은 25°C에서 썩은 기질에 대한 뚜렷한 선호도를 나타냈음이 분명했으며(그림 6A, 표 1), 관찰된 데이터와 시뮬레이션된 각 무작위 선택 데이터 세트 간의 1000개 비교가 육류 및 온도 조건에 따라 크게 다른 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 여성은 25°C에 대한 선호도가 두드러졌는데, 관찰된 데이터와 무작위 선택 간의 비교에서 69.7%가 유의하게 다른 것으로 나타났습니다(그림 6B, 표 1). 그러나 썩은 고기에 대한 선호도는 관찰된 무작위 선택 비교의 27.1%만이 유의미했기 때문에 더 미묘한 차이가 있었습니다(그림 6B, 표 1). 이 연구의 또 다른 관찰은 L. cuprina의 유충이 일반적으로 실험의 처음 2분 이내에 빠른 선택을 하고 고기 기질에 굴을 파는 것입니다. 그들은 10분 실험 동안 다른 조건으로 거의 변하지 않았습니다.
그림 1: 한천이 있는 페트리 접시에 대한 유충 먹이 선호 절단 패턴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유충 섭식 선호도 분석의 레이아웃에 대한 평면도. 선택은 무작위로 배치되었고, 시험은 RT(25 ± 2°C)에서 수행되었습니다. 검은색 사각형은 33°C에서 2°C± 온도를 유지하는 가열 패드를 나타냅니다. 빨간색과 파란색 원은 각각 희석된 피(50%)를 보충한 신선한 고기와 물을 보충한 썩은 고기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 빛에 대한 편향을 피하기 위해 광원 아래에 유충 실험 설정을 배치하는 방법을 보여주는 다이어그램. 사용된 광원은 백색 저발열 발광광(네온관)이었습니다. 난방 패드는 천장 조명 바로 아래 테이블 위에 배치되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 여성 산란 부위 선호도 분석의 레이아웃에 대한 평면도. 선택은 무작위로 배치되었고, 시험은 RT(25 ± 2°C)에서 수행되었습니다. 검은색 사각형은 33°C에서 2°C± 온도를 유지하는 가열 패드를 나타냅니다. 빨간색 원은 피를 희석한 신선한 고기(50%)를 나타내고 파란색 원은 물이 있는 썩은 고기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 중력자(오른쪽)와 비중력자(왼쪽)의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 육류 종류에 대한 평균 선호도 지수(PI)와 유충(A)과 암컷(B)의 온도를 직교 평면에 표시 한 값. 검은색 원은 L. cuprina 에 대해 얻은 모든 실험 반복실험(유충의 경우 n = 36, 암컷 실험의 경우 n = 30)을 고려한 평균 PI를 나타냅니다.각 회색 원은 관측된 데이터 세트와 유사한 특성(예: 동일한 반복실험 횟수)을 갖지만 무작위 선택을 나타내는 시뮬레이션된 데이터 세트의 육류 및 온도에 대한 평균 PI를 나타냅니다. 컬러 창은 25 ± 2 °C에서 썩은 고기, 33 ± 2 °C에서 썩은 고기, 25 ± 2 °C에서 신선한 고기, 33 ± 2 °C에서 신선한 육류를 나타내는 주황색으로 4가지 선택 사항 각각에 대한 PI 선호 영역을 시각적으로 묘사하는 데 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 무대 | 비교 | PImeat에 대한 중요한 비교 | PItemp에 대한 유의미한 비교 |
| 애벌레 | 시뮬레이션 대 귀무 가설(p < 0.05) | 3.8% | 2.1% |
| 관찰 vs. 시뮬레이션(p < 0.05) | 100.0% | 100.0% | |
| 여성 | 시뮬레이션 대 귀무 가설(p < 0.05) | 3.3% | 4.6% |
| 관찰 vs. 시뮬레이션(p < 0.05) | 27.1% | 69.7% |
표 1. (i) 시뮬레이션된 랜덤 데이터(선호 없음)와 통계적 귀무 가설 및 (ii) 관측된 데이터와 시뮬레이션된 랜덤 데이터 간의 비교에 대한 유의한 PI고기 및 PI온도 (p-값 < 0.05)의 백분율입니다. 결과는 유충과 암컷에 대해 별도로 제시됩니다.
보충 파일 S1: R 마크다운의 데이터 분석 및 통계에 사용되는 코드입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S2: 통계 분석 보고서. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S3: 4가지 기질 선택 각각에 대한 유충 및 암컷 선호도에 대한 Lucilia cuprina 의 원시 개수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
특히 날파리의 기생과 관련하여 섭식 습관의 진화를 이해하려면 섭식 또는 산란을 위한 다양한 생애 단계에 걸쳐 기질 선호도를 조사해야 합니다. 따라서 이 연구에서는 날파리의 유충과 암컷의 기질 선호도를 조사하기 위한 강력하고 간단한 방법을 제안했습니다. 이러한 방법은 Lucilia cuprina, facultative parasitic blowfly2에서 테스트되었습니다. 흥미롭게도, 이 실험은 L. cuprina 유충 사이에서 25°C에서 썩은 고기에 대한 뚜렷한 성향을 밝혀냈으며, 이는 네크로파구스 종에서 일반적으로 사용되는 조건과 일치합니다. 이는 Lucilia sericata 및 Calliphora vicina의 신선한 간 기질에 대한 선호도를 보여주고 썩은 기질이 생존과 성장에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여준 Fouche et al40의 연구와 달랐습니다. 그러나 육류의 부패 정도(7일 대 우리의 경우 5일)와 분해 과정(순수 혐기성 대 호기성 및 혐기성)이 다르기 때문에 두 연구의 결과를 비교하기는 어렵습니다. 사용된 종도 달랐습니다. 또한 여기에 제시된 실험에서 관찰한 바에 따르면 암컷은 25°C에서 알을 낳는 것을 선호하는 반면 썩은 고기는 약간만 선호합니다. 이러한 결과는 유충과 암컷의 선택이 동일하지 않으며 암컷이 굴을 파고 먹이를 선택하는 유충보다 산란 장소 선택에 더 다양한 선택을 보인다는 것을 보여줍니다. 이것은 L. cuprina의 기생 습관이 유충 먹이 선호도가 아니라 암컷 산란 선택의 변화에 의해 주도된다는 것을 시사합니다. 특히, 이러한 발견은 다양한 발달 단계에서 날파리의 생활 방식을 설명하는 방법의 효과와 유용성에 대한 개념 증명 역할을 합니다.
뚜렷한 육류 및 온도 조건은 기생충 및 네크로파고스 생활 방식 요인을 모방하는 데 사용되었습니다. 이 접근법은 두 가지 상호 작용 요인을 사용하여 4가지 선택 분석에서 유충 섭식 및 암컷 산란 부위 선호도 평가를 용이하게 했습니다. 채택된 프로토콜은 이전 연구에서 일반적으로 사용된 전통적인 2관식 기법에서 벗어난 접근법을 나타낸다 43,44,45,46,47,48,49,50. 빛, 시각 또는 냄새 신호와 같은 행동에 영향을 줄 수 있는 환경 요인으로 인한 변화를 최소화하기 위해 엄격한 통제 조치가 구현되었습니다. 빛에 대한 편향을 피하기 위해 위에서 균일하고 일관된 조명을 유지했으며, 유충 및 암컷 선호도에 대한 잠재적인 시각적 단서의 영향을 방지하기 위해 검은색 배경을 사용하여 보완했습니다. 또한 썩은 육류와 신선한 육류 기판 사이의 교차 오염 위험은 유리 또는 일회용 플라스틱 재료, 장갑 및 별도의 기구를 사용하여 방지되었습니다. 이러한 조치의 적용은 통제되고 신뢰할 수 있는 실험 프레임워크를 수립하는 데 중요한 것으로 입증되어 얻은 결과의 견고성과 신뢰성을 보장합니다.
유충 실험 설계는 이전에 기술된 2-선택 분석(40,42)과 유사했으며, 온도 인자를 통합하기 위해 조정이 이루어졌습니다. 여기에 설명된 유충 프로토콜은 유충이 선택한 기질 내에 굴을 파고 있는 경향이 강하여 실험이 끝날 때 기질의 전환으로 인해 발생하는 모호한 점수 문제의 가능성을 제거한다는 점을 감안할 때 빠르고 견고하며 간단한 것으로 입증되었습니다. 이 특정 기능을 통해 실험자는 불분명하거나 불확실한 결과의 위험 없이 6회 이상의 반복실험을 동시에 수행할 수 있습니다. 동일한 복제 내에 여러 유충이 존재하면 개별 선택에 영향을 미칠 수 있지만, 이 프로토콜을 사용하면 독립적인 복제를 통해 일반적인 기질 선호도를 평가할 수 있습니다. 가능한 집합적 행동을 피하거나 통제해야 하는 시나리오에서는 유충 간의 잠재적 영향을 설명하기 위해 개별 테스트 또는 대조 실험의 통합을 구현하여 모든 편향에 대응할 수 있습니다.
반면에, 암컷 산란 부위 선호 프로토콜은 다른 암컷의 선호에 영향을 받지 않고 독립적으로 개별 선택을 평가하여 집단 행동을 피할 수 있는 주목할 만한 이점을 제공합니다. 실제로, calliphorid 암컷 산란 선택은 동종 파리의 존재에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 알려져 있다46,47. 그럼에도 불구하고 실험적 분석의 내재적 한계를 인정하는 것이 중요합니다. 알은 부적절한 조건이나 암컷의 미성숙으로 인해 4시간 실험 기간 내에 낳지 않을 수 있습니다. 이러한 불확실성으로 인해 알을 낳지 않은 반복실험의 부분 집합이 생성됩니다(시험의 78%). 또한, 각 복제에서 낳은 난자 수의 범위가 넓기 때문에(26 - 208, 평균 ± 표준 편차 = 132.4 ± 46.2) 상당한 변동성이 발생하여 암컷의 선호도에 따른 변이와 실험 중 제한된 난자 보유량 또는 늦은 알을 낳는 등의 요인에 의해 영향을 받는 변이를 구별하기가 어렵습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 제안된 프로토콜은 산란 부위 선호도를 효과적으로 평가하는 데 적합하다.
전반적으로, 개발된 프로토콜은 날파리 행동을 연구하는 데 있어 광범위한 응용 분야에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 첫째, 이러한 검사는 동일한 종 내에서 유충 또는 암컷 선호도에 대한 다양한 사육 또는 발달 조건과 같은 다양한 처리의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 잠재적으로 행동 선호도와 유전적 기초를 주도하는 근본적인 메커니즘을 밝힐 수 있으며, 특히 시퀀싱 기술과 결합될 때 더욱 그렇습니다. 더욱이, 이러한 테스트는 다양한 날파리 종의 기질 선호도를 조사하도록 확장될 수 있으며, 이 그룹 내에서 기생의 진화에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 날파리가 나타내는 다양한 선호도를 탐구함으로써 생태학적 적응에 대한 더 깊은 이해를 얻을 수 있으며, 향후 해충 종의 관리 및 통제를 위한 귀중한 지식을 제공할 수 있습니다.
마지막으로, 프로토콜의 잠재력은 날파리에 대한 연구만을 넘어섭니다. 약간의 수정을 통해 이러한 프로토콜은 집파리와 살파리 또는 비슷한 크기의 곤충과 같은 다른 과에 속하는 파리 종을 평가하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 적응성은 또한 특정 과학적 탐구의 목표와 일치하는 다양한 기질을 선택할 수 있도록 합니다. 예를 들어, 연구자들은 육류의 부패 정도를 수정하거나 소의 고기를 대체 동물성 원료(예: 생선, 돼지고기) 또는 비동물성 기질(예: 과일)로 대체하여 다양한 생태학적 문제를 해결할 수 있습니다. 이러한 적응은 프로토콜의 다양성을 향상시킬 뿐만 아니라 광범위한 곤충 종과 생태학적 맥락에서 선호도를 탐구할 수 있도록 하여 곤충 행동 및 생태학적 적응의 근본적인 측면을 설명하는 능력을 향상시킵니다.
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Disclosures
아무도 선언하지 않았다.
Acknowledgments
L. 쿠프리나 군락을 제공하고 실험을 준비하는 데 도움을 준 Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim 및 Lucas de Almeida Carvalho에게 감사드립니다. 또한 비디오 촬영 및 편집에 참여해 주신 Rafael Barros de Oliveira에게도 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 동물 행동 학회(Animal Behavior Society)의 개발도상국 연구 보조금(Developing Nation Research Grant)과 T.T.T.(20/05636-4)에 대한 FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo 보조금의 지원을 받았습니다. ST와 DLF는 FAPESP(각각 19/07285-7 박사후 과정 보조금 및 21/10022-8 박사 장학금)의 지원을 받았습니다. V.A.S.C. 및 AVR은 CNPq 박사 장학금(각각 141391/2019-7, 140056/2019-0)의 지원을 받았습니다. TTT는 CNPq(310906/2022-9)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
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