Summary
本文详细介绍了用于评估蝇幼虫和雌虫的食物来源和产卵偏好的两种方案。这些包括四个选择和两个相互作用因素：基板类型和温度。这些测定能够确定幼虫的食物来源偏好和雌性的产卵部位偏好。
Abstract
蝇类（双翅目：Calliphoridae）的幼虫生活方式多种多样，通常分为专性寄生、兼性寄生和完全腐尸食性。几种寄生物种，包括专性和兼性，被认为具有卫生和经济重要性，因为它们的幼虫可引起蝇蛆病（活组织中的蛆虫感染）。然而，值得注意的是，成年雌性在选择产卵部位时起着决定性的作用，因此在很大程度上决定了幼虫的摄食习性和发育条件。在这项研究中，提出了两种方案来测试幼虫摄食偏好和雌性产卵位点偏好，考虑了两个相互作用因素：肉基质类型和温度。这里介绍的设置允许在两种温度（33 ± 2 °C 和 25 ± 2 °C）和两种类型的肉基质（补充血液的新鲜肉和 5 天大的腐烂肉）的四选择测定中测试 露西莉亚 幼虫和妊娠雌性。幼虫或妊娠雌性可以分别选择在以下任一环境中挖洞或产卵：25°C的腐烂肉（模拟食尸物种条件），33°C补充血液的鲜肉（模拟寄生物种条件），以及两个对照，33°C的腐烂肉或25°C补充血液的鲜肉。 通过计算每个重复的每个选项中产下的幼虫或卵的数量来评估偏好。将观察到的结果与随机分布进行比较，可以估计偏好的统计显着性。结果表明，在25 °C下， 乳 杆菌幼虫对腐烂基质有较强的偏好性。 相反，雌性对产卵部位的偏好在肉质类型中变化更大。这种方法可以用于测试其他类似大小的昆虫物种的偏好。其他问题也可以通过使用替代条件来探索。
Introduction
苍蝇，尤其是蝇类（包括蝇、家蝇、僵尸蝇和肉蝇等），表现出广泛的生活方式，包括寄生和坏死腐食行为1.寄生虫通常会引起蝇蛆病，即蛆虫（幼虫）对活组织的感染2。在蛆科中，专性寄生和兼性寄生物种都是主要的牲畜害虫，由于蛆虫侵扰，造成经济损失和动物福利差2,3,4,5,6,7。专性寄生虫，如新世界和旧世界的螺旋虫（分别为Cochliomyia hominivorax和Chrysomyia bezziana），与兼性寄生虫（如羊蝇（Lucilia cuprina 和 Lucilia sericata））2,5,6，7.非寄生物种，包括腐生尸虫物种，在腐烂和坏死的有机物中发育，常见于不卫生的环境中。它们严格的非寄生生活方式可以成功地用于蛆虫治疗，该疗法使用苍蝇幼虫清洁坏死组织的伤口11,12,13。苍蝇也被用于法医学，因为它们是最早发现和定植于最近死亡尸体的生物之一，发育中的幼虫是估计死亡时间的一种手段14。
由于蝇的生活方式与人类利益有关，它们已成为各种研究的主题（例如，15、16、17、18、19、20、21）。了解控制物种生活方式的生物学机制可以为改进旨在控制害虫物种的方法提供有价值的见解。此外，吹蝇生活方式的多样性和进化为研究复杂性状（例如寄生）的起源和机制提供了理想的背景。由于蛆虫以活组织为食而导致的寄生在Calliphoridae家族中独立进化了几次22,23。然而，苍蝇摄食习性的进化历史在很大程度上仍然未知，研究仅限于绘制系统发育的习性图谱（例如，16,19,22），而没有功能测定的帮助。例如，尚不确定专性寄生虫是从通才（即兼性寄生虫）进化而来的，还是直接从食尸动物进化而来的。伴随生活方式进化转变的分子、生理和行为过程也在很大程度上是未知的。
在这种情况下，兼性寄生虫，如绵羊吹蝇Lucilia cuprina，可以作为宿主的寄生虫或尸体上的尸检发育，为探索控制生活方式选择的因素和机制提供了可能性。露西莉亚·库普里纳（Lucilia cuprina）是一种世界性的物种，以引起绵羊苍蝇而闻名，尤其是在澳大利亚，它被认为是一种害虫3,16。由李氏菌引起的蝇蛆病也可发生在其他牲畜、宠物和人类中 3,24,25,26,27,28,29,30。然而，它的幼虫也可以在坏死组织和腐烂物质中发育，该物种已成功用于法医昆虫学，因为它可以非常快速地定位和定植尸体31,32,33,34。虽然苍蝇的寄生与非寄生生活方式是由幼虫阶段决定的，但选择产卵部位的是成年雌性。因此，成年雌性严重影响了幼虫的生活方式，因为后者的活动能力有限。然而，雌性的选择并不一定意味着幼虫在选择35时会更喜欢相同的基质。一种假设是，导致雌性在活体组织上产卵的行为变化可能是早期转向寄生生活方式的一部分。由此产生的幼虫的预适应或生理能力对于它们在活组织上的成功发育至关重要，从而导致寄生生活方式的出现。因此，受影响和选择的过程不一定在两个生命阶段之间保持一致。
在这种情况下，开发了两种方法来测试蝇的行为偏好，特别是对于库普里纳乳杆菌，关于幼虫摄食基质（幼虫偏好测定）和产卵部位（雌性偏好测定）。这些方法考虑了两个相互作用因素：温度和肉类新鲜度。温度被选为关键因素，因为大多数蝇蛆病病例发生在恒温动物中 2.因此，选择33°C的温度作为“寄生生活方式因素”的代表，而25°C（室温）的温度代表“非寄生因素”。选择25°C的温度，因为它代表了巴西记录的年平均温度（国家气象研究所，INMET）。此外，还考虑了两种类型的肉基质，均来自牛：（i）补充血液的新鲜肉，模仿寄生生活方式的基质，用于在实验室条件下饲养寄生的吹蝇Co. hominivorax 36，以及（ii）5天大的腐烂肉，模拟食尸癖生活方式的基质。牛基质通常用于在实验室条件下饲养 L. cuprina 27、37、38、39，因为它在可用性、成本效益和实用性方面具有多项优势，同时是一种生态上合理的基质。其他研究40,41 比较了腐烂基质与新鲜基质对苍蝇的影响，使用了 7 天龄的腐烂基质（在厌氧条件下），并显示腐烂基质对发育率、存活率和生长有不利影响。由于已知 L. cuprina 会在通常暴露在空气中的新鲜尸体上定植，因此我们决定在非密封罐（好氧和厌氧分解）中使用 5 天大的腐烂肉（碎牛肉）来模拟尸检基质。
这里介绍的实验设计具有辨别单个因素及其组合效应的偏好的优势。此外，评分的表型，即幼虫摄食基质的选择和产卵的数量，与蝇类物种的生物学和生态学方面直接相关。通过证明这些方案在 库普里纳乳杆菌中的有效性，突出了这些方案的适用性。此外，还提供了统计分析脚本，可用于将 库普里纳乳 杆菌的观测结果与模拟随机数据进行比较，确保可靠的统计分析和解释。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
苍蝇样本是使用陷阱而不是在受感染的动物身上获得的。颁发了SISBIO许可证（67867-1），用于在实验室条件下收集和饲养Calliphoridae家族的苍蝇。在巴西的研究中，昆虫样本免于伦理评估。牛肉和牛血是通过商业方式获得的，不需要道德许可。
1.幼虫摄食偏好
- 制备含有2%琼脂的培养皿
- 用2%琼脂准备四个培养皿。为此，将 6 g 细菌琼脂加入 300 mL 水中，并在微波炉中融化该混合物。然后，将体积均匀地分成四个玻璃培养皿（150 x 20 mm），每个培养皿使用约70 mL。
注：准备与所需实验重复次数相等的培养皿。在这项研究中，使用了 36 个重复。 - 琼脂凝固后，使用50 mL锥形管（直径3 cm）在琼脂上打四个孔，培养皿两侧各两个，按照提供的切割模式（图1）。
注意：此设置类似于 Fouche 等人 （2021）40 和 Boulay 等人 （2016）42 先前描述的协议。
- 用2%琼脂准备四个培养皿。为此，将 6 g 细菌琼脂加入 300 mL 水中，并在微波炉中融化该混合物。然后，将体积均匀地分成四个玻璃培养皿（150 x 20 mm），每个培养皿使用约70 mL。
- 基材的制备
- 要用血液制备新鲜肉，请在 200 克新鲜牛碎肉中加入 12 mL 稀释的牛血。充分混合。确保每种类型的肉使用不同的量筒和勺子，以避免基材之间的交叉污染。
注意：稀释的血液由50%纯血与抗凝剂（3.8%柠檬酸钠）和50%过滤水混合而成。 - 要制备腐烂的底物，将 12 mL 过滤水加入 200 g 5 天大的腐烂牛碎肉中并充分混合。
注：通过将新鲜碎肉在25°C下在非密封塑料罐中孵育五天（好氧和非好氧分解的混合物）获得腐烂的肉。每个锅里有200克新鲜的碎肉。然后将其冷冻直至使用。 - 用新鲜的肉和血液混合物填充每个培养皿中的两个孔，用腐烂的肉和水混合物填充剩余的两个孔。
注意：为避免位置偏差，请改变培养皿中不同肉类类型的位置。例如，一些培养皿应具有相同类型的肉彼此相对，而在其他培养皿中，肉类型应交叉，如图 2 所示。
- 要用血液制备新鲜肉，请在 200 克新鲜牛碎肉中加入 12 mL 稀释的牛血。充分混合。确保每种类型的肉使用不同的量筒和勺子，以避免基材之间的交叉污染。
- 实验装置
- 在25°C的室温（RT）下，将加热垫直接放置在光源下方，以均匀地照亮实验区域，并避免任何对光或对光的行为偏差。在加热垫周围放置纸板垫，以确保实验装置保持水平。
注意： 使用的光源是白色低发热发光灯，例如霓虹灯管。加热垫位于天花板灯泡正下方的桌子上（图 3）。 - 用黑色纸板盖住加热垫和找平纸板垫，然后打开加热垫。
注意：应使用黑色纸板盖以避免可能使行为测定产生偏差的视觉提示。 - 将六个带有琼脂和肉基质的培养皿放在黑色纸板上，其中两个基质，每种类型一个，在加热垫上，另外两个在加热垫表面上（图2）。让基板加热约10分钟。
注意：培养皿的盖子上可能会形成冷凝水。
- 在25°C的室温（RT）下，将加热垫直接放置在光源下方，以均匀地照亮实验区域，并避免任何对光或对光的行为偏差。在加热垫周围放置纸板垫，以确保实验装置保持水平。
- 幼虫试验
- 用红外测温仪检查基板的温度（冷侧：25±2°C;热侧：33±2°C）。
注意：加热垫在整个实验过程中保持打开状态。在实验开始和结束时进行温度测量。尽管温度确实波动了±2°C，但冷热条件之间仍有至少8°C的温差。 - 达到所需温度后，使用镊子将五个三龄幼虫放在每个培养皿的中心（图2），并用盖子盖住培养皿。让选择实验运行 10 分钟。
注意：一些幼虫可能会在培养皿的边缘和盖子上爬行。如果有任何幼虫逃脱，请使用镊子将其放回培养皿的中心。 - 10分钟后，将所有培养皿从加热垫上取下，并将它们放在不同的表面上，以避免继续加热基质。然后，计算每个基质中的幼虫数量，以及未选择任何基质的幼虫数量。
注意：如本实验中观察到的那样， Lucilia cuprina 幼虫停留在它们选择的基质中。
- 用红外测温仪检查基板的温度（冷侧：25±2°C;热侧：33±2°C）。
2.雌性产卵部位偏好
- 实验装置
- 使用事先用黑色纸板覆盖并用白色 LED 灯条均匀照亮的普通架子。
注意：应使用黑色纸板盖以避免可能使行为测定产生偏差的视觉提示。白色 LED 灯条纵向固定在实验正上方的架子中间。设置中使用的搁板相距 45 厘米。 - 在室温（25°C）下，将加热垫放在架子的中央。在加热垫周围使用纸板垫作为支撑，以确保实验装置水平。
- 用黑色纸板覆盖加热垫和找平纸板垫，以在所有基材下方保持相同的视觉图案。
- 将两个十字形玻璃容器放在一个架子上，每个容器在黑色纸板和加热垫上都应该有两个臂。在实验开始前打开白色 LED 灯条和加热垫。
- 使用 70% 乙醇清洁十字架（十字架内部和盖子内部），以避免气味污染。
- 使用事先用黑色纸板覆盖并用白色 LED 灯条均匀照亮的普通架子。
- 基材的制备
- 每个十字架准备四个培养皿（60 mm x 15 mm），加入 5 克 5 天大的腐烂或新鲜肉（每种基质两个）。
注：准备培养皿等于所需实验重复次数乘以四。在这项研究中，使用了 30 个重复样品，总共 120 个制备的培养皿。 - 在鲜肉上加入1毫升稀释的牛血（50%纯血加抗凝剂和50%过滤水），在腐烂的肉上加入1毫升过滤水。将肉（新鲜或腐烂）与液体（血液或水）彻底混合，使用不同的勺子为每种类型的肉。
注：用于雌性测定的肉的制备与幼虫测定非常相似，尽管数量不同，因为雌性测试的运行时间比幼虫测试长。请记住为每种类型的肉使用不同的移液器吸头和勺子，以避免基质之间出现任何气味交叉污染。 - 检查酒精是否已从十字架上完全蒸发。然后，将四个培养皿（每种类型的肉一个放在加热垫上，另外两个放在加热垫表面上）放在十字架的每个臂的末端（图4）。用盖子关闭十字架，让基板加热约10分钟。
注意：此外，为避免位置偏差，请改变不同肉类类型在十字架中的位置。例如，一些杂交品种的相邻手臂上应该有相同类型的肉，而在其他杂交品种中，相同的肉类型应该彼此相对，如图 4 所示。
- 每个十字架准备四个培养皿（60 mm x 15 mm），加入 5 克 5 天大的腐烂或新鲜肉（每种基质两个）。
- 女性测试
- 将妊娠雌性收集在笼中，并将它们分离到单独的管中。
注：与未怀孕的女性相比，妊娠雌性的特征是腹部增大且呈白黄色（图5）。在出苗后 10 至 16 天之间收集怀孕的雌性进行实验。 - 使用红外测温仪检查十字架中基材的温度（冷侧：25±2°C;热侧：33±2°C）。
注意：就像在幼虫测试中一样，加热垫在整个实验过程中保持打开状态。在实验的开始和结束时进行温度测量。尽管温度确实波动了±2°C，但冷热条件之间仍有至少8°C的温差。 - 将装有一名妊娠雌性的管子倒置在每个十字架中心的开口中。雌性进入十字架后，取出管子并用小盖子关闭开口。关闭所有十字架后，在架子前面放置一块黑色纸板以封闭实验装置。让实验运行4小时。
- 之后，用管子小心地抓住雌性，取出雌性，并检查基质上是否有卵。
- 用每个十字架的底物类型识别每个培养皿的盖子。使用 70% 乙醇清洁十字架（十字架内部和盖子内）免受测试中的任何气味。
注意：如果实验后不能立即计数卵，则带有底物的培养皿可以储存在-20°C。
- 将妊娠雌性收集在笼中，并将它们分离到单独的管中。
- 卵子计数
注意：如果培养皿中的底物被冷冻，请在计数前解冻。- 使用立体显微镜计算每个基质中产卵的数量。使用刷子和水帮助分离鸡蛋以计数它们。
3. 数据分析与统计
- 偏好指数计算
- 对于幼虫（n = 36）和雌性（n = 30）测试的每个重复，通过确定新鲜基质（新鲜热和新鲜冷）上存在的幼虫或卵与所有基质（新鲜热+新鲜冷+烂热+腐烂冷）上的幼虫或卵总数的比率来计算肉（指定为PI肉）的偏好指数。
PI肉 =（#新鲜基质上的幼虫或卵）/#总幼虫或卵
注意： 术语“热”和“冷”分别表示 33 ± 2 °C 和 25 ± 2 °C 的温度条件。 - 同样，计算幼虫和雌性测试的每个重复的温度偏好指数（PI温度），方法是热基质（新鲜热和腐烂热）上存在的幼虫或卵的数量除以所有基质上的幼虫或卵总数（新鲜热+新鲜冷+烂热+烂冷）。
PI温度 = （# 热基质上的幼虫或卵）/ # 总幼虫或卵
注意：接近 1 的值表示对新鲜或热基材的偏好，接近零的值表示对腐烂或冷基材的偏好。PI 可以手动计算，也可以使用提供的代码（补充文件 S1 和 补充文件 S2）进行计算。
- 对于幼虫（n = 36）和雌性（n = 30）测试的每个重复，通过确定新鲜基质（新鲜热和新鲜冷）上存在的幼虫或卵与所有基质（新鲜热+新鲜冷+烂热+腐烂冷）上的幼虫或卵总数的比率来计算肉（指定为PI肉）的偏好指数。
- 观察到的偏好与模拟随机数据的比较
- 运行提供的代码（补充文件 S1 和补充文件 S1）以生成模拟数据并将其与观测数据进行比较。
注：此代码为幼虫和雌性生成 1000 个模拟随机数据集，并计算模拟的每个重复的偏好指数 （PI） 和 L. cuprina 的观测数据。模拟假设幼虫和雌虫都没有表现出对底物的偏好，并做出随机选择。模拟结合了动物的关键行为方面，包括各种场景，例如：幼虫不选择任何基质的概率，以及成年雌性将产卵集中在单个基质上或将卵均匀或不均匀地分布在不同的基质中。广义线性模型（GLM，系列：准项式;链接：logit）用于将行为测定的观测数据与模拟的随机数据进行比较。由于偏好指数 （PI） 的有限性质，所采用的 GLM 非常适合此分析，范围在 0 到 1 之间。GLM 擅长处理非正态分布的响应变量，并允许进行稳健的统计比较。这种选择能够有效地将行为分析的观察数据与模拟随机数据生成的复杂模式进行比较，从而促进了有意义的见解。对于其他结构化数据集，可能需要对代码进行细微调整。
- 运行提供的代码（补充文件 S1 和补充文件 S1）以生成模拟数据并将其与观测数据进行比较。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了证明所提出方法的有效性，使用实验室种群Lucilia cuprina（科：Calliphoridae）进行实验，这是一种兼性寄生吹蝇2。该物种获得的整个原始数据集可以在补充文件 S3 中找到，其中包含幼虫和雌性基质偏好测试的结果。为了评估幼虫和雌虫是否表现出对任何底物的偏好，将观察到的数据与1000个模拟数据集进行比较，每个数据集代表一个随机选择（参见补充文件S1中的代码）。具有统计学意义的比较百分比（p < 0.05）被用作评估偏好的衡量标准。从该分析中可以明显看出，幼虫在25°C下表现出对腐烂基质的明显偏好（图6A，表1），因为观察到的数据与每个模拟随机选择数据集之间的所有1000次比较都发现肉和温度条件明显不同。同样，女性也表现出对25°C的明显偏好：69.7%的观察数据与随机选择之间的比较发现显着不同（图6B，表1）。然而，他们对腐烂肉的偏好更为微妙（图6B，表1），因为只有27.1%的观察与随机选择比较是显着的。 这项研究的另一个观察结果是，L. cuprina 的幼虫通常会在实验的前 2 分钟内迅速做出选择并钻入肉基质中。在10分钟的实验中，他们很少改变到另一种状态。
图1：含琼脂的培养皿的幼虫取食偏好切割模式。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：幼虫摄食偏好测定布局的顶视图。 选择是随机定位的，测试在室温（25±2°C）下进行。黑色矩形代表加热垫，其温度保持在 33 ± 2 °C。 红色和蓝色圆圈分别代表补充稀释血液的鲜肉（50%）和补充水的腐烂肉。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：说明如何将幼虫实验装置放置在光源下方以避免偏向或逆光的图表。 使用的光源是白色低加热发光灯（霓虹灯管）。加热垫位于天花板灯正下方的桌子上。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：雌性产卵位点偏好测定布局的顶视图。 选择是随机定位的，测试在室温（25±2°C）下进行。黑色矩形代表加热垫，将温度保持在 33 ± 2 °C。 红色圆圈代表稀释血液的鲜肉（50%），蓝色圆圈代表带水的腐烂肉。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：妊娠雌性（右）与未妊娠雌性（左）的照片。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：在笛卡尔平面上显示的幼虫 （A） 和雌性 （B） 的肉类型和温度的平均偏好指数 （PI）。 黑色圆圈代表平均PI，考虑了 为L. cuprina 获得的所有实验重复（幼虫n = 36，雌性实验n = 30）。每个灰色圆圈表示模拟数据集的肉类和温度的平均PI，其特征与观察到的数据集相似（例如，重复次数相同），但表示随机选择。彩色窗格可作为视觉辅助工具，描绘四个选项中每个选项的偏好 PI 区域，蓝色表示 25 ± 2 °C 时的腐烂肉，33 ± 2 °C 时绿色表示腐烂的肉，25 ± 2 °C 时黄色表示鲜肉，33 ± 2 °C 时橙色表示鲜肉。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 阶段 | 比较 | PImeat的重要比较 | PItemp 的重要比较 |
| 幼虫 | 模拟假设与零假设 （p < 0.05） | 3.8% | 2.1% |
| 观察与模拟 （p < 0.05） | 100.0% | 100.0% | |
| 女性 | 模拟假设与零假设 （p < 0.05） | 3.3% | 4.6% |
| 观察与模拟 （p < 0.05） | 27.1% | 69.7% |
表 1.（i） 模拟随机数据（无偏好）和统计零假设，以及 （ii） 观测数据和模拟随机数据之间比较的显着 PI肉 和 PI温度 的百分比（p 值< 0.05）。幼虫和雌虫的结果分别呈现。
补充文件 S1：用于 R markdown 中数据分析和统计的代码。请点击这里下载此文件。
补充文件S2：统计分析报告。请点击这里下载此文件。
补充文件 S3：四种基质选择中每一种的 Lucilia cuprina 幼虫和雌性偏好的原始计数。请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
了解摄食习性的演变，特别是在蝇的寄生背景下，需要检查不同生命阶段的基质偏好，以便摄食或产卵。因此，在这项研究中，提出了稳健而直接的方法来研究蝇幼虫和雌虫的基质偏好。这些方法在兼性寄生吹蝇 Lucilia cuprina 2 中进行了测试。有趣的是，这些实验揭示了 L. cuprina 幼虫在 25 °C 下对腐烂肉的明显倾向，这与食尸动物通常使用的条件一致。这与 Fouche 等人40 的一项研究不同，该研究显示 Lucilia sericata 和 Calliphora vicina 偏爱新鲜的肝脏基质，并表明腐烂的基质对生存和生长产生负面影响。然而，很难比较这两项研究的结果，因为肉类腐烂的程度（7天与5天）和分解过程（纯厌氧与好氧和厌氧）是不同的。使用的物种也不同。此外，这里介绍的实验观察表明，雌性更喜欢在25°C下产卵，而对腐烂的肉只有轻微的偏好。这些结果表明，幼虫和雌虫的选择并不相同，雌虫在产卵部位选择上比幼虫在穴居和食物选择上表现出更多样化的选择。这表明 L. cuprina 的寄生习性是由雌性产卵选择的变化引起的，而不是由幼虫摄食偏好引起的。值得一提的是，这些发现证明了这些方法在阐明不同发育阶段的苍蝇生活方式方面的有效性和实用性。
使用不同的肉类和温度条件来模拟寄生和尸检的生活方式因素。这种方法有助于在四选择测定中使用两个相互作用因素来评估幼虫摄食和雌性产卵位点偏好。所采用的方案代表了一种偏离先前研究中通常使用的传统双选技术的方法 43,44,45,46,47,48,49,50。为了尽量减少可能影响行为的环境因素（如光线、视觉或气味线索）引起的变化，实施了严格的控制措施。在测定中，来自上方的均匀和一致的照明得以维持，以避免对光线产生任何偏见，并辅以使用黑色背景，以防止潜在的视觉线索对幼虫和雌性偏好的影响。此外，通过使用玻璃或一次性塑料材料、手套和单独的器皿，避免了腐烂和新鲜肉类基质之间交叉污染的风险。事实证明，这些措施的应用对于建立可控和可信的实验框架至关重要，从而确保了所获得结果的稳健性和可靠性。
幼虫实验设计与先前描述的双选择测定法40,42 相似，并进行了调整以纳入温度因子。这里描述的幼虫方案被证明是快速、稳健和直接的，因为幼虫表现出强烈的倾向，即在它们选择的底物中保持洞穴，从而消除了在实验结束时因切换底物而产生的模棱两可的评分问题的可能性。这一特殊功能使实验者能够同时进行六次或更多次重复，而不会出现结果不明确或不确定的风险。尽管同一重复中存在多个幼虫会影响个体选择，但该方案允许通过独立重复评估一般底物偏好。在需要避免或控制可能的聚集行为的情况下，可以实施单独测试或结合对照实验以考虑幼虫之间的潜在影响，以抵消任何偏差。
另一方面，雌性产卵位点偏好协议具有独立评估个体选择的显着优势，不受其他雌性偏好的影响，从而避免了聚集行为。事实上，众所周知，胼胝体雌性产卵选择可以受到同种苍蝇46,47的影响。然而，重要的是要承认实验测定的固有局限性。由于不合适的条件，或者更有可能的是，雌性不成熟，卵可能不会在4小时的实验窗口内产下。这种不确定性导致一部分重复没有产卵（78%的试验）。此外，每次重复产卵数量范围很广（26 至 208，平均值±标准差 = 132.4 ± 46.2）引入了相当大的变异性，因此很难区分由雌性偏好驱动的变异和受实验期间卵储备有限或产卵延迟等因素影响的变化。尽管存在这些局限性，但所提出的方案适用于有效评估产卵地点偏好。
总体而言，所开发的协议在研究吹蝇行为方面具有广泛的应用潜力。首先，这些测试可用于检查各种处理（例如不同的饲养或发育条件）对同一物种内幼虫或雌性偏好的影响。这可能会揭示驱动行为偏好的潜在机制及其遗传基础，特别是当与测序技术相结合时。此外，这些测试可以扩展到研究不同吹蝇物种的底物偏好，为该群体内寄生的进化提供有价值的见解。通过深入研究苍蝇表现出的多样化偏好，可以更深入地了解其生态适应性，为未来有害生物物种的管理和控制提供有价值的知识。
最后，这些协议的潜力超出了对苍蝇的研究。只需稍作修改，这些协议可以很容易地应用于评估其他科的苍蝇物种，例如家蝇和肉蝇，甚至是类似大小的昆虫。协议的适应性还允许选择不同的底物以匹配特定科学探究的目标。例如，研究人员可以改变肉类腐烂的程度，或者用替代动物来源（如鱼、猪肉）或非动物基质（如水果）代替牛肉，以解决各种生态问题。这些适应不仅增强了协议的多功能性，而且还能够探索各种昆虫物种和生态背景下的偏好，从而增强阐明昆虫行为和生态适应基本方面的能力。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有宣布。
Acknowledgments
我们感谢 Patrícia J. Thyssen、Gabriela S. Zampim 和 Lucas de Almeida Carvalho 提供 L. cuprina 菌落并协助建立实验。我们还要感谢拉斐尔·巴罗斯·德·奥利维拉（Rafael Barros de Oliveira）拍摄和编辑视频。这项研究得到了动物行为学会对 V.A.S.C. 的发展中国家研究资助和对 T.T.T. （20/05636-4） 的 FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo 资助的支持。S.T. 和 D.L.F. 得到了 FAPESP 的支持（分别为 19/07285-7 博士后资助和 21/10022-8 博士奖学金）。V.A.S.C. 和 A.V.R. 获得了 CNPq 博士奖学金的支持（分别为 141391/2019-7、140056/2019-0）。T.T.T. 得到了 CNPq （310906/2022-9） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
References
- Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
- Zumpt, F. Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , Butterworths. London. (1965).
- Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
- Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
- Mullen, G. R., Durden, L. A. Medical and veterinary entomology. , Academic press. (2009).
- Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
- World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , Paris. (2013).
- Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45 (2018).
- Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30 (2016).
- Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551 (2020).
- Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
- Greenberg, B.
- Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
- Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
- McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
- Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
- Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230 (2021).
- Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
- Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598 (2016).
- Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
- Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
- Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
- Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
- Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
- Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
- Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
- Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
- Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
- Smith, K. G. V. A manual of forensic entomology. , Cornell University Press. UK. (1986).
- Goff, M. L. A Fly for the Prosecution. , Harvard University Press. Cambridge, MA and London, England. (2001).
- CRC Press. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , CRC Press. Boca Raton. (2001).
- Greenberg, B., Kunich, J. C. Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
- Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
- Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
- Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
- Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
- Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
- Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791 (2021).
- Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
- Boulay, J., Deneubourg, J. -L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676 (2016).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
- Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
- Yang, S. -T., Shiao, S. -F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
- Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
- Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
- Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420 (2017).
- Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).
