Summary
In diesem Artikel werden zwei Protokolle zur Beurteilung der Nahrungsquelle und der Eiablagepräferenzen bei Larven und Weibchen von Schmeißfliegen beschrieben. Diese umfassen vier Auswahlmöglichkeiten mit zwei interagierenden Faktoren: Substrattyp und Temperatur. Die Assays ermöglichen die Bestimmung der Nahrungsquellenpräferenz der Larven und der Eiablagepräferenz für die Weibchen.
Abstract
Schmeißfliegen (Diptera: Calliphoridae) weisen eine breite Palette von Larvenlebensweisen auf, die typischerweise als obligater Parasitismus, fakultativer Parasitismus und vollständige Sapro-Nekrophagie klassifiziert werden. Mehrere parasitäre Arten, sowohl obligat als auch fakultativ, gelten als von hygienischer und wirtschaftlicher Bedeutung, da ihre Larven Myiasis (Madenbefall in lebendem Gewebe) verursachen können. Bemerkenswert ist jedoch, dass das erwachsene Weibchen bei der Wahl des Eiablageplatzes eine entscheidende Rolle spielt und damit maßgeblich das Fressverhalten und die Entwicklungsbedingungen der Larven bestimmt. In dieser Studie werden zwei Protokolle vorgeschlagen, um die Fresspräferenz der Larven und die Präferenz der weiblichen Eiablage unter Berücksichtigung zweier interagierender Faktoren zu testen: Fleischsubstrattyp und Temperatur. Die hier vorgestellten Versuchsanordnungen ermöglichten es, Lucilia cuprina-Larven und trächtige Weibchen in einem Vier-Auswahl-Assay mit zwei Temperaturen (33 ± 2 °C und 25 ± 2 °C) und zwei Arten von Fleischsubstraten (frisches Fleisch mit Blut und 5 Tage altes verdorbenes Fleisch) zu testen. Larven oder trächtige Weibchen können wählen, ob sie ihre Eier in einer der folgenden Sorten eingraben bzw. ablegen möchten: verdorbenes Fleisch bei 25 °C (simuliert einen nekrophagen Artenzustand), frisches Fleisch, das mit Blut bei 33 °C angereichert wird (simuliert einen parasitären Artzustand) und zwei Kontrollen, verdorbenes Fleisch bei 33 °C oder frisches Fleisch, das mit Blut bei 25 °C ergänzt wird. Die Präferenz wird bewertet, indem die Anzahl der Larven oder Eier gezählt wird, die in jeder Option für jedes Replikat gelegt wurden. Der Vergleich der beobachteten Ergebnisse mit einer Zufallsverteilung ermöglichte die Schätzung der statistischen Signifikanz der Präferenz. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass L. cuprina-Larven eine starke Präferenz für das verrottete Substrat bei 25 °C haben. Umgekehrt war die Präferenz der Weibchen für die Eiablage für die Fleischsorte unterschiedlicher. Diese Methodik kann angepasst werden, um die Präferenz anderer Insektenarten ähnlicher Größe zu testen. Auch andere Fragestellungen können unter Verwendung alternativer Bedingungen untersucht werden.
Introduction
Fliegen, insbesondere Calyptrat-Muskoide (u.a. Schmeißfliegen, Stubenfliegen, Bot-Fliegen und Fleischfliegen), zeigen ein breites Spektrum an Lebensweisen, das parasitäre und nekro-saprophage Verhaltensweisen umfasst1. Parasitäre Arten verursachen typischerweise Myiasis, einen Befall von lebendem Gewebe durch Maden (Larven)2. In der Familie der Calliphoridae sind sowohl obligate als auch fakultative parasitäre Arten die Hauptursachen für wirtschaftliche Verluste und schlechtes Tierwohl aufgrund von Madenbefall 2,3,4,5,6,7. Besonders problematisch sind obligate Parasiten wie der Neuwelt- und der Altwelt-Schraubenwurm (Cochliomyia hominivorax bzw. Chrysomyia bezziana) 4,7,8,9,10 sowie fakultative Parasiten wie die Schafschmeißfliegen (Lucilia cuprina und Lucilia sericata)2,5,6, 7. Anmelden Nicht-parasitäre Arten, einschließlich sapro-nekrophager Arten, entwickeln sich in verrottender und nekrotischer organischer Substanz und sind häufig in unhygienischen Umgebungen zu finden. Ihre strikt nicht-parasitäre Lebensweise kann erfolgreich für die Madentherapie eingesetzt werden, bei der Fliegenlarven verwendet werden, um Wunden von nekrotischem Gewebe zu reinigen11,12,13. Schmeißfliegen werden auch in der Forensik eingesetzt, da sie zu den ersten Organismen gehören, die kürzlich verstorbene Leichen lokalisieren und besiedeln, wobei die sich entwickelnden Larven dazu dienen, den Todeszeitpunkt abzuschätzen14.
Die Lebensweise von Schmeißfliegen war aufgrund ihrer Bedeutung in Bezug auf menschliche Interessen Gegenstand verschiedener Forschungsstudien (z. B. 15,16,17,18,19,20,21). Das Verständnis der biologischen Mechanismen, die die Lebensweise einer Art steuern, kann wertvolle Erkenntnisse zur Verbesserung von Methoden zur Bekämpfung von Schädlingsarten liefern. Darüber hinaus bietet die Vielfalt und Evolution der Lebensweise von Schmeißfliegen einen idealen Kontext, um die Ursprünge und Mechanismen komplexer Merkmale (z.B. Parasitismus) zu untersuchen. Parasitismus durch Maden, die sich von lebendem Gewebe ernähren, hat sich innerhalb der Familie der Calliphoridae mehrmals unabhängig voneinander entwickelt22,23. Die Evolutionsgeschichte der Fressgewohnheiten von Schmeißfliegen ist jedoch noch weitgehend unbekannt, da sich die Studien darauf beschränken, die Gewohnheiten entlang der Phylogenien (z. B. 16,19,22) ohne die Hilfe von funktionellen Assays zu kartieren. Zum Beispiel ist es ungewiss, ob sich obligate Parasiten aus Generalisten (d.h. fakultativen Parasiten) oder direkt aus nekrophagen Arten entwickelt haben. Die molekularen, physiologischen und verhaltensbezogenen Prozesse, die mit den evolutionären Veränderungen des Lebensstils einhergehen, sind ebenfalls weitgehend unbekannt.
In diesem Zusammenhang bieten fakultative Parasiten, wie z.B. die Schafschmeißfliege Lucilia cuprina, die sich als Parasiten auf einem Wirt oder als Nekrophagen auf Kadavern entwickeln können, die Möglichkeit, die Faktoren und Mechanismen zu erforschen, die die Wahl des Lebensstils steuern. Lucilia cuprina ist eine kosmopolitische Art, die dafür bekannt ist, Schaffliegenbefall zu verursachen, insbesondere in Australien, wo sie als Schädling gilt 3,16. Myiasis durch L. cuprina kann auch bei anderen Nutztieren, Haustieren und Menschen auftreten 3,24,25,26,27,28,29,30. Ihre Larven können sich jedoch auch in nekrotischen Geweben und verwesender Materie entwickeln, und diese Art wurde erfolgreich in der forensischen Entomologie eingesetzt, da sie sehr schnell Leichen lokalisiert und besiedelt31,32,33,34. Obwohl die parasitäre vs. nicht-parasitäre Lebensweise von Schmeißfliegen durch das Larvenstadium definiert wird, ist es das erwachsene Weibchen, das den Eiablageplatz auswählt. Folglich beeinflusst das erwachsene Weibchen die Lebensweise der Larven stark, da diese in ihrer Beweglichkeit eingeschränkt sind. Die Wahl des Weibchens bedeutet jedoch nicht zwangsläufig, dass die Larven das gleiche Substrat bevorzugen würden, wenn sie die Wahl hätten35. Eine Hypothese ist, dass Verhaltensänderungen, die dazu führten, dass Weibchen ihre Eier auf lebendem Gewebe ablegten, Teil einer frühen Umstellung auf eine parasitäre Lebensweise gewesen sein könnten. Voranpassungen oder physiologische Fähigkeiten der entstehenden Larven wären für ihre erfolgreiche Entwicklung auf dem lebenden Gewebe unerlässlich gewesen, was zur Entstehung der parasitären Lebensweise geführt hätte. Daher müssen die betroffenen und ausgewählten Prozesse nicht unbedingt zwischen beiden Lebensphasen übereinstimmen.
In diesem Zusammenhang wurden zwei Methoden entwickelt, um die Verhaltenspräferenz von Schmeißfliegen, insbesondere für L. cuprina, in Bezug auf das Futtersubstrat der Larven (Larvenpräferenz-Assay) und den Eiablageort (weiblicher Präferenz-Assay) zu testen. Bei diesen Methoden werden zwei Faktoren berücksichtigt, die zusammenwirken: Temperatur und Frische des Fleisches. Die Temperatur wurde als entscheidender Faktor gewählt, da die meisten Fälle von Myiasis bei homöothermen Tieren auftreten2. Daher wurde eine Temperatur von 33 °C als Proxy für den "parasitären Lebensstilfaktor" gewählt, während eine Temperatur von 25 °C (Raumtemperatur) den "nicht-parasitären Faktor" darstellt. Es wurde eine Temperatur von 25 °C gewählt, da sie repräsentativ für die in Brasilien gemessene Jahresdurchschnittstemperatur ist (Nationales Institut für Meteorologie, INMET). Zusätzlich wurden zwei Arten von Fleischsubstraten in Betracht gezogen, die beide aus bovinen Quellen stammen: (i) frisches Fleisch, das mit Blut angereichert ist und das Substrat für die parasitäre Lebensweise nachahmt, das zur Aufzucht der parasitären Schmeißfliege Co. hominivorax unter Laborbedingungen verwendet wird36, und (ii) 5 Tage altes verdorbenes Fleisch, das das Substrat für die nekrophage Lebensweise nachahmt. Das Rindersubstrat wird üblicherweise für die Aufzucht von L. cuprina unter Laborbedingungenverwendet 27,37,38,39, da es mehrere Vorteile in Bezug auf Verfügbarkeit, Kosteneffizienz und Praktikabilität bietet und gleichzeitig ein ökologisch vertretbares Substrat ist. Andere Studien40,41, in denen die Wirkung von faulen und frischen Substraten bei Schmeißfliegen verglichen wurde, verwendeten 7 Tage altes, verrottetes Substrat (unter anaeroben Bedingungen) und zeigten eine nachteilige Wirkung des faulen Substrats auf die Entwicklungsraten, das Überleben und das Wachstum. Da L. cuprina dafür bekannt ist, frische Kadaver zu besiedeln, die normalerweise der Luft ausgesetzt sind, haben wir uns entschieden, 5 Tage altes verdorbenes Fleisch (Rinderhackfleisch) in nicht-hermetischen Töpfen (aerobe und anaerobe Zersetzung) zu verwenden, um ein nekrophages Substrat zu imitieren.
Die hier vorgestellten Versuchsdesigns bieten den Vorteil, dass sie sowohl für einzelne Faktoren als auch für deren kombinierte Effekte differenziert werden können. Darüber hinaus sind die bewerteten Phänotypen, d.h. die Wahl des Larvenfuttersubstrats und die Anzahl der gelegten Eier, direkt relevant für die biologischen und ökologischen Aspekte von Schmeißfliegenarten. Die Eignung dieser Protokolle wird durch den Nachweis ihrer Wirksamkeit bei L. cuprina unterstrichen. Darüber hinaus wird ein Skript für die statistische Analyse bereitgestellt, mit dem die beobachteten Ergebnisse von L. cuprina mit simulierten Zufallsdaten verglichen werden können, um eine robuste statistische Analyse und Interpretation zu gewährleisten.
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Protocol
Die Fliegenproben wurden mit Hilfe von Fallen und nicht von befallenen Tieren gewonnen. Es wurde eine SISBIO-Lizenz (67867-1) erteilt, um Fliegen der Familie Calliphoridae in Gefangenschaft unter Laborbedingungen zu sammeln und zu halten. Insektenproben sind in der brasilianischen Forschung von der ethischen Bewertung ausgenommen. Rinderfleisch und -blut wurden kommerziell gewonnen, und es war keine ethische Unbedenklichkeit erforderlich.
1. Fütterungspräferenz der Larven
- Zubereitung der Petrischalen mit 2%igem Agar
- Bereiten Sie vier Petrischalen mit 2%igem Agar zu. Geben Sie dazu 6 g bakteriologischen Agar in 300 ml Wasser und schmelzen Sie diese Mischung in der Mikrowelle. Dann teilen Sie das Volumen gleichmäßig auf vier Petrischalen aus Glas (150 x 20 mm) auf und verwenden Sie etwa 70 ml in jeder Schale.
HINWEIS: Bereiten Sie Petrischalen entsprechend der Anzahl der gewünschten experimentellen Wiederholungen vor. In dieser Studie wurden 36 Replikate verwendet. - Sobald der Agar erstarrt ist, stanzen Sie mit einem konischen 50-ml-Röhrchen (3 cm Durchmesser) vier Löcher in den Agar, zwei auf jeder Seite der Petrischale, und folgen Sie dabei dem mitgelieferten Schnittmuster (Abbildung 1).
HINWEIS: Dieser Aufbau ähnelt den zuvor beschriebenen Protokollen von Fouche et al. (2021)40 und Boulay et al. (2016)42.
- Bereiten Sie vier Petrischalen mit 2%igem Agar zu. Geben Sie dazu 6 g bakteriologischen Agar in 300 ml Wasser und schmelzen Sie diese Mischung in der Mikrowelle. Dann teilen Sie das Volumen gleichmäßig auf vier Petrischalen aus Glas (150 x 20 mm) auf und verwenden Sie etwa 70 ml in jeder Schale.
- Vorbereitung von Substraten
- Um das frische Fleisch mit Blut zuzubereiten, geben Sie 12 ml verdünntes Rinderblut zu 200 g frischem Rinderhackfleisch. Gründlich mischen. Achten Sie darauf, für jede Fleischsorte unterschiedliche Messzylinder und Löffel zu verwenden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Substraten zu vermeiden.
HINWEIS: Das verdünnte Blut besteht zu 50 % aus reinem Blut, das mit einem Gerinnungshemmer (3,8 % Natriumcitrat) und 50 % gefiltertem Wasser vermischt ist. - Um das faule Substrat vorzubereiten, geben Sie 12 ml gefiltertes Wasser in 200 g 5 Tage altes verdorbenes Rinderhackfleisch und mischen Sie es gut.
ANMERKUNG: Faules Fleisch wurde gewonnen, indem frisches Hackfleisch fünf Tage lang bei 25 °C in nicht hermetischen Kunststofftöpfen inkubiert wurde (Mischung aus aerober und nicht-aerober Zersetzung). Jeder Topf enthielt 200 g frisches Hackfleisch. Es wurde dann bis zur Verwendung eingefroren. - Füllen Sie in jeder Petrischale zwei Löcher mit der frischen Fleisch-Blut-Mischung und die restlichen zwei Löcher mit der verdorbenen Fleisch-Wasser-Mischung.
HINWEIS: Um Positionsverzerrungen zu vermeiden, variieren Sie die Platzierung der verschiedenen Fleischsorten in den Petrischalen. Zum Beispiel sollten einige Petrischalen die gleiche Fleischsorte haben, während in anderen Gerichten die Fleischsorte gekreuzt werden sollte, wie in Abbildung 2 gezeigt.
- Um das frische Fleisch mit Blut zuzubereiten, geben Sie 12 ml verdünntes Rinderblut zu 200 g frischem Rinderhackfleisch. Gründlich mischen. Achten Sie darauf, für jede Fleischsorte unterschiedliche Messzylinder und Löffel zu verwenden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Substraten zu vermeiden.
- Versuchsaufbau
- Positionieren Sie das Heizkissen bei einer Raumtemperatur (RT) von 25 °C direkt unter einer Lichtquelle, um den Versuchsbereich gleichmäßig auszuleuchten und eine Verhaltensverzerrung gegenüber oder gegen das Licht zu vermeiden. Legen Sie Papppads um das Heizkissen, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau waagerecht bleibt.
HINWEIS: Bei der verwendeten Lichtquelle handelte es sich um weißes, wärmearmes Licht, z. B. eine Neonröhre. Das Heizkissen wurde auf einem Tisch direkt unter den Deckenlampen positioniert (Abbildung 3). - Decken Sie das Heizkissen und die Nivellierpapppads mit schwarzer Pappe ab und schalten Sie das Heizkissen ein.
HINWEIS: Die schwarze Pappabdeckung sollte verwendet werden, um visuelle Hinweise zu vermeiden, die den Verhaltenstest verzerren könnten. - Legen Sie sechs Petrischalen mit Agar- und Fleischsubstrat auf den schwarzen Karton mit zwei Substraten, eines von jedem Typ, auf das Heizkissen und die anderen beiden von der Oberfläche des Heizkissens (Abbildung 2). Die Substrate ca. 10 Min. erhitzen lassen.
HINWEIS: Auf dem Deckel der Petrischalen kann sich Kondenswasser bilden.
- Positionieren Sie das Heizkissen bei einer Raumtemperatur (RT) von 25 °C direkt unter einer Lichtquelle, um den Versuchsbereich gleichmäßig auszuleuchten und eine Verhaltensverzerrung gegenüber oder gegen das Licht zu vermeiden. Legen Sie Papppads um das Heizkissen, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau waagerecht bleibt.
- Larventest
- Prüfen Sie die Temperatur der Substrate (kalte Seite: 25 ± 2 °C; heiße Seite: 33 ± 2 °C) mit einem Infrarot-Thermometer.
HINWEIS: Das Heizkissen bleibt während der gesamten Dauer des Experiments eingeschaltet. Zu Beginn und am Ende des Experiments wurden Temperaturmessungen durchgeführt. Obwohl die Temperatur um ± 2 °C schwankte, gab es immer noch einen Temperaturunterschied von mindestens 8 °C zwischen den heißen und kalten Bedingungen. - Nachdem Sie die gewünschte Temperatur erreicht haben, legen Sie fünf Larven mit einer Pinzette in die Mitte jeder Petrischale (Abbildung 2) und decken Sie die Petrischalen mit den Deckeln ab. Lassen Sie das Auswahlexperiment 10 Minuten lang laufen.
HINWEIS: Einige Larven können an den Rändern und auf dem Deckel der Petrischalen herumkrabbeln. Wenn eine Larve entweicht, lege sie mit einer Pinzette zurück in die Mitte der Petrischale. - Nach 10 Minuten alle Petrischalen vom Heizkissen nehmen und auf eine andere Oberfläche stellen, um ein weiteres Erhitzen der Substrate zu vermeiden. Zählen Sie dann die Anzahl der Larven in jedem Substrat sowie diejenigen, die kein Substrat gewählt haben.
HINWEIS: Lucilia cuprina-Larven bleiben in ihrem gewählten Substrat, wie in diesem Experiment beobachtet.
- Prüfen Sie die Temperatur der Substrate (kalte Seite: 25 ± 2 °C; heiße Seite: 33 ± 2 °C) mit einem Infrarot-Thermometer.
2. Präferenz für die Eiablage des Weibchens
- Versuchsaufbau
- Verwenden Sie ein normales Regal, das zuvor mit schwarzem Karton abgedeckt und mit weißen LED-Lichtleisten gleichmäßig ausgeleuchtet wurde.
HINWEIS: Die schwarzen Pappabdeckungen sollten verwendet werden, um visuelle Hinweise zu vermeiden, die den Verhaltenstest verzerren könnten. Die weißen LED-Streifen sind der Länge nach in der Mitte des Regals direkt über dem Experiment befestigt. Die Regale, die beim Aufbau verwendet wurden, wurden im Abstand von 45 cm platziert. - Bei RT (25 °C) ein Heizkissen in die Mitte des Regals legen. Verwenden Sie Papppads um das Heizkissen als Stütze, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau nivelliert ist.
- Decken Sie das Heizkissen und die Nivellierpapppads mit einem schwarzen Karton ab, um das gleiche visuelle Muster unter allen Substraten zu erhalten.
- Stellen Sie zwei kreuzförmige Glasbehälter auf ein Regal, jeder sollte zwei Arme über der schwarzen Pappe und dem Heizkissen haben. Schalten Sie die weißen LED-Lichtleisten und die Heizkissen vor Beginn des Experiments ein.
- Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Kreuze (im Kreuz und im Deckel) zu reinigen, um eine Geruchskontamination zu vermeiden.
- Verwenden Sie ein normales Regal, das zuvor mit schwarzem Karton abgedeckt und mit weißen LED-Lichtleisten gleichmäßig ausgeleuchtet wurde.
- Vorbereitung von Substraten
- Bereiten Sie vier Petrischalen (60 mm x 15 mm) pro Kreuz mit 5 g 5 Tage altem, verdorbenem oder frischem Fleisch (zwei von jeder Art von Substrat) zu.
HINWEIS: Bereiten Sie Petrischalen entsprechend der Anzahl der gewünschten experimentellen Wiederholungen mal vier vor. In dieser Studie wurden 30 Replikate verwendet, insgesamt 120 präparierte Petrischalen. - 1 ml verdünntes Rinderblut (50 % reines Blut mit Antikoagulans und 50 % gefiltertes Wasser) auf das frische Fleisch und 1 ml gefiltertes Wasser auf das verdorbene Fleisch geben. Mischen Sie das Fleisch (frisch oder verdorben) gründlich mit der Flüssigkeit (Blut oder Wasser) und verwenden Sie für jede Fleischsorte einen anderen Löffel.
HINWEIS: Die Vorbereitung des Fleisches für den weiblichen Test ist dem Larventest sehr ähnlich, obwohl die Mengen unterschiedlich sind, da der weibliche Test länger läuft als der Larventest. Denken Sie daran, für jede Fleischsorte unterschiedliche Pipettenspitzen und Löffel zu verwenden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Substraten zu vermeiden. - Prüfen Sie, ob der Alkohol vollständig aus den Kreuzen verdunstet ist. Platzieren Sie dann vier Petrischalen (eine von jeder Fleischsorte auf dem Heizkissen und die anderen beiden von der Oberfläche des Heizkissens) am Ende jedes Arms des Kreuzes (Abbildung 4). Die Kreuze mit dem Deckel verschließen und die Substrate ca. 10 min erhitzen lassen.
HINWEIS: Um Positionsverzerrungen zu vermeiden, variieren Sie außerdem die Platzierung der verschiedenen Fleischsorten in den Kreuzen. Zum Beispiel sollten einige Kreuzungen die gleiche Fleischsorte auf benachbarten Armen haben, während bei anderen Kreuzungen die gleiche Fleischsorte einander gegenüberliegen sollte, wie in Abbildung 4 dargestellt.
- Bereiten Sie vier Petrischalen (60 mm x 15 mm) pro Kreuz mit 5 g 5 Tage altem, verdorbenem oder frischem Fleisch (zwei von jeder Art von Substrat) zu.
- Weiblicher Test
- Sammeln Sie trächtige Weibchen im Fliegenkäfig und isolieren Sie sie in einzelne Röhrchen.
ANMERKUNG: Trächtige Weibchen zeichnen sich durch einen vergrößerten und weißlich-gelben Hinterleib im Gegensatz zu nicht-trächtigen Weibchen aus (Abbildung 5). Trächtige Weibchen wurden zwischen 10 und 16 Tagen nach dem Schlüpfen für die Experimente gesammelt. - Kontrollieren Sie die Temperatur der Substrate in den Kreuzen (kalte Seite: 25 ± 2 °C; heiße Seite: 33 ± 2 °C) mit einem Infrarot-Thermometer.
HINWEIS: Genau wie beim Larventest bleibt das Heizkissen während der gesamten Dauer des Experiments eingeschaltet. Zu Beginn und am Ende des Experiments wurden Temperaturmessungen durchgeführt. Obwohl die Temperatur um ± 2 °C schwankte, gab es immer noch einen Temperaturunterschied von mindestens 8 °C zwischen den heißen und kalten Bedingungen. - Lege das Röhrchen mit einem trächtigen Weibchen verkehrt herum in die Öffnung in der Mitte jedes Kreuzes. Nachdem das Weibchen in das Kreuz eingedrungen ist, entfernen Sie das Röhrchen und verschließen Sie die Öffnung mit dem kleinen Deckel. Nachdem Sie alle Kreuze geschlossen haben, legen Sie eine schwarze Pappe in die Vorderseite des Regals, um den Versuchsaufbau zu umschließen. Lassen Sie das Experiment 4 Stunden lang laufen.
- Danach entfernst du das Weibchen, indem du es vorsichtig mit einem Röhrchen auffängst und prüfst, ob sich Eier auf den Substraten befinden.
- Identifizieren Sie den Deckel jeder Petrischale mit dem Substrattyp aus jedem Kreuz. Verwenden Sie 70%iges Ethanol, um die Kreuze (im Inneren des Kreuzes und des Deckels) von jeglichem Geruch aus dem Test zu reinigen.
HINWEIS: Falls die Eier nicht direkt nach dem Versuch gezählt werden können, können die Petrischalen mit Substraten bei -20 °C gelagert werden.
- Sammeln Sie trächtige Weibchen im Fliegenkäfig und isolieren Sie sie in einzelne Röhrchen.
- Anzahl der Eier
HINWEIS: Wenn die Substrate in den Petrischalen gefroren waren, tauen Sie sie vor dem Zählen auf.- Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Anzahl der Eier zu zählen, die in jedes Substrat gelegt wurden. Verwende eine Bürste und Wasser, um die Eier zu trennen und zu zählen.
3. Datenanalyse und Statistik
- Berechnung von Präferenzindizes
- Berechnen Sie für jede Wiederholung von Larven- (n = 36) und Weibchentests (n = 30) den Präferenzindex für Fleisch (alsPI-Fleisch bezeichnet), indem Sie das Verhältnis der Larven oder Eier auf frischen Substraten (frisch heiß und frisch kalt) zur Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten (frisch heiß + frisch kalt + faul heiß + verdorben kalt) bestimmen.
PI-Fleisch = (# Larven oder Eier auf frischen Substraten) / # Gesamtzahl der Larven oder Eier
HINWEIS: Die Begriffe "heiß" und "kalt" beziehen sich auf Temperaturbedingungen von 33 ± 2 °C bzw. 25 ± 2 °C. - Berechnen Sie auch den Präferenzindex für die Temperatur (PITemp) für jede Wiederholung von Larven- und Weibchentests als die Anzahl der Larven oder Eier, die auf heißen Substraten (frisch heiß und faul heiß) vorhanden sind, geteilt durch die Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten (frisch heiß + frisch kalt + faul heiß + verdorben kalt).
PItemp = (# Larven oder Eier auf heißen Substraten) / # Gesamtzahl der Larven oder Eier
HINWEIS: Werte nahe 1 spiegeln eine Präferenz für frische oder heiße Substrate wider, und Werte nahe Null zeigen eine Präferenz für faule oder kalte Substrate an. Die PIs können manuell oder mit dem bereitgestellten Code (Supplemental Files S1 und Supplemental Files S2) berechnet werden.
- Berechnen Sie für jede Wiederholung von Larven- (n = 36) und Weibchentests (n = 30) den Präferenzindex für Fleisch (alsPI-Fleisch bezeichnet), indem Sie das Verhältnis der Larven oder Eier auf frischen Substraten (frisch heiß und frisch kalt) zur Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten (frisch heiß + frisch kalt + faul heiß + verdorben kalt) bestimmen.
- Vergleich der beobachteten Präferenz mit simulierten Zufallsdaten
- Führen Sie den bereitgestellten Code (Ergänzungsdatei S1 und Ergänzungsdatei S1) aus, um die simulierten Daten zu generieren und mit den beobachteten Daten zu vergleichen.
HINWEIS: Dieser Code generiert 1000 simulierte zufällige Datensätze für Larven und Weibchen und berechnet die Präferenzindizes (PIs) für jede Replikation der simulierten und beobachteten Daten von L. cuprina. Die Simulationen gehen davon aus, dass sowohl Larven als auch Weibchen keine Substratpräferenz aufweisen und zufällige Entscheidungen treffen. Die Simulationen berücksichtigen wichtige Verhaltensaspekte der Tiere und umfassen verschiedene Szenarien, wie z. B. die Wahrscheinlichkeit, dass die Larven kein Substrat auswählen und dass erwachsene Weibchen ihre Eiablage auf ein einziges Substrat konzentrieren oder ihre Eier entweder gleichmäßig oder nicht gleichmäßig auf verschiedene Substrate verteilen. Verallgemeinerte lineare Modelle (GLM, Familie: Quasibinomial; Link: Logit) wurden verwendet, um die beobachteten Daten aus den Verhaltensassays mit den simulierten Zufallsdaten zu vergleichen. Der verwendete GLM war für diese Analyse aufgrund der begrenzten Natur des Präferenzindex (PI), der zwischen 0 und 1 liegt, gut geeignet. GLMs sind versiert im Umgang mit nicht-normalverteilten Antwortvariablen und ermöglichen robuste statistische Vergleiche. Diese Wahl ermöglichte aussagekräftige Erkenntnisse, indem sie es ermöglichte, beobachtete Daten aus Verhaltenstests effektiv mit komplexen Mustern zu vergleichen, die durch simulierte Zufallsdaten generiert wurden. Für andere strukturierte Datensätze können geringfügige Anpassungen am Code erforderlich sein.
- Führen Sie den bereitgestellten Code (Ergänzungsdatei S1 und Ergänzungsdatei S1) aus, um die simulierten Daten zu generieren und mit den beobachteten Daten zu vergleichen.
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Representative Results
Um die Wirksamkeit der vorgestellten Methoden zu demonstrieren, wurden die Experimente an einer Laborpopulation von Lucilia cuprina (Familie: Calliphoridae), einer fakultativen parasitären Schmeißfliege, durchgeführt2. Der gesamte Rohdatensatz für diese Art ist in der Ergänzungsdatei S3 mit den Ergebnissen der Substratpräferenztests für Larven und Weibchen zu finden. Um zu beurteilen, ob die Larven und Weibchen eine Präferenz für ein beliebiges Substrat zeigen, wurden die beobachteten Daten mit 1000 simulierten Datensätzen verglichen, die jeweils eine zufällige Auswahl darstellten (siehe Code in der Ergänzungsdatei S1). Der Prozentsatz der statistisch signifikanten Vergleiche (p < 0,05) wurde als Maß zur Beurteilung der Präferenz verwendet. Aus dieser Analyse ging hervor, dass die Larven eine ausgeprägte Präferenz für das faule Substrat bei 25 °C zeigten (Abbildung 6A, Tabelle 1), da alle 1000 Vergleiche zwischen den beobachteten Daten und jedem der simulierten Zufallsdatensätze signifikante Unterschiede für die Fleisch- und Temperaturbedingungen ergaben. Ebenso zeigten Frauen eine auffällige Präferenz für 25 °C: 69,7 % der Vergleiche zwischen den beobachteten Daten und der zufälligen Wahl unterschieden sich signifikant (Abbildung 6B, Tabelle 1). Ihre Präferenz für verdorbenes Fleisch war jedoch nuancierter (Abbildung 6B, Tabelle 1), da nur 27,1 % der beobachteten und zufälligen Vergleiche signifikant waren. Eine weitere Beobachtung aus dieser Studie war, dass Larven von L. cuprina in der Regel eine schnelle Wahl trafen und sich innerhalb der ersten 2 Minuten des Experiments in das Fleischsubstrat eingruben. Sie wechselten während des 10-minütigen Experiments nur selten in einen anderen Zustand.
Abbildung 1: Schnittmuster der Larvenfütterungspräferenz für Petrischalen mit Agar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Draufsicht auf das Layout des Larvenfütterungspräferenz-Assays. Die Auswahlmöglichkeiten wurden nach dem Zufallsprinzip angeordnet und die Tests wurden bei RT (25 ± 2 °C) durchgeführt. Das schwarze Rechteck stellt das Heizkissen dar, das Temperaturen von 33 ± 2 °C hält. Rote und blaue Kreise stehen für frisches Fleisch, das mit verdünntem Blut (50 %) ergänzt wurde, bzw. für verdorbenes Fleisch, das mit Wasser ergänzt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Diagramm, das zeigt, wie der Larvenversuchsaufbau unterhalb der Lichtquelle positioniert werden muss, um Verzerrungen hin oder gegen Licht zu vermeiden. Als Lichtquelle wurde weißes, wärmearmes Licht (Neonröhre) verwendet. Das Heizkissen wurde auf einem Tisch direkt unter der Deckenleuchte positioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Draufsicht auf das Layout des Assays für die Präferenz der weiblichen Eiablagestelle. Die Auswahlmöglichkeiten wurden nach dem Zufallsprinzip angeordnet und die Tests wurden bei RT (25 ± 2 °C) durchgeführt. Das schwarze Rechteck stellt das Heizkissen dar, das die Temperatur bei 33 ± 2 °C hält. Rote Kreise stehen für frisches Fleisch mit verdünntem Blut (50%) und blaue Kreise für verdorbenes Fleisch mit Wasser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Foto eines trächtigen Weibchens (rechts) im Vergleich zu einem nicht-graviden Weibchen (links). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Mean Preference Indexes (PIs) für Fleischtyp und Temperatur für Larven (A) und Weibchen (B) auf einer kartesischen Ebene. Die schwarzen Kreise stellen die mittleren PIs unter Berücksichtigung aller experimentellen Replikate (n = 36 für Larven und n = 30 für weibliche Experimente) dar, die für L. cuprina erhalten wurden.Jeder der grauen Kreise kennzeichnet die mittleren PIs für Fleisch und Temperatur eines simulierten Datensatzes mit ähnlichen Merkmalen wie der beobachtete Datensatz (z. B. gleiche Anzahl von Wiederholungen), stellt aber eine zufällige Auswahl dar. Die farbigen Scheiben dienen als visuelle Hilfe, um die PI-Präferenzbereiche für jede der vier Optionen darzustellen, wobei Blau bei 25 ± 2 °C für verdorbenes Fleisch, grün für verdorbenes Fleisch bei 33 ± 2 °C, gelb für frisches Fleisch bei 25 ± 2 °C und orange für frisches Fleisch bei 33 ± 2 °C steht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Bühne | Vergleich | Aussagekräftige Vergleiche für PImeat | Aussagekräftige Vergleiche für PItemp |
| Larven | Simulierte vs. Nullhypothese (p < 0,05) | 3.8% | 2.1% |
| Beobachtet vs. simuliert (p < 0,05) | 100.0% | 100.0% | |
| Frauen | Simulierte vs. Nullhypothese (p < 0,05) | 3.3% | 4.6% |
| Beobachtet vs. simuliert (p < 0,05) | 27.1% | 69.7% |
Tabelle 1. Prozentsatz des signifikantenPI-Fleisches und derPI-Temperatur (p-Werte < 0,05) der Vergleiche zwischen (i) den simulierten Zufallsdaten (keine Präferenz) und der statistischen Nullhypothese und (ii) den beobachteten Daten und den simulierten Zufallsdaten. Die Ergebnisse werden getrennt für Larven und Weibchen dargestellt.
Ergänzende Datei S1: Code, der für die Datenanalyse und Statistik im R-Markdown verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei S2: Bericht über die statistische Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei S3: Rohzählung von Lucilia cuprina für Larven- und Weibchenpräferenz auf jeder der vier Substratwahlen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Um die Evolution der Nahrungsgewohnheiten, insbesondere im Zusammenhang mit dem Parasitismus bei Schmeißfliegen, zu verstehen, ist es erforderlich, die Substratpräferenzen in verschiedenen Lebensstadien für die Nahrungsaufnahme oder Eiablage zu untersuchen. Daher wurden in dieser Studie robuste und einfache Methoden zur Untersuchung von Substratpräferenzen bei Larven und Weibchen von Schmeißfliegen vorgeschlagen. Diese Methoden wurden an Lucilia cuprina, einer fakultativen parasitären Schmeißfliege, getestet2. Interessanterweise zeigten die Experimente eine deutliche Neigung zu verdorbenem Fleisch bei 25 °C bei L. cuprina-Larven , die mit den Bedingungen übereinstimmt, die typischerweise von nekrophagen Arten genutzt werden. Dies unterschied sich von einer Studie von Fouche et al.40, die eine Präferenz für frisches Lebersubstrat bei Lucilia sericata und Calliphora vicina zeigte und zeigte, dass das faule Substrat das Überleben und Wachstum negativ beeinflusste. Es ist jedoch schwierig, die Ergebnisse beider Studien zu vergleichen, da der Grad der Fleischzersetzung (sieben Tage gegenüber fünf Tagen in unserem Fall) und der Zersetzungsprozess (rein anaerob versus aerob und anaerob in unserem Fall) unterschiedlich waren. Auch die verwendeten Arten waren unterschiedlich. Darüber hinaus zeigten Beobachtungen aus den hier vorgestellten Experimenten, dass die Weibchen ihre Eier bevorzugt bei 25 °C legen, während sie nur eine geringe Vorliebe für verdorbenes Fleisch zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wahl von Larven und Weibchen nicht identisch ist und dass die Weibchen eine vielfältigere Wahl für ihre Eiablageplätze haben als die Larven für die Wahl des Höhlen und der Nahrungswahl. Dies deutet darauf hin, dass die parasitäre Lebensweise bei L. cuprina durch Veränderungen in der Wahl der Eiablage der Weibchen und nicht durch die Fresspräferenz der Larven verursacht wird. Insbesondere dienen diese Ergebnisse als Proof-of-Concept-Demonstration der Wirksamkeit und des Nutzens der Methoden zur Aufklärung der Lebensweise von Schmeißfliegen in verschiedenen Entwicklungsstadien.
Unterschiedliche Fleisch- und Temperaturbedingungen wurden verwendet, um parasitäre und nekrophage Lebensstilfaktoren nachzuahmen. Dieser Ansatz erleichterte die Bewertung der Larvenfütterung und der Präferenzen für die Eiablage der Weibchen in einem Vier-Auswahl-Assay unter Verwendung zweier interagierender Faktoren. Die verwendeten Protokolle stellen einen Ansatz dar, der von der traditionellen Two-Choice-Technik abweicht, die typischerweise in früheren Studien verwendet wurde 43,44,45,46,47,48,49,50. Um Schwankungen zu minimieren, die sich aus Umweltfaktoren ergeben, die das Verhalten beeinflussen könnten, wie z. B. Licht-, Seh- oder Geruchsreize, wurden strenge Kontrollmaßnahmen implementiert. In den Assays wurde eine gleichmäßige und konsistente Beleuchtung von oben beibehalten, um Verzerrungen gegenüber oder gegen das Licht zu vermeiden, ergänzt durch die Verwendung eines schwarzen Hintergrunds, um mögliche visuelle Hinweise auf die Präferenzen von Larven und Weibchen zu verhindern. Darüber hinaus wurde das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen verdorbenen und frischen Fleischsubstraten durch den Einsatz von Glas- oder Einwegkunststoffmaterial, Handschuhen und separaten Utensilien vermieden. Die Anwendung dieser Maßnahmen erwies sich als entscheidend für die Etablierung eines kontrollierten und vertrauenswürdigen experimentellen Rahmens, wodurch die Robustheit und Zuverlässigkeit der erzielten Ergebnisse sichergestellt wurde.
Das Design des Larvenexperiments ähnelte den zuvor beschriebenen Two-Choice-Assays40,42, wobei Anpassungen vorgenommen wurden, um den Temperaturfaktor einzubeziehen. Das hier beschriebene Larvenprotokoll erwies sich als schnell, robust und unkompliziert, da die Larven eine starke Tendenz aufwiesen, in ihrem gewählten Substrat zu vergraben, wodurch die Möglichkeit von mehrdeutigen Scoring-Problemen, die sich aus dem Wechsel des Substrats am Ende des Experiments ergaben, ausgeschlossen wurde. Diese besondere Funktion ermöglicht es dem Experimentator, sechs oder mehr Wiederholungen gleichzeitig durchzuführen, ohne das Risiko unklarer oder unsicherer Ergebnisse einzugehen. Obwohl das Vorhandensein mehrerer Larven innerhalb desselben Replikats die individuelle Auswahl beeinflussen kann, ermöglicht das Protokoll die Beurteilung der allgemeinen Substratpräferenz durch unabhängige Replikate. In Szenarien, in denen mögliches aggregiertes Verhalten vermieden oder kontrolliert werden muss, können Einzeltests oder die Einbeziehung von Kontrollexperimenten zur Berücksichtigung potenzieller Einflüsse zwischen den Larven durchgeführt werden, um einer Verzerrung entgegenzuwirken.
Auf der anderen Seite bietet das Präferenzprotokoll für weibliche Eiablagestellen den bemerkenswerten Vorteil, dass die individuelle Wahl unabhängig beurteilt werden kann, frei vom Einfluss der Präferenzen anderer Weibchen, wodurch aggregiertes Verhalten vermieden wird. In der Tat ist bekannt, dass die Wahl der kalliporiden weiblichen Eiablage durch das Vorhandensein von Artgenossen beeinflusst werden kann46,47. Dennoch ist es wichtig, die inhärenten Grenzen des experimentellen Assays anzuerkennen. Es kann sein, dass die Eier nicht innerhalb des 4-stündigen Versuchsfensters gelegt werden können, weil die Bedingungen ungeeignet sind oder, was wahrscheinlicher ist, weil die Weibchen noch unreif sind. Diese Unsicherheit führt dazu, dass bei einer Untergruppe der Replikate keine Eier gelegt werden (78% der Versuche). Darüber hinaus führt die große Spanne in der Anzahl der in jedem Replikat gelegten Eier (26 bis 208, mittlere ± Standardabweichung = 132,4 ± 46,2) zu einer beträchtlichen Variabilität, was es schwierig macht, zwischen Variationen zu unterscheiden, die durch die Präferenz des Weibchens angetrieben werden, und solchen, die durch Faktoren wie begrenzte Eireserven oder späte Eiablage während des Experiments beeinflusst werden. Trotz dieser Einschränkungen sind die vorgeschlagenen Protokolle geeignet, um die Präferenz des Eiablageplatzes effektiv zu bewerten.
Insgesamt bergen die entwickelten Protokolle ein erhebliches Potenzial für eine Vielzahl von Anwendungen bei der Untersuchung des Verhaltens von Schmeißfliegen. Zum einen können diese Tests eingesetzt werden, um die Auswirkungen verschiedener Behandlungen, wie z. B. unterschiedliche Haltungs- oder Entwicklungsbedingungen, auf die Präferenzen von Larven oder Weibchen innerhalb derselben Art zu untersuchen. Dies könnte möglicherweise die zugrunde liegenden Mechanismen enthüllen, die Verhaltenspräferenzen und ihre genetische Grundlage steuern, insbesondere in Verbindung mit Sequenzierungstechniken. Darüber hinaus können diese Tests erweitert werden, um die Substratpräferenzen verschiedener Schmeißfliegenarten zu untersuchen, was wertvolle Einblicke in die Evolution des Parasitismus innerhalb dieser Gruppe liefert. Durch die Auseinandersetzung mit den vielfältigen Vorlieben von Schmeißfliegen kann ein tieferes Verständnis ihrer ökologischen Anpassungen gewonnen werden, was wertvolle Erkenntnisse für das zukünftige Management und die Bekämpfung von Schädlingsarten liefert.
Schließlich geht das Potenzial der Protokolle über die Untersuchung von Schmeißfliegen hinaus. Mit geringfügigen Modifikationen können diese Protokolle leicht angewendet werden, um die Fliegenarten aus anderen Familien zu beurteilen, wie z. B. Stuben- und Fleischfliegen oder sogar Insekten ähnlicher Größe. Die Anpassungsfähigkeit der Protokolle ermöglicht auch die Auswahl verschiedener Substrate, um den Zielen spezifischer wissenschaftlicher Untersuchungen gerecht zu werden. So können Forscher beispielsweise den Grad der Fleischfäule modifizieren oder Rinderfleisch durch alternative tierische Quellen (z. B. Fisch, Schweinefleisch) oder nicht-tierische Substrate (z. B. Früchte) ersetzen, um verschiedene ökologische Fragen zu beantworten. Diese Anpassungen erhöhen nicht nur die Vielseitigkeit der Protokolle, sondern ermöglichen auch die Erforschung von Präferenzen in einer Vielzahl von Insektenarten und ökologischen Kontexten, wodurch die Fähigkeit verbessert wird, grundlegende Aspekte des Insektenverhaltens und der ökologischen Anpassung aufzuklären.
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Disclosures
Keine deklariert.
Acknowledgments
Wir danken Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim und Lucas de Almeida Carvalho für die Bereitstellung der L. cuprina-Kolonie und für ihre Unterstützung bei der Einrichtung des Experiments. Wir möchten uns auch bei Rafael Barros de Oliveira für das Filmen und Schneiden des Videos bedanken. Diese Forschung wurde durch den Developing Nation Research Grant der Animal Behavior Society an V.A.S.C. und durch einen FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo Grant an T.T.T. (20/05636-4) unterstützt. S.T. und D.L.F. wurden durch ein FAPESP unterstützt (19/07285-7 Postdoktorandenstipendium bzw. 21/10022-8 PhD-Stipendium). V.A.S.C. und A.V.R. wurden durch CNPq-Promotionsstipendien unterstützt (141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. wurde von CNPq (310906/2022-9) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
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