Summary
In questo articolo, vengono descritti in dettaglio due protocolli per valutare la fonte di cibo e le preferenze di ovideposizione nelle larve e nelle femmine di mosconi. Questi comprendono quattro scelte con due fattori interagenti: il tipo di substrato e la temperatura. I saggi consentono di determinare la preferenza per la fonte di cibo delle larve e la preferenza per il sito di ovideposizione per le femmine.
Abstract
I mosconi (Diptera: Calliphoridae) presentano una vasta gamma di stili di vita larvali, tipicamente classificati come parassitismo obbligato, parassitismo facoltativo e sapro-necrofagia completa. Diverse specie parassite, sia obbligate che facoltative, sono considerate di importanza sanitaria ed economica, in quanto le loro larve possono causare miasi (infestazione da vermi nei tessuti vivi). Tuttavia, è interessante notare che la femmina adulta gioca un ruolo decisivo nella scelta del sito di ovideposizione e, quindi, determina in gran parte l'abitudine alimentare e le condizioni di sviluppo delle larve. In questo studio, vengono proposti due protocolli per testare la preferenza per l'alimentazione larvale e la preferenza per il sito di ovideposizione della femmina considerando due fattori interagenti: il tipo di substrato della carne e la temperatura. Le configurazioni qui presentate hanno permesso di testare le larve di Lucilia cuprina e le femmine gravide in un test a quattro scelte con due temperature (33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C) e due tipi di substrati di carne (carne fresca integrata con sangue e carne marcia di 5 giorni). Le larve o le femmine gravide possono scegliere di scavare o deporre le uova, rispettivamente, in uno dei seguenti modi: carne marcia a 25 °C (che simula una condizione di specie necrofaga), carne fresca integrata con sangue a 33 °C (che simula una condizione di specie parassita) e due controlli, carne marcia a 33 °C o carne fresca integrata con sangue a 25 °C. La preferenza viene valutata contando il numero di larve o uova deposte in ciascuna opzione per ogni replica. Il confronto dei risultati osservati con una distribuzione casuale ha permesso di stimare la significatività statistica della preferenza. I risultati hanno indicato che le larve di L. cuprina hanno una forte preferenza per il substrato marcio a 25 °C. Al contrario, la preferenza del sito di ovideposizione da parte delle femmine era più varia per il tipo di carne. Questa metodologia può essere adattata per testare la preferenza di altre specie di insetti di dimensioni simili. Altre domande possono essere esplorate utilizzando condizioni alternative.
Introduction
Le mosche, in particolare i muscoidi caliptrati (tra cui moscerini, mosche domestiche, mosche bot e moscerini della carne, tra gli altri), mostrano una vasta gamma di stili di vita, che comprendono comportamenti parassiti e necro-saprofagi. Le specie parassite causano tipicamente la miasi, un'infestazione di tessuti vivi da parte di vermi (larve)2. Nella famiglia Calliphoridae, sia le specie parassite obbligate che quelle facoltative sono i principali parassiti del bestiame responsabili di perdite economiche e scarso benessere degli animali a causa di infestazioni di vermi 2,3,4,5,6,7. I parassiti obbligati, come i vermi del Nuovo Mondo e del Vecchio Mondo (rispettivamente Cochliomyia hominivorax e Chrysomyia bezziana), sono particolarmente problematici 4,7,8,9,10 insieme ai parassiti facoltativi, come i moscerini delle pecore (Lucilia cuprina e Lucilia sericata)2,5,6, 7. Introduzione Le specie non parassite, comprese quelle sapro-necrofaghe, si sviluppano nella materia organica in decomposizione e necrotica e si trovano comunemente in ambienti non igienici. Il loro stile di vita rigorosamente non parassitario può essere utilizzato con successo per la terapia dei vermi, che utilizza larve di mosca per pulire le ferite dai tessuti necrotici11,12,13. I mosconi sono utilizzati anche nella scienza forense, in quanto sono tra i primi organismi a localizzare e colonizzare corpi deceduti di recente, con le larve in via di sviluppo che servono come mezzo per stimare l'ora della morte14.
Gli stili di vita dei mosconi sono stati oggetto di vari studi di ricerca (ad esempio, 15,16,17,18,19,20,21) a causa della loro importanza in relazione agli interessi umani. Comprendere i meccanismi biologici che governano lo stile di vita di una specie può fornire preziose informazioni per migliorare i metodi volti a controllare le specie nocive. Inoltre, la diversità e l'evoluzione degli stili di vita dei moscerini offrono un contesto ideale per studiare le origini e i meccanismi di tratti complessi (ad esempio, il parassitismo). Il parassitismo dovuto ai vermi che si nutrono di tessuti vivi si è evoluto indipendentemente diverse volte all'interno della famiglia Calliphoridae22,23. Tuttavia, la storia evolutiva delle abitudini alimentari dei mosconi è ancora in gran parte sconosciuta, con studi limitati a mappare le abitudini lungo le filogenesi (ad esempio, 16,19,22) senza l'ausilio di saggi funzionali. Ad esempio, non è chiaro se i parassiti obbligati si siano evoluti da generalisti (cioè parassiti facoltativi) o direttamente da specie necrofaghe. Anche i processi molecolari, fisiologici e comportamentali che accompagnano i cambiamenti evolutivi nello stile di vita sono in gran parte sconosciuti.
In questo contesto, parassiti facoltativi, come il moscerino delle pecore Lucilia cuprina, che possono svilupparsi come parassiti su un ospite o come necrofagi su cadaveri, offrono la possibilità di esplorare i fattori e i meccanismi che controllano le scelte di vita. La Lucilia cuprina è una specie cosmopolita nota per causare l'attacco della mosca delle pecore, soprattutto in Australia dove è considerata un parassita 3,16. La miasi dovuta a L. cuprina può verificarsi anche in altri animali da reddito, animali domestici e nell'uomo 3,24,25,26,27,28,29,30. Tuttavia, le sue larve possono svilupparsi anche nei tessuti necrotici e nella materia in decomposizione e questa specie è stata utilizzata con successo in entomologia forense in quanto è molto veloce nel localizzare e colonizzare i cadaveri 31,32,33,34. Sebbene lo stile di vita parassitario rispetto a quello non parassitario dei mosconi sia definito dallo stadio larvale, è la femmina adulta che seleziona il sito di ovideposizione. Di conseguenza, la femmina adulta influenza pesantemente lo stile di vita delle larve, in quanto queste ultime hanno una mobilità limitata. Tuttavia, la scelta della femmina non implica necessariamente che le larve preferiscano lo stesso substrato quando si trovano di fronte a una scelta35. Un'ipotesi è che i cambiamenti comportamentali che portano le femmine a deporre le uova su tessuti vivi potrebbero essere parte di un passaggio precoce verso uno stile di vita parassitario. I pre-adattamenti o le capacità fisiologiche delle larve risultanti sarebbero stati essenziali per il loro sviluppo di successo sul tessuto vivo, portando all'emergere dello stile di vita parassitario. Pertanto, i processi interessati e selezionati potrebbero non essere necessariamente allineati tra le due fasi della vita.
In questo contesto, sono stati sviluppati due metodi per testare la preferenza comportamentale nei moscerini, in particolare, per L. cuprina, per quanto riguarda il substrato di alimentazione larvale (saggio di preferenza larvale) e il sito di ovideposizione (saggio di preferenza femminile). Questi metodi tengono conto di due fattori interagenti: la temperatura e la freschezza della carne. La temperatura è stata scelta come fattore cruciale poiché la maggior parte dei casi di miasi si verifica negli animali omeotermi2. Pertanto, una temperatura di 33 °C è stata selezionata come proxy per il "fattore di stile di vita parassitario", mentre una temperatura di 25 °C (temperatura ambiente) rappresenta il "fattore non parassitario". È stata scelta una temperatura di 25 °C in quanto rappresentativa della temperatura media annua registrata in Brasile (Istituto Nazionale di Meteorologia, INMET). Inoltre, sono stati presi in considerazione due tipi di substrati di carne, entrambi di origine bovina: (i) carne fresca integrata con sangue, che imita il substrato per lo stile di vita parassitario, che viene utilizzato per allevare il moscone parassita Co. hominivorax in condizioni di laboratorio36, e (ii) carne marcia di 5 giorni, che emula il substrato per lo stile di vita necrofago. Il substrato bovino è comunemente utilizzato per l'allevamento di L. cuprina in condizioni di laboratorio 27,37,38,39 in quanto offre numerosi vantaggi in termini di disponibilità, economicità e praticità pur essendo un substrato ecologicamente giustificabile. Altri studi40,41 che confrontano l'effetto dei substrati marci rispetto a quelli freschi nei mosconi hanno utilizzato substrati marci di 7 giorni (in condizioni anaerobiche) e hanno mostrato un effetto negativo del substrato marcio sui tassi di sviluppo, sopravvivenza e crescita. Poiché L. cuprina è nota per colonizzare cadaveri freschi che di solito sono esposti all'aria, abbiamo deciso di utilizzare carne marcia di 5 giorni (carne macinata) in vasi non ermetici (decomposizione aerobica e anaerobica) per imitare un substrato necrofago.
I disegni sperimentali qui presentati offrono il vantaggio di discernere le preferenze per i singoli fattori e i loro effetti combinati. Inoltre, i fenotipi valutati, vale a dire la scelta del substrato di alimentazione larvale e il numero di uova deposte, sono direttamente rilevanti per gli aspetti biologici ed ecologici delle specie di moscerini. L'idoneità di questi protocolli è evidenziata dimostrando la loro efficacia in L. cuprina. Inoltre, viene fornito uno script per l'analisi statistica, che può essere utilizzato per confrontare i risultati osservati ottenuti in L. cuprina con dati casuali simulati, garantendo solide analisi statistiche e interpretazioni.
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Protocol
I campioni di mosca sono stati ottenuti utilizzando trappole e non su animali infestati. È stata rilasciata una licenza SISBIO (67867-1) per la raccolta e la detenzione di mosche della famiglia Calliphoridae in cattività in condizioni di laboratorio. I campioni di insetti sono esenti da valutazione etica nella ricerca in Brasile. La carne e il sangue bovino sono stati ottenuti commercialmente e non è stata richiesta alcuna autorizzazione etica.
1. Preferenza per l'alimentazione larvale
- Preparazione delle piastre di Petri contenenti il 2% di agar
- Preparare quattro piastre di Petri con il 2% di agar. Per fare ciò, aggiungere 6 g di agar batteriologico a 300 ml di acqua e sciogliere questa miscela in microonde. Quindi, dividere il volume in modo uniforme in quattro piastre di Petri di vetro (150 x 20 mm), utilizzando circa 70 ml in ciascuna capanna.
NOTA: Preparare piastre di Petri pari al numero di repliche sperimentali desiderate. In questo studio sono state utilizzate 36 repliche. - Una volta che l'agar si è solidificato, utilizzare una provetta conica da 50 mL (3 cm di diametro) per praticare quattro fori nell'agar, due su ciascun lato della capsula di Petri, seguendo lo schema di taglio fornito (Figura 1).
NOTA: Questa configurazione è simile ai protocolli precedentemente descritti da Fouche et al. (2021)40 e Boulay et al. (2016)42.
- Preparare quattro piastre di Petri con il 2% di agar. Per fare ciò, aggiungere 6 g di agar batteriologico a 300 ml di acqua e sciogliere questa miscela in microonde. Quindi, dividere il volume in modo uniforme in quattro piastre di Petri di vetro (150 x 20 mm), utilizzando circa 70 ml in ciascuna capanna.
- Preparazione dei substrati
- Per preparare la carne fresca con il sangue, aggiungere 12 ml di sangue bovino diluito a 200 g di carne fresca macinata bovina. Mescolare accuratamente. Assicurati di utilizzare cilindri e cucchiai graduati diversi per ogni tipo di carne per evitare la contaminazione incrociata tra i substrati.
NOTA: Il sangue diluito è composto per il 50% da sangue puro miscelato con un anticoagulante (citrato di sodio al 3,8%) e acqua filtrata al 50%. - Per preparare il substrato marcio, aggiungere 12 ml di acqua filtrata a 200 g di carne macinata bovina marcia di 5 giorni e mescolare bene.
NOTA: La carne marcia è stata ottenuta incubando carne macinata fresca per cinque giorni a 25 °C in vasi di plastica non ermetici (miscela di decomposizione aerobica e non aerobica). Ogni pentola conteneva 200 g di carne macinata fresca. È stato poi congelato fino all'uso. - Riempi due fori in ogni capsula di Petri con la miscela di carne fresca e sangue e i restanti due fori con la miscela di carne marcia e acqua.
NOTA: Per evitare distorsioni di posizione, variare il posizionamento dei diversi tipi di carne nelle piastre di Petri. Ad esempio, alcune piastre di Petri dovrebbero avere lo stesso tipo di carne l'una di fronte all'altra, mentre in altre piastre il tipo di carne dovrebbe essere incrociato, come mostrato nella Figura 2.
- Per preparare la carne fresca con il sangue, aggiungere 12 ml di sangue bovino diluito a 200 g di carne fresca macinata bovina. Mescolare accuratamente. Assicurati di utilizzare cilindri e cucchiai graduati diversi per ogni tipo di carne per evitare la contaminazione incrociata tra i substrati.
- Configurazione sperimentale
- A una temperatura ambiente (RT) di 25 °C, posizionare il termoforo direttamente sotto una fonte di luce per illuminare uniformemente l'area sperimentale ed evitare qualsiasi pregiudizio comportamentale verso o contro la luce. Posiziona dei cuscinetti di cartone attorno al termoforo per assicurarti che la configurazione sperimentale rimanga livellata.
NOTA: La sorgente luminosa utilizzata era una luce bianca a bassa emissione di riscaldamento, come un tubo al neon. Il termoforo è stato posizionato su un tavolo proprio sotto le lampadine a soffitto (Figura 3). - Coprire il termoforo e i cuscinetti di cartone di livellamento con cartoncino nero e accendere il termoforo.
NOTA: La copertina di cartone nero deve essere utilizzata per evitare segnali visivi che potrebbero influenzare il test di comportamento. - Posizionare sei piastre di Petri con agar e substrato di carne sul cartone nero con due substrati, uno di ciascun tipo, sul termoforo e gli altri due sulla superficie del termoforo (Figura 2). Lasciare riscaldare i substrati per circa 10 min.
NOTA: Potrebbe formarsi della condensa sul coperchio delle piastre di Petri.
- A una temperatura ambiente (RT) di 25 °C, posizionare il termoforo direttamente sotto una fonte di luce per illuminare uniformemente l'area sperimentale ed evitare qualsiasi pregiudizio comportamentale verso o contro la luce. Posiziona dei cuscinetti di cartone attorno al termoforo per assicurarti che la configurazione sperimentale rimanga livellata.
- Test larvale
- Controllare la temperatura dei substrati (lato freddo: 25 ± 2 °C; lato caldo: 33 ± 2 °C) con un termometro a infrarossi.
NOTA: Il termoforo rimane acceso per tutta la durata dell'esperimento. Le misurazioni della temperatura sono state effettuate all'inizio e alla fine dell'esperimento. Sebbene la temperatura fluttuasse di ± 2 °C, c'era ancora una differenza di temperatura di almeno 8 °C tra le condizioni calde e fredde. - Dopo aver raggiunto la temperatura desiderata, posizionare cinque larve di terzo stadio al centro di ciascuna capsula di Petri utilizzando una pinzetta (Figura 2) e coprire le piastre di Petri con i coperchi. Lascia che l'esperimento di scelta venga eseguito per 10 minuti.
NOTA: Alcune larve possono strisciare intorno ai bordi e sul coperchio delle piastre di Petri. Se una larva fuoriesce, usa una pinzetta per riposizionarla al centro della capsula di Petri. - Dopo 10 minuti, togliere tutte le piastre di Petri dal termoforo e posizionarle su una superficie diversa per evitare di continuare a riscaldare i substrati. Quindi, conta il numero di larve in ciascun substrato, così come quelle che non hanno scelto alcun substrato.
NOTA: Le larve di Lucilia cuprina rimangono nel substrato prescelto, come osservato in questo esperimento.
- Controllare la temperatura dei substrati (lato freddo: 25 ± 2 °C; lato caldo: 33 ± 2 °C) con un termometro a infrarossi.
2. Preferenza del sito di ovideposizione femminile
- Configurazione sperimentale
- Utilizzare un normale ripiano precedentemente coperto con cartone nero e illuminato uniformemente con strisce luminose a LED bianche.
NOTA: Le copertine di cartone nero devono essere utilizzate per evitare segnali visivi che potrebbero influenzare il test di comportamento. Le strisce LED bianche sono fissate longitudinalmente al centro dello scaffale proprio sopra l'esperimento. I ripiani utilizzati nell'allestimento sono stati posizionati a 45 cm di distanza l'uno dall'altro. - A RT (25 °C), posizionare un termoforo al centro del ripiano. Utilizzare cuscinetti di cartone attorno al termoforo come supporto per garantire che la configurazione sperimentale sia livellata.
- Copri il termoforo e i cuscinetti di cartone livellante con un cartoncino nero per mantenere lo stesso motivo visivo sotto tutti i substrati.
- Posiziona due contenitori di vetro a forma di croce su un ripiano, ognuno dovrebbe avere due bracci sopra il cartone nero e il termoforo. Accendi le strisce luminose a LED bianche e i termofori prima dell'inizio dell'esperimento.
- Utilizzare etanolo al 70% per pulire le croci (all'interno della croce e del coperchio) per evitare la contaminazione degli odori.
- Utilizzare un normale ripiano precedentemente coperto con cartone nero e illuminato uniformemente con strisce luminose a LED bianche.
- Preparazione dei substrati
- Preparare quattro piastre di Petri (60 mm x 15 mm) per incrocio con 5 g di carne marcia o fresca di 5 giorni (due per ogni tipo di substrato).
NOTA: Preparare piastre di Petri pari al numero di repliche sperimentali desiderate moltiplicato per quattro. In questo studio sono state utilizzate 30 repliche, per un totale di 120 piastre di Petri preparate. - Aggiungere 1 ml di sangue bovino diluito (50% sangue puro con anticoagulante e 50% acqua filtrata) sulla carne fresca e 1 ml di acqua filtrata sulla carne marcia. Mescolare accuratamente la carne (fresca o marcia) con il liquido (sangue o acqua) utilizzando un cucchiaio diverso per ogni tipo di carne.
NOTA: La preparazione della carne per il test delle femmine è molto simile al test delle larve, anche se le quantità sono diverse perché il test delle femmine durerà più a lungo del test delle larve. Ricordarsi di utilizzare puntali e cucchiai per pipette diversi per ogni tipo di carne per evitare qualsiasi contaminazione incrociata degli odori tra i substrati. - Controlla se l'alcol è completamente evaporato dalle croci. Quindi, posiziona quattro piastre di Petri (una per ogni tipo di carne sul termoforo e le altre due sulla superficie del termoforo) all'estremità di ciascun braccio della croce (Figura 4). Chiudere le croci con i loro coperchi e lasciare che i substrati si riscaldino per circa 10 minuti.
NOTA: Inoltre, per evitare distorsioni di posizione, variare il posizionamento dei diversi tipi di carne negli incroci. Ad esempio, alcune croci dovrebbero avere lo stesso tipo di carne su braccia adiacenti, mentre in altre croci, lo stesso tipo di carne dovrebbe essere uno di fronte all'altro, come mostrato nella Figura 4.
- Preparare quattro piastre di Petri (60 mm x 15 mm) per incrocio con 5 g di carne marcia o fresca di 5 giorni (due per ogni tipo di substrato).
- Test femminile
- Raccogli le femmine gravide nella gabbia delle mosche e isolale in tubi individuali.
NOTA: Le femmine gravide sono caratterizzate dall'avere un addome allargato e giallo-biancastro in contrasto con le femmine non gravide (Figura 5). Le femmine gravide sono state raccolte tra i 10 e i 16 giorni dopo l'emersione per gli esperimenti. - Controllare la temperatura dei substrati nelle croci (lato freddo: 25 ± 2 °C; lato caldo: 33 ± 2 °C) utilizzando un termometro a infrarossi.
NOTA: Proprio come nel test larvale, il termoforo rimane acceso per tutta la durata dell'esperimento. Le misurazioni della temperatura sono state effettuate all'inizio e alla fine dell'esperimento. Sebbene la temperatura fluttuasse di ± 2 °C, c'era ancora una differenza di temperatura di almeno 8 °C tra le condizioni calde e fredde. - Metti il tubo capovolto contenente una femmina gravida nell'apertura al centro di ogni croce. Dopo che la femmina è entrata nella croce, rimuovere il tubo e chiudere l'apertura con il suo piccolo coperchio. Dopo aver chiuso tutte le croci, posiziona un cartoncino nero nella parte anteriore dello scaffale per racchiudere l'allestimento sperimentale. Lascia che l'esperimento venga eseguito per 4 ore.
- Dopodiché, rimuovi la femmina, catturandola con cura con un tubo, e controlla se c'erano uova sui substrati.
- Identificare il coperchio di ciascuna capsula di Petri con il tipo di substrato di ciascuna croce. Utilizzare etanolo al 70% per pulire le croci (all'interno della croce e del coperchio) da qualsiasi odore del test.
NOTA: Nel caso in cui le uova non possano essere contate subito dopo l'esperimento, le piastre di Petri con substrati possono essere conservate a -20 °C.
- Raccogli le femmine gravide nella gabbia delle mosche e isolale in tubi individuali.
- Conteggio delle uova
NOTA: Se i substrati nelle piastre di Petri erano congelati, scongelarli prima del conteggio.- Utilizzare uno stereomicroscopio per contare il numero di uova deposte in ciascun substrato. Usa un pennello e dell'acqua per aiutare a separare le uova per contarle.
3. Analisi dei dati e statistiche
- Calcolo degli indici di preferenza
- Per ogni replica dei test larvali (n = 36) e femminili (n = 30), calcolare l'indice di preferenza per la carne (designata comecarne PI) determinando il rapporto tra le larve o le uova presenti sui substrati freschi (fresco caldo e fresco freddo) e il conteggio totale delle larve o delle uova su tutti i substrati (fresco caldo + fresco freddo + marcio caldo + marcio freddo).
PIcarne = (# larve o uova su substrati freschi) / # Larve o uova totali
NOTA: I termini "Caldo" e "Freddo" sono indicativi di condizioni di temperatura rispettivamente di 33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C. - Allo stesso modo, calcolare l'indice di preferenza per la temperatura (PI temp) per ogni replica di test larvali e femminili come il numero di larve o uova presenti sui substrati caldi (caldo fresco e caldo marcio) diviso per il numero totale di larve o uova su tutti i substrati (caldo fresco + freddo fresco + caldo marcio + freddo marcio).
PItemp = (# larve o uova su substrati caldi) / # Larve o uova totali
NOTA: I valori vicini a 1 riflettono una preferenza per i substrati freschi o caldi e i valori vicini allo zero indicano una preferenza per i substrati marci o freddi. I PI possono essere calcolati manualmente o utilizzando il codice fornito (File supplementari S1 e File supplementari S2).
- Per ogni replica dei test larvali (n = 36) e femminili (n = 30), calcolare l'indice di preferenza per la carne (designata comecarne PI) determinando il rapporto tra le larve o le uova presenti sui substrati freschi (fresco caldo e fresco freddo) e il conteggio totale delle larve o delle uova su tutti i substrati (fresco caldo + fresco freddo + marcio caldo + marcio freddo).
- Confronto tra la preferenza osservata e i dati casuali simulati
- Eseguire il codice fornito (File supplementare S1 e File supplementare S1) per generare i dati simulati e confrontarli con i dati osservati.
NOTA: Questo codice genera 1000 set di dati casuali simulati per larve e femmine e calcola gli indici di preferenza (PI) per ogni replica dei dati simulati e osservati di L. cuprina. Le simulazioni presuppongono che sia le larve che le femmine non mostrino alcuna preferenza per il substrato e facciano scelte casuali. Le simulazioni incorporano gli aspetti comportamentali chiave degli animali, comprendendo vari scenari come: la probabilità che le larve non selezionino alcun substrato e che le femmine adulte concentrino la loro deposizione delle uova su un singolo substrato o distribuiscano le uova in modo uniforme o meno tra substrati diversi. I modelli lineari generalizzati (GLM, famiglia: quasibinomiale; link: logit) sono stati utilizzati per confrontare i dati osservati dai saggi di comportamento con i dati casuali simulati. Il GLM utilizzato si è rivelato adatto per questa analisi a causa della natura limitata dell'indice di preferenza (PI), compreso tra 0 e 1. I GLM sono abili nella gestione di variabili di risposta non distribuite normalmente e consentono confronti statistici robusti. Questa scelta ha facilitato intuizioni significative, consentendo di confrontare efficacemente i dati osservati dai saggi comportamentali con modelli complessi generati da dati casuali simulati. Potrebbero essere necessarie piccole modifiche al codice per altri set di dati strutturati.
- Eseguire il codice fornito (File supplementare S1 e File supplementare S1) per generare i dati simulati e confrontarli con i dati osservati.
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Representative Results
Per dimostrare l'efficacia dei metodi presentati, gli esperimenti sono stati condotti utilizzando una popolazione di laboratorio di Lucilia cuprina (famiglia: Calliphoridae), un moscone parassita facoltativo2. L'intero set di dati grezzi ottenuto per questa specie può essere trovato nel file supplementare S3 con i risultati dei test di preferenza del substrato larvale e femminile. Per valutare se le larve e le femmine mostrano una preferenza per qualsiasi substrato, i dati osservati sono stati confrontati con 1000 set di dati simulati, ognuno dei quali rappresenta una scelta casuale (vedere il codice nel file supplementare S1). La percentuale di confronti statisticamente significativi (p < 0,05) è stata utilizzata come misura per valutare la preferenza. Da questa analisi, è risultato evidente che le larve mostravano una marcata preferenza per il substrato marcio a 25 °C (Figura 6A, Tabella 1) poiché tutti i 1000 confronti tra i dati osservati e ciascuno dei set di dati di scelta casuale simulati sono risultati significativamente diversi per le condizioni di carne e temperatura. Allo stesso modo, anche le femmine hanno mostrato una notevole preferenza per i 25 °C: il 69,7% dei confronti tra i dati osservati e la scelta casuale è risultato significativamente diverso (Figura 6B, Tabella 1). Tuttavia, la loro preferenza per la carne marcia era più sfumata (Figura 6B, Tabella 1) poiché solo il 27,1% dei confronti osservati rispetto alle scelte casuali erano significativi. Un'altra osservazione di questo studio è stata che le larve di L. cuprina di solito facevano una scelta rapida e si rintanavano nel substrato di carne entro i primi 2 minuti dell'esperimento. Raramente sono passati a un'altra condizione durante l'esperimento di 10 minuti.
Figura 1: Schema di taglio delle preferenze di alimentazione larvale per piastre di Petri con agar. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma dall'alto del layout del saggio di preferenza per l'alimentazione larvale. Le scelte sono state posizionate in modo casuale e i test sono stati eseguiti a RT (25 ± 2 °C). Il rettangolo nero rappresenta il termoforo, che mantiene le temperature a 33 ± 2 °C. I cerchi rossi e blu rappresentano rispettivamente la carne fresca integrata con sangue diluito (50%) e la carne marcia integrata con acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diagramma che illustra come posizionare la configurazione sperimentale larvale al di sotto della sorgente luminosa per evitare distorsioni verso o contro la luce. La sorgente luminosa utilizzata era una luce bianca a bassa emissione di riscaldamento (tubo al neon). Il termoforo è stato posizionato su un tavolo proprio sotto la plafoniera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diagramma dall'alto del layout del saggio di preferenza del sito di ovideposizione femminile. Le scelte sono state posizionate in modo casuale e i test sono stati eseguiti a RT (25 ± 2 °C). Il rettangolo nero rappresenta il termoforo che mantiene la temperatura a 33 ± 2 °C. I cerchi rossi rappresentano la carne fresca con sangue diluito (50%) e i cerchi blu, la carne marcia con acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Fotografia di una femmina gravida (a destra) rispetto a una femmina non gravida (a sinistra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Indici di preferenza medi (PI) per tipo di carne e temperatura per larve (A) e femmine (B) visualizzati su un piano cartesiano. I cerchi neri rappresentano i PI medi tenendo conto di tutte le repliche sperimentali (n = 36 per le larve e n = 30 per gli esperimenti femminili) ottenute per L. cuprina. Ciascuno dei cerchi grigi indica i PI medi per carne e temperatura di un set di dati simulato con caratteristiche simili al set di dati osservato (ad esempio, lo stesso numero di repliche) ma che rappresenta una scelta casuale. I riquadri colorati servono come aiuto visivo per visualizzare le aree PI di preferenza per ciascuna delle quattro scelte: il blu indica la carne marcia a 25 ± 2 °C, il verde come carne marcia a 33 ± 2 °C, il giallo come carne fresca a 25 ± 2 °C e l'arancione come carne fresca a 33 ± 2 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Palco | Paragone | Confronti significativi per PImeat | Confronti significativi per PItemp |
| Larve | Ipotesi simulata vs. ipotesi nulla (p < 0,05) | 3.8% | 2.1% |
| Osservato vs. simulato (p < 0,05) | 100.0% | 100.0% | |
| Femmine | Ipotesi simulata vs. ipotesi nulla (p < 0,05) | 3.3% | 4.6% |
| Osservato vs. simulato (p < 0,05) | 27.1% | 69.7% |
Tabella 1. Percentuale dicarne PI significativa etemperatura PI (valori p < 0,05) dei confronti tra (i) i dati casuali simulati (nessuna preferenza) e l'ipotesi statistica nulla, e (ii) i dati osservati e i dati casuali simulati. I risultati sono presentati separatamente per le larve e le femmine.
File supplementare S1: codice usato per l'analisi dei dati e le statistiche in markdown R. Fare clic qui per scaricare il file.
Fascicolo supplementare S2: Rapporto dell'analisi statistica. Fare clic qui per scaricare il file.
File supplementare S3: Conteggi grezzi di Lucilia cuprina per la preferenza larvale e femminile su ciascuna delle quattro scelte di substrato. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Comprendere l'evoluzione delle abitudini alimentari, in particolare nel contesto del parassitismo nei moscerini, richiede l'esame delle preferenze del substrato durante le diverse fasi della vita per l'alimentazione o l'ovideposizione. Pertanto, in questo studio, sono stati proposti metodi robusti e semplici per studiare le preferenze del substrato nelle larve e nelle femmine di mosconi. Questi metodi sono stati testati in Lucilia cuprina, un moscone parassita facoltativo2. È interessante notare che gli esperimenti hanno rivelato una distinta inclinazione per la carne marcia a 25 °C tra le larve di L. cuprina , in linea con le condizioni tipicamente utilizzate dalle specie necrofaghe. Ciò differiva da uno studio di Fouche et al40, che mostrava una preferenza per il substrato epatico fresco in Lucilia sericata e Calliphora vicina e mostrava che il substrato marcio aveva un impatto negativo sulla sopravvivenza e sulla crescita. Tuttavia, è difficile confrontare i risultati di entrambi gli studi poiché il grado di decomposizione della carne (sette giorni contro cinque nel nostro caso) e il processo di decomposizione (puramente anaerobico rispetto a aerobico e anaerobico nel nostro caso) erano diversi. Anche le specie utilizzate erano diverse. Inoltre, le osservazioni degli esperimenti qui presentati hanno indicato che le femmine preferivano deporre le uova a 25 °C, mentre mostravano solo una leggera preferenza per la carne marcia. Questi risultati mostrano che le larve e le femmine non sono le stesse e che le femmine mostrano una scelta più varia per la selezione del sito di ovideposizione rispetto alle larve per la ricerca di tane e cibo. Ciò suggerisce che l'abitudine parassitaria in L. cuprina sia guidata da cambiamenti nella scelta dell'ovideposizione femminile e non dalla preferenza per l'alimentazione larvale. In particolare, questi risultati servono come dimostrazione proof-of-concept dell'efficacia e dell'utilità dei metodi nel chiarire lo stile di vita dei moscerini in diverse fasi dello sviluppo.
Sono state utilizzate condizioni distinte di carne e temperatura per imitare i fattori dello stile di vita parassitario e necrofago. Questo approccio ha facilitato la valutazione dell'alimentazione larvale e delle preferenze del sito di ovideposizione femminile in un saggio a quattro scelte, utilizzando due fattori interagenti. I protocolli adottati rappresentano un approccio che si discosta dalla tradizionale tecnica a due scelte tipicamente utilizzata nei precedenti studi 43,44,45,46,47,48,49,50. Per ridurre al minimo le variazioni derivanti da fattori ambientali che potrebbero influenzare il comportamento, come segnali luminosi, visivi o odorosi, sono state implementate rigorose misure di controllo. Nei saggi è stata mantenuta un'illuminazione uniforme e coerente dall'alto per evitare pregiudizi verso o contro la luce, integrata dall'uso di uno sfondo nero per prevenire l'impatto di potenziali segnali visivi sulle preferenze larvali e femminili. Inoltre, il rischio di contaminazione incrociata tra substrati di carne marcia e fresca è stato evitato impiegando materiale plastico in vetro o monouso, guanti e utensili separati. L'applicazione di queste misure si è rivelata fondamentale per stabilire un quadro sperimentale controllato e affidabile, garantendo così la robustezza e l'affidabilità dei risultati ottenuti.
Il disegno dell'esperimento larvale era simile ai saggi a due scelte40,42 precedentemente descritti, con adattamenti apportati per incorporare il fattore di temperatura. Il protocollo larvale qui descritto si è rivelato rapido, robusto e lineare, dato che le larve hanno mostrato una forte tendenza a rimanere rintanate all'interno del substrato prescelto, eliminando così la possibilità di ambigui problemi di punteggio derivanti dal cambio di substrato alla fine dell'esperimento. Questa particolare caratteristica consente allo sperimentatore di condurre sei o più repliche contemporaneamente senza il rischio di risultati poco chiari o incerti. Sebbene la presenza di più larve all'interno della stessa replica possa influenzare le scelte individuali, il protocollo consente di valutare la preferenza generale del substrato attraverso repliche indipendenti. Negli scenari in cui è necessario evitare o controllare un possibile comportamento aggregativo, è possibile implementare test individuali o l'incorporazione di esperimenti di controllo per tenere conto delle potenziali influenze tra le larve per contrastare qualsiasi pregiudizio.
D'altra parte, il protocollo di preferenza del sito di ovideposizione femminile offre il notevole vantaggio di valutare la scelta individuale in modo indipendente, libero dall'influenza delle preferenze di altre femmine, evitando così comportamenti aggregativi. Infatti, è noto che la scelta dell'ovideposizione femminile calliforide può essere influenzata dalla presenza di mosche conspecifiche46,47. Tuttavia, è importante riconoscere il limite intrinseco del test sperimentale. Le uova non possono essere deposte entro la finestra sperimentale di 4 ore a causa di condizioni non idonee o, più probabilmente, dell'immaturità delle femmine. Questa incertezza si traduce in un sottogruppo delle repliche senza uova deposte (78% delle prove). Inoltre, l'ampia gamma nel numero di uova deposte in ciascuna replica (da 26 a 208, media ± deviazione standard = 132,4 ± 46,2) introduce una notevole variabilità, rendendo difficile distinguere tra le variazioni guidate dalle preferenze della femmina e quelle influenzate da fattori come le riserve limitate di uova o la deposizione tardiva delle uova durante l'esperimento. Nonostante queste limitazioni, i protocolli proposti sono adatti per valutare efficacemente la preferenza del sito di ovideposizione.
Nel complesso, i protocolli sviluppati hanno un potenziale significativo per un'ampia gamma di applicazioni nello studio del comportamento dei moscerini. In primo luogo, questi test possono essere impiegati per esaminare gli effetti di vari trattamenti, come le diverse condizioni di allevamento o di sviluppo, sulle preferenze larvali o femminili all'interno della stessa specie. Ciò potrebbe potenzialmente svelare i meccanismi sottostanti che guidano le preferenze comportamentali e le loro basi genetiche, in particolare se abbinati a tecniche di sequenziamento. Inoltre, questi test possono essere estesi per studiare le preferenze del substrato di diverse specie di moscerini, fornendo preziose informazioni sull'evoluzione del parassitismo all'interno di questo gruppo. Approfondendo le diverse preferenze esibite dai mosconi, è possibile ottenere una comprensione più profonda dei loro adattamenti ecologici, fornendo preziose conoscenze per la futura gestione e controllo delle specie nocive.
Infine, le potenzialità dei protocolli vanno oltre il solo studio dei moscerini. Con piccole modifiche, questi protocolli possono essere facilmente applicati per valutare le specie di mosche di altre famiglie, come le mosche domestiche e le mosche della carne, o anche insetti di dimensioni simili. L'adattabilità dei protocolli consente inoltre la selezione di diversi substrati per soddisfare gli obiettivi di specifiche indagini scientifiche. Ad esempio, i ricercatori possono modificare il grado di decomposizione della carne o sostituire la carne bovina con fonti animali alternative (ad esempio, pesce, maiale) o substrati non animali (ad esempio, frutta) per affrontare diverse questioni ecologiche. Questi adattamenti non solo migliorano la versatilità dei protocolli, ma consentono anche l'esplorazione delle preferenze in un'ampia gamma di specie di insetti e contesti ecologici, migliorando così la capacità di chiarire gli aspetti fondamentali del comportamento degli insetti e dell'adattamento ecologico.
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Disclosures
Nessuno dichiarato.
Acknowledgments
Ringraziamo Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim e Lucas de Almeida Carvalho per aver messo a disposizione la colonia di L. cuprina e per la loro assistenza nell'organizzazione dell'esperimento. Ringraziamo anche Rafael Barros de Oliveira per le riprese e il montaggio del video. Questa ricerca è stata sostenuta dal Developing Nation Research Grant della Animal Behavior Society al V.A.S.C. e da un grant FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo al T.T.T. (20/05636-4). S.T. e D.L.F. sono stati sostenuti da un FAPESP (rispettivamente borsa di studio post-dottorato 19/07285-7 e borsa di dottorato 21/10022-8). V.A.S.C. e A.V.R. sono state sostenute da borse di dottorato CNPq (rispettivamente 141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. è stata sostenuta da CNPq (310906/2022-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
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