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Behavior

Explorer les choix de cycle vital : Utilisation de la température et du type de substrat comme facteurs d’interaction pour les préférences des larves et des femelles de la mouche à viande

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65835
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Genetics and Evolutionary Biology, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 2Department of Zoology, Institute of Biosciences, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Dans le présent document, deux protocoles d’évaluation de la source de nourriture et des préférences de ponte chez les larves et les femelles de mouches à viande sont détaillés. Ceux-ci comprennent quatre choix avec deux facteurs en interaction : le type de substrat et la température. Les tests permettent de déterminer la préférence de la source de nourriture des larves et la préférence du site de ponte pour les femelles.

Abstract

Les mouches à viande (Diptera : Calliphoridae) présentent un large éventail de modes de vie larvaires, généralement classés comme parasitisme obligatoire, parasitisme facultatif et sapro-nécrophage complet. Plusieurs espèces parasites, à la fois obligatoires et facultatives, sont considérées comme ayant une importance sanitaire et économique, car leurs larves peuvent provoquer une myiase (infestation d’asticots dans les tissus vivants). Cependant, il convient de noter que la femelle adulte joue un rôle décisif dans le choix du site de ponte et, par conséquent, détermine en grande partie les habitudes alimentaires et les conditions de développement des larves. Dans cette étude, deux protocoles sont proposés pour tester la préférence alimentaire des larves et la préférence des femelles pour le site de ponte en tenant compte de deux facteurs en interaction : le type de substrat de viande et la température. Les montages présentés ici ont permis de tester des larves et des femelles gravides de Lucilia cuprina dans un test à quatre choix avec deux températures (33 ± 2 °C et 25 ± 2 °C) et deux types de substrats de viande (viande fraîche supplémentée en sang et viande avariée de 5 jours). Les larves ou les femelles gravides peuvent choisir de creuser ou de pondre leurs œufs, respectivement, dans l’un ou l’autre des endroits suivants : viande pourrie à 25 °C (simulant l’état d’une espèce nécrophage), viande fraîche supplémentée en sang à 33 °C (simulant une condition d’espèce parasite) et deux témoins, viande avariée à 33 °C ou viande fraîche supplémentée en sang à 25 °C. La préférence est évaluée en comptant le nombre de larves ou d’œufs pondus dans chaque option pour chaque répétition. La comparaison des résultats observés à une distribution aléatoire a permis d’estimer la signification statistique de la préférence. Les résultats ont indiqué que les larves de L. cuprina ont une forte préférence pour le substrat pourri à 25 °C. À l’inverse, la préférence des femelles pour le site de ponte était plus variée selon le type de viande. Cette méthodologie peut être adaptée pour tester la préférence d’autres espèces d’insectes de taille similaire. D’autres questions peuvent également être explorées en utilisant des conditions alternatives.

Introduction

Les mouches, en particulier les muscoïdes calyptrates (y compris les mouches à viande, les mouches domestiques, les mouches bots et les mouches à chair, entre autres), présentent un large éventail de modes de vie, englobant des comportements parasites et nécro-saprofages1. Les espèces parasites causent généralement la myiase, c’est-à-dire l’infestation des tissus vivants par les asticots (larves)2. Dans la famille des Calliphoridae, les espèces parasites obligatoires et facultatives sont des ravageurs majeurs du bétail responsables de pertes économiques et d’un mauvais bien-être animal en raison des infestations d’asticots 2,3,4,5,6,7. Les parasites obligatoires, tels que les vers à vis du Nouveau Monde et de l’Ancien Monde (Cochliomyia hominivorax et Chrysomyia bezziana, respectivement), sont particulièrement problématiques 4,7,8,9,10 ainsi que les parasites facultatifs, tels que les mouches à viande des moutons (Lucilia cuprina et Lucilia sericata)2,5,6, 7. Le Les espèces non parasites, y compris les espèces sapro-nécrophages, se développent dans la matière organique en décomposition et nécrosée et se trouvent couramment dans des environnements insalubres. Leur mode de vie strictement non parasitaire peut être utilisé avec succès pour la thérapie par les asticots, qui utilise des larves de mouches pour nettoyer les plaies des tissus nécrotiques11,12,13. Les mouches à viande sont également utilisées en médecine légale, car elles sont parmi les premiers organismes à localiser et à coloniser les corps récemment décédés, les larves en développement servant de moyen d’estimer le moment de la mort14.

Le mode de vie des mouches à viande a fait l’objet de diverses études de recherche (par exemple, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21) en raison de son importance par rapport aux intérêts humains. Comprendre les mécanismes biologiques qui régissent le mode de vie d’une espèce peut fournir des informations précieuses sur l’amélioration des méthodes de lutte contre les espèces nuisibles. De plus, la diversité et l’évolution des modes de vie des mouches à viande offrent un contexte idéal pour étudier les origines et les mécanismes de traits complexes (par exemple, le parasitisme). Le parasitisme dû aux asticots se nourrissant de tissus vivants a évolué indépendamment à plusieurs reprises au sein de la famille des Calliphoridae22,23. Cependant, l’histoire évolutive des habitudes alimentaires des mouches à viande est encore largement inconnue, les études se limitant à cartographier les habitudes le long des phylogénies (par exemple, 16, 19, 22) sans l’aide de tests fonctionnels. Par exemple, il n’est pas certain que les parasites obligatoires aient évolué à partir de généralistes (c’est-à-dire de parasites facultatifs) ou directement à partir d’espèces nécrophages. Les processus moléculaires, physiologiques et comportementaux qui accompagnent les changements évolutifs dans le mode de vie sont également largement inconnus.

Dans ce contexte, les parasites facultatifs, tels que la mouche à viande du mouton Lucilia cuprina, qui peuvent se développer sous forme de parasites sur un hôte ou de nécrophages sur des cadavres offrent la possibilité d’explorer les facteurs et les mécanismes qui contrôlent les choix de mode de vie. Lucilia cuprina est une espèce cosmopolite connue pour causer la mouche des moutons, en particulier en Australie où elle est considérée comme un ravageur 3,16. La myiase due à L. cuprina peut également survenir chez d’autres animaux d’élevage, des animaux domestiques et des humains 3,24,25,26,27,28,29,30. Cependant, ses larves peuvent également se développer dans les tissus nécrotiques et les matières en décomposition et cette espèce a été utilisée avec succès en entomologie médico-légale car elle est très rapide pour localiser et coloniser les cadavres31,32,33,34. Bien que le mode de vie parasitaire par rapport au mode de vie non parasitaire des mouches à viande soit défini par le stade larvaire, c’est la femelle adulte qui choisit le site de ponte. Par conséquent, la femelle adulte influence fortement le mode de vie des larves, car celles-ci ont une mobilité limitée. Cependant, le choix de la femelle n’implique pas nécessairement que les larves préféreraient le même substrat lorsqu’elles se présenteraient à un choix35. Une hypothèse est que les changements de comportement conduisant les femelles à pondre leurs œufs sur des tissus vivants pourraient avoir fait partie d’un changement précoce vers un mode de vie parasitaire. Les pré-adaptations ou capacités physiologiques des larves résultantes auraient été essentielles pour leur développement réussi sur les tissus vivants, conduisant à l’émergence du mode de vie parasitaire. Par conséquent, les processus touchés et sélectionnés ne correspondent pas nécessairement aux deux stades de la vie.

Dans ce contexte, deux méthodes ont été développées pour tester la préférence comportementale chez les mouches à viande, en particulier pour L. cuprina, en ce qui concerne le substrat d’alimentation larvaire (test de préférence larvaire) et le site de ponte (test de préférence femelle). Ces méthodes prennent en compte deux facteurs qui interagissent : la température et la fraîcheur de la viande. La température a été choisie comme facteur crucial puisque la plupart des cas de myiase surviennent chez les animaux homéothermes2. Par conséquent, une température de 33 °C a été choisie comme approximation du « facteur de mode de vie parasitaire », tandis qu’une température de 25 °C (température ambiante) représente le « facteur non parasitaire ». Une température de 25 °C a été choisie car elle est représentative de la température annuelle moyenne enregistrée au Brésil (Institut national de météorologie, INMET). De plus, deux types de substrats de viande ont été considérés, tous deux d’origine bovine : (i) de la viande fraîche supplémentée en sang, imitant le substrat pour le mode de vie parasitaire, qui est utilisé pour élever la mouche parasite Co. hominivorax dans des conditions de laboratoire36, et (ii) de la viande pourrie âgée de 5 jours, imitant le substrat pour le mode de vie nécrophage. Le substrat bovin est couramment utilisé pour l’élevage de L. cuprina dans des conditions de laboratoire27,37,38,39 car il offre plusieurs avantages en termes de disponibilité, de rentabilité et de praticité tout en étant un substrat écologiquement justifiable. D’autres étudescomparant l’effet des substrats pourris par rapport aux substrats frais chez les mouches à viande ont utilisé un substrat pourri de 7 jours (dans des conditions anaérobies) et ont montré un effet négatif du substrat pourri sur les taux de développement, la survie et la croissance. Comme L. cuprina est connu pour coloniser des cadavres frais qui sont généralement exposés à l’air, nous avons décidé d’utiliser de la viande pourrie de 5 jours (bœuf haché) dans des pots non hermétiques (décomposition aérobie et anaérobie) pour imiter un substrat nécrophage.

Les plans d’expérience présentés ici offrent l’avantage de discerner les préférences pour les facteurs individuels ainsi que leurs effets combinés. De plus, les phénotypes notés, à savoir le choix du substrat d’alimentation des larves et le nombre d’œufs pondus, sont directement pertinents pour les aspects biologiques et écologiques des espèces de mouches à viande. La pertinence de ces protocoles est mise en évidence par la démonstration de leur efficacité chez L. cuprina. De plus, un script d’analyse statistique est fourni, qui peut être utilisé pour comparer les résultats observés obtenus chez L. cuprina à des données aléatoires simulées, assurant ainsi une analyse et des interprétations statistiques robustes.

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Protocol

Les échantillons de mouches ont été prélevés à l’aide de pièges et non sur des animaux infestés. Une licence SISBIO (67867-1) a été délivrée pour la collecte et la détention de mouches de la famille des Calliphoridae en captivité dans des conditions de laboratoire. Les échantillons d’insectes sont exemptés de l’évaluation éthique dans la recherche au Brésil. De la viande et du sang bovins étaient obtenus dans le commerce, et aucune autorisation éthique n’était requise.

1. Préférence alimentaire des larves

  1. Préparation des boîtes de Pétri contenant 2% d’agar
    1. Préparez quatre boîtes de Pétri avec de l’agar-agar à 2 %. Pour ce faire, ajoutez 6 g de gélose bactériologique à 300 mL d’eau et faites fondre ce mélange au micro-ondes. Ensuite, répartissez le volume uniformément dans quatre boîtes de Pétri en verre (150 x 20 mm), en utilisant environ 70 ml dans chaque boîte.
      REMARQUE : Préparez des boîtes de Pétri égales au nombre de répétitions expérimentales souhaitées. Dans cette étude, 36 répétitions ont été utilisées.
    2. Une fois la gélose solidifiée, à l’aide d’un tube conique de 50 ml (3 cm de diamètre), percer quatre trous dans la gélose, deux de chaque côté de la boîte de Pétri, en suivant le schéma de coupe fourni (figure 1).
      REMARQUE : Cette configuration est similaire aux protocoles précédemment décrits par Fouché et al. (2021)40 et Boulay et al. (2016)42.
  2. Préparation des substrats
    1. Pour préparer la viande fraîche avec du sang, ajoutez 12 mL de sang bovin dilué à 200 g de viande hachée bovine fraîche. Mélanger. Assurez-vous d’utiliser des cylindres gradués et des cuillères différents pour chaque type de viande afin d’éviter la contamination croisée entre les substrats.
      REMARQUE : Le sang dilué est composé de 50% de sang pur mélangé à un anticoagulant (3,8% de citrate de sodium) et à 50% d’eau filtrée.
    2. Pour préparer le substrat pourri, ajoutez 12 mL d’eau filtrée à 200 g de viande hachée bovine pourrie de 5 jours et mélangez bien.
      NOTE : La viande avariée a été obtenue en incubant de la viande hachée fraîche pendant cinq jours à 25 °C dans des pots en plastique non hermétiques (mélange de décomposition aérobie et non aérobie). Chaque pot contenait 200 g de viande hachée fraîche. Il a ensuite été congelé jusqu’à son utilisation.
    3. Remplissez deux trous dans chaque boîte de Pétri avec le mélange de viande fraîche et de sang et les deux trous restants avec le mélange de viande et d’eau avariées.
      REMARQUE : Pour éviter les biais de position, variez l’emplacement des différents types de viande dans les boîtes de Pétri. Par exemple, certaines boîtes de Pétri doivent avoir le même type de viande face à face, tandis que dans d’autres plats, le type de viande doit être croisé, comme le montre la figure 2.
  3. Dispositif expérimental
    1. À une température ambiante (RT) de 25 °C, placez le coussin chauffant directement sous une source lumineuse afin d’éclairer uniformément la zone expérimentale et d’éviter tout biais de comportement vers ou contre la lumière. Placez des tampons en carton autour du coussin chauffant pour vous assurer que l’installation expérimentale reste de niveau.
      REMARQUE : La source de lumière utilisée était une lumière blanche émettant peu de chaleur, comme un tube néon. Le coussin chauffant était placé sur une table juste en dessous des ampoules du plafonnier (figure 3).
    2. Couvrez le coussin chauffant et les tampons de carton de nivellement avec du carton noir et allumez le coussin chauffant.
      REMARQUE : La couverture en carton noir doit être utilisée pour éviter les indices visuels qui pourraient biaiser le test de comportement.
    3. Placez six boîtes de Pétri avec de l’agar-agar et du substrat de viande sur le carton noir avec deux substrats, un de chaque type, sur le coussin chauffant et les deux autres sur la surface du coussin chauffant (Figure 2). Laissez chauffer les substrats pendant environ 10 min.
      REMARQUE : De la condensation peut se former sur le couvercle des boîtes de Pétri.
  4. Test larvaire
    1. Vérifiez la température des substrats (côté froid : 25 ± 2 °C ; côté chaud : 33 ± 2 °C) à l’aide d’un thermomètre infrarouge.
      REMARQUE : Le coussin chauffant reste allumé pendant toute la durée de l’expérience. Des mesures de température ont été effectuées au début et à la fin de l’expérience. Bien que la température ait fluctué de ± 2 °C, il y avait encore une différence de température d’au moins 8 °C entre les conditions chaudes et froides.
    2. Après avoir atteint la température désirée, placez cinq larves du troisième stade au centre de chaque boîte de Pétri à l’aide d’une pince à épiler (figure 2) et couvrez les boîtes de Pétri avec les couvercles. Laissez l’expérience de choix se dérouler pendant 10 minutes.
      REMARQUE : Certaines larves peuvent ramper sur les bords et sur le couvercle des boîtes de Pétri. Si une larve s’échappe, utilisez une pince à épiler pour la remettre au centre de la boîte de Pétri.
    3. Après 10 min, retirez toutes les boîtes de Pétri du coussin chauffant et placez-les sur une autre surface pour éviter de continuer à chauffer les substrats. Ensuite, comptez le nombre de larves dans chaque substrat, ainsi que celles qui n’ont choisi aucun substrat.
      REMARQUE : Les larves de Lucilia cuprina restent dans le substrat qu’elles ont choisi, comme on l’a observé dans cette expérience.

2. Préférence de la femelle pour le site de ponte

  1. Dispositif expérimental
    1. Utilisez une étagère ordinaire préalablement recouverte de carton noir et uniformément éclairée par des bandes lumineuses LED blanches.
      REMARQUE : Les couvertures en carton noir doivent être utilisées pour éviter les indices visuels qui pourraient biaiser le test de comportement. Les bandes LED blanches sont fixées dans le sens de la longueur au milieu de l’étagère, juste au-dessus de l’expérience. Les étagères utilisées dans l’installation ont été placées à 45 cm l’une de l’autre.
    2. À RT (25 °C), placez un coussin chauffant au centre de l’étagère. Utilisez des tampons en carton autour du coussin chauffant comme support pour vous assurer que l’installation expérimentale est de niveau.
    3. Couvrez le coussin chauffant et les tampons de carton de nivellement avec un carton noir pour garder le même motif visuel sous tous les supports.
    4. Placez deux récipients en verre en forme de croix sur une étagère, chacun devant avoir deux bras au-dessus du carton noir et du coussin chauffant. Allumez les bandes lumineuses LED blanches et les coussins chauffants avant le début de l’expérience.
    5. Utilisez de l’éthanol à 70 % pour nettoyer les croix (à l’intérieur de la croix et du couvercle) afin d’éviter la contamination par les odeurs.
  2. Préparation des substrats
    1. Préparez quatre boîtes de Pétri (60 mm x 15 mm) par croix avec 5 g de viande pourrie ou fraîche de 5 jours (deux de chaque type de substrat).
      REMARQUE : Préparez des boîtes de Pétri égales au nombre de répétitions expérimentales désirées multiplié par quatre. Dans cette étude, 30 répétitions ont été utilisées, totalisant 120 boîtes de Pétri préparées.
    2. Ajouter 1 mL de sang bovin dilué (50 % de sang pur avec anticoagulant et 50 % d’eau filtrée) sur la viande fraîche et 1 mL d’eau filtrée sur la viande avariée. Mélangez soigneusement la viande (fraîche ou pourrie) avec le liquide (sang ou eau) à l’aide d’une cuillère différente pour chaque type de viande.
      REMARQUE : La préparation de la viande pour l’essai sur les femelles est très similaire à celle des larves, bien que les quantités soient différentes parce que l’essai sur les femelles durera plus longtemps que sur les larves. N’oubliez pas d’utiliser des pointes de pipette et des cuillères différentes pour chaque type de viande afin d’éviter toute contamination croisée des odeurs entre les substrats.
    3. Vérifiez si l’alcool s’est complètement évaporé des croix. Ensuite, placez quatre boîtes de Pétri (une de chaque type de viande sur le coussin chauffant et les deux autres sur la surface du coussin chauffant) à l’extrémité de chaque bras de la croix (Figure 4). Fermez les croix avec leurs couvercles et laissez les substrats chauffer pendant environ 10 min.
      REMARQUE : De plus, pour éviter les biais de position, variez l’emplacement des différents types de viande dans les croisements. Par exemple, certains croisements devraient avoir le même type de viande sur les bras adjacents, tandis que dans d’autres croisements, le même type de viande devrait être en face l’un de l’autre, comme le montre la figure 4.
  3. Test de la femme
    1. Recueillir les femelles gravides dans la cage à mouches et les isoler dans des tubes individuels.
      NOTA : Les femelles gravides se caractérisent par un abdomen élargi et jaune blanchâtre, contrairement aux femelles non gravides (figure 5). Les femelles gravides ont été recueillies entre 10 et 16 jours après l’émergence pour les expériences.
    2. Vérifier la température des substrats dans les croix (côté froid : 25 ± 2 °C ; côté chaud : 33 ± 2 °C) à l’aide d’un thermomètre infrarouge.
      REMARQUE : Tout comme dans le test larvaire, le coussin chauffant reste allumé pendant toute la durée de l’expérience. Des mesures de température ont été effectuées au début et à la fin de l’expérience. Bien que la température ait fluctué de ± 2 °C, il y avait encore une différence de température d’au moins 8 °C entre les conditions chaudes et froides.
    3. Placez le tube à l’envers contenant une femelle gravide dans l’ouverture au centre de chaque croix. Une fois que la femelle est entrée dans la croix, retirez le tube et fermez l’ouverture avec son petit couvercle. Après avoir fermé toutes les croix, placez un carton noir à l’avant de l’étagère pour enfermer le dispositif expérimental. Laissez l’expérience se dérouler pendant 4 h.
    4. Après cela, retirez la femelle, en l’attrapant soigneusement avec un tube, et vérifiez s’il y avait des œufs sur les substrats.
    5. Identifiez le couvercle de chaque boîte de Pétri avec le type de substrat de chaque croix. Utilisez de l’éthanol à 70 % pour nettoyer les croix (à l’intérieur de la croix et du couvercle) de toute odeur provenant du test.
      REMARQUE : Dans le cas où les œufs ne peuvent pas être comptés juste après l’expérience, les boîtes de Pétri avec substrats peuvent être stockées à -20 °C.
  4. Nombre d’oeufs
    REMARQUE : Si les substrats dans les boîtes de Pétri ont été gelés, décongelez-les avant de les compter.
    1. À l’aide d’un stéréomicroscope, comptez le nombre d’œufs pondus dans chaque substrat. Utilisez un pinceau et de l’eau pour aider à séparer les œufs afin de les compter.

3. Analyse des données et statistiques

  1. Calcul des indices de préférence
    1. Pour chaque répétition d’essais sur les larves (n = 36) et les femelles (n = 30), calculer l’indice de préférence pour la viande (désignée commeviande IP) en déterminant le rapport entre le nombre de larves ou d’œufs présents sur les substrats frais (frais chaud et frais froid) et le nombre total de larves ou d’œufs sur tous les substrats (frais chaud + froid frais + chaud pourri + froid pourri).
      PIviande = (# larves ou oeufs sur substrats frais) / # Nombre total de larves ou d’oeufs
      REMARQUE : Les termes « chaud » et « froid » indiquent des conditions de température de 33 ± 2 °C et de 25 ± 2 °C, respectivement.
    2. De même, calculer l’indice de préférence pour la température (température PI) pour chaque répétition d’essais sur les larves et les femelles en divisant le nombre de larves ou d’œufs présents sur les substrats chauds (chaud frais et chaud pourri) divisé par le nombre total de larves ou d’œufs sur tous les substrats (chaud frais + froid frais + chaud pourri + froid pourri).
      PItemp = (# larves ou oeufs sur substrats chauds) / # Nombre total de larves ou d’oeufs
      REMARQUE : Les valeurs proches de 1 reflètent une préférence pour les substrats frais ou chauds et les valeurs proches de zéro indiquent une préférence pour les substrats pourris ou froids. Les RP peuvent être calculés manuellement ou à l’aide du code fourni (fichiers supplémentaires S1 et fichiers supplémentaires S2).
  2. Comparaison de la préférence observée avec des données aléatoires simulées
    1. Exécutez le code fourni (Fichier supplémentaire S1 et Fichier supplémentaire S1) pour générer les données simulées et les comparer avec les données observées.
      REMARQUE : Ce code génère 1000 ensembles de données aléatoires simulées pour les larves et les femelles et calcule les indices de préférence (IP) pour chaque répétition des données simulées et les données observées de L. cuprina. Les simulations supposent que les larves et les femelles n’ont aucune préférence pour le substrat et font des choix aléatoires. Les simulations intègrent des aspects comportementaux clés des animaux, englobant divers scénarios tels que : la probabilité que les larves ne choisissent aucun substrat et que les femelles adultes concentrent leur ponte sur un seul substrat ou répartissent leurs œufs uniformément ou non entre différents substrats. Des modèles linéaires généralisés (GLM, famille : quasibinomial ; lien : logit) ont été utilisés pour comparer les données observées à partir des tests de comportement avec les données aléatoires simulées. Le GLM utilisé était bien adapté à cette analyse en raison de la nature limitée de l’indice de préférence (IP), compris entre 0 et 1. Les GLM sont aptes à traiter des variables de réponse non normalement distribuées et permettent des comparaisons statistiques robustes. Ce choix a permis d’obtenir des informations significatives en permettant de comparer efficacement les données observées à partir d’essais de comportement avec des modèles complexes générés par des données aléatoires simulées. Des ajustements mineurs du code peuvent être nécessaires pour d’autres jeux de données structurés.

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Representative Results

Pour démontrer l’efficacité des méthodes présentées, les expériences ont été menées sur une population de laboratoire de Lucilia cuprina (famille : Calliphoridae), une mouche parasite facultative2. L’ensemble des données brutes obtenues pour cette espèce se trouve dans le fichier supplémentaire S3 avec les résultats des tests de préférence de substrat des larves et des femelles. Afin d’évaluer si les larves et les femelles manifestent une préférence pour un substrat quelconque, les données observées ont été comparées à 1000 ensembles de données simulés, chacun représentant un choix aléatoire (voir le code dans le fichier supplémentaire S1). Le pourcentage de comparaisons statistiquement significatives (p < 0,05) a été utilisé comme mesure pour évaluer la préférence. D’après cette analyse, il était évident que les larves présentaient une préférence marquée pour le substrat pourri à 25 °C (figure 6A, tableau 1), car les 1000 comparaisons entre les données observées et chacun des ensembles de données de choix aléatoire simulés se sont avérées significativement différentes pour les conditions de viande et de température. De même, les femelles ont également montré une préférence marquée pour 25 °C : 69,7 % des comparaisons entre les données observées et le choix aléatoire se sont avérées significativement différentes (Figure 6B, Tableau 1). Cependant, leur préférence pour la viande avariée était plus nuancée (figure 6B, tableau 1) puisque seulement 27,1 % des comparaisons observées par rapport aux comparaisons de choix aléatoires étaient significatives. Une autre observation de cette étude était que les larves de L. cuprina faisaient généralement un choix rapide et s’enfouissaient dans le substrat de viande dans les 2 premières minutes de l’expérience. Ils sont rarement passés à une autre condition au cours de l’expérience de 10 minutes.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de coupe des préférences alimentaires des larves pour les boîtes de Pétri avec gélose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Diagramme de dessus de la disposition du test de préférence alimentaire des larves. Les choix ont été positionnés de manière aléatoire et les tests ont été effectués à RT (25 ± 2 °C). Le rectangle noir représente le coussin chauffant, qui maintient les températures à 33 ± 2 °C. Les cercles rouge et bleu représentent respectivement la viande fraîche supplémentée en sang dilué (50 %) et la viande avariée complétée avec de l’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma illustrant comment positionner le dispositif expérimental larvaire sous la source lumineuse afin d’éviter les biais vers ou contre la lumière. La source lumineuse utilisée était une lumière blanche émettant peu de chaleur (tube néon). Le coussin chauffant était positionné sur une table juste en dessous du plafonnier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Diagramme de dessus de la disposition de l’essai de préférence du site de ponte des femelles. Les choix ont été positionnés de manière aléatoire et les tests ont été effectués à RT (25 ± 2 °C). Le rectangle noir représente le coussin chauffant qui maintient la température à 33 ± 2 °C. Les cercles rouges représentent la viande fraîche avec du sang dilué (50%) et les cercles bleus, la viande avariée avec de l’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Photographie d’une femelle gravide (à droite) par rapport à une femelle non gravide (à gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Indices de préférence moyens (IP) pour le type de viande et la température des larves (A) et des femelles (B) affichés sur un plan cartésien. Les cercles noirs représentent les IP moyens en tenant compte de toutes les répétitions expérimentales (n = 36 pour les larves et n = 30 pour les femelles) obtenues pour L. cuprina. Chacun des cercles gris indique les IP moyens pour la viande et la température d’un ensemble de données simulé présentant des caractéristiques similaires à celles de l’ensemble de données observé (par exemple, le même nombre de répétitions), mais représentant un choix aléatoire. Les volets colorés servent d’aide visuelle pour représenter les zones de préférence de l’IP pour chacun des quatre choix, le bleu indiquant la viande avariée à 25 ± 2 °C, le vert à la viande avariée à 33 ± 2 °C, le jaune à la viande fraîche à 25 ± 2 °C et l’orange à la viande fraîche à 33 ± 2 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Étape Comparaison Comparaisons significatives pour PImeat Comparaisons significatives pour PItemp
Larve Hypothèse simulée ou nulle (p < 0,05) 3.8% 2.1%
Observé vs. simulé (p < 0,05) 100.0% 100.0%
Femelles Hypothèse simulée ou nulle (p < 0,05) 3.3% 4.6%
Observé vs. simulé (p < 0,05) 27.1% 69.7%

Tableau 1. Pourcentage de laviande IP significative et dela température de l’IP (valeurs p < 0,05) des comparaisons entre (i) les données aléatoires simulées (pas de préférence) et l’hypothèse statistique nulle, et (ii) les données observées et les données aléatoires simulées. Les résultats sont présentés séparément pour les larves et les femelles.

Fichier supplémentaire S1 : Code utilisé pour l’analyse des données et les statistiques dans R Markdown. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire S2 : Rapport de l’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire S3 : Dénombrements bruts de Lucilia cuprina pour les préférences des larves et des femelles sur chacun des quatre choix de substrat. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Pour comprendre l’évolution des habitudes alimentaires, en particulier dans le contexte du parasitisme chez les mouches à viande, il faut examiner les préférences en matière de substrat à différents stades de vie pour l’alimentation ou la ponte. Par conséquent, dans cette étude, des méthodes robustes et simples ont été proposées pour étudier les préférences de substrat chez les larves et les femelles de mouches à viande. Ces méthodes ont été testées chez Lucilia cuprina, une mouche parasite facultative2. Il est intéressant de noter que les expériences ont révélé une nette inclinaison pour la viande pourrie à 25 °C chez les larves de L. cuprina , s’alignant sur les conditions généralement utilisées par les espèces nécrophages. Cela différait d’une étude de Fouché et al40, qui montrait une préférence pour le substrat hépatique frais chez Lucilia sericata et Calliphora vicina et montrait que le substrat pourri avait un impact négatif sur la survie et la croissance. Cependant, il est difficile de comparer les résultats des deux études, car le degré de décomposition de la viande (sept jours contre cinq dans notre cas) et le processus de décomposition (purement anaérobie par rapport à aérobie et anaérobie dans notre cas) étaient différents. Les espèces utilisées étaient également différentes. De plus, les observations des expériences présentées ici ont indiqué que les femelles préféraient pondre leurs œufs à 25 °C, tout en ne montrant qu’une légère préférence pour la viande avariée. Ces résultats montrent que les choix des larves et des femelles ne sont pas les mêmes et que les femelles présentent un choix plus varié pour leur choix de site de ponte que les larves pour les fouisseurs et les choix alimentaires. Cela suggère que l’habitude parasitaire de L. cuprina est due à des changements dans le choix de ponte des femelles et non à la préférence alimentaire des larves. Notamment, ces résultats servent de preuve de concept de l’efficacité et de l’utilité des méthodes pour élucider le mode de vie des mouches à viande à différents stades de développement.

Des conditions distinctes de viande et de température ont été utilisées pour imiter les facteurs de mode de vie parasites et nécrophages. Cette approche a facilité l’évaluation de l’alimentation des larves et des préférences des femelles en matière de site de ponte dans le cadre d’un essai à quatre choix, en utilisant deux facteurs en interaction. Les protocoles adoptés représentent une approche qui s’écarte de la technique traditionnelle à deux choix généralement utilisée dans les études précédentes 43,44,45,46,47,48,49,50. Pour minimiser les variations résultant de facteurs environnementaux susceptibles d’influencer le comportement, tels que les signaux lumineux, visuels ou olfactifs, des mesures de contrôle rigoureuses ont été mises en œuvre. Un éclairage uniforme et constant par le haut a été maintenu dans les essais afin d’éviter tout biais vers ou contre la lumière, complété par l’utilisation d’un fond noir pour éviter l’impact des indices visuels potentiels sur les préférences des larves et des femelles. De plus, le risque de contamination croisée entre les substrats de viande pourrie et de viande fraîche a été évité en utilisant du verre ou des matières plastiques jetables, des gants et des ustensiles séparés. L’application de ces mesures s’est avérée cruciale pour établir un cadre expérimental contrôlé et fiable, assurant ainsi la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus.

Le plan de l’expérience larvaire était similaire à celui des essais à deux choix décrits précédemment40,42, avec des adaptations apportées pour incorporer le facteur de température. Le protocole larvaire décrit ici s’est avéré rapide, robuste et simple, étant donné que les larves ont montré une forte tendance à rester enfouies dans le substrat qu’elles ont choisi, éliminant ainsi la possibilité de problèmes de notation ambigus découlant du changement de substrat à la fin de l’expérience. Cette caractéristique particulière permet à l’expérimentateur d’effectuer six répétitions ou plus simultanément sans risque de résultats peu clairs ou incertains. Bien que la présence de plusieurs larves au sein d’une même répétition puisse influencer les choix individuels, le protocole permet d’évaluer la préférence générale du substrat au moyen de répétitions indépendantes. Dans les scénarios où un comportement d’agrégation possible doit être évité ou contrôlé, des tests individuels ou l’incorporation d’expériences de contrôle pour tenir compte des influences potentielles entre les larves peuvent être mis en œuvre pour contrer tout biais.

D’autre part, le protocole de préférence du site de ponte des femelles offre l’avantage notable d’évaluer le choix individuel de manière indépendante, sans l’influence des préférences des autres femelles, évitant ainsi les comportements d’agrégation. En effet, on sait que le choix de ponte des femelles calliphoridées peut être influencé par la présence de mouches conspécifiques46,47. Néanmoins, il est important de reconnaître les limites inhérentes à l’essai expérimental. Les œufs peuvent ne pas être pondus dans la fenêtre expérimentale de 4 heures en raison de conditions inappropriées ou, plus probablement, de l’immaturité des femelles. Cette incertitude fait en sorte qu’un sous-ensemble de répétitions n’a pas pondu d’œufs (78 % des essais). De plus, la grande variété du nombre d’œufs pondus dans chaque répétition (26 à 208, écart-type moyen ± = 132,4 ± 46,2) introduit une variabilité considérable, ce qui rend difficile la distinction entre les variations déterminées par la préférence de la femelle et celles influencées par des facteurs tels que des réserves d’œufs limitées ou une ponte tardive au cours de l’expérience. Malgré ces limites, les protocoles proposés permettent d’évaluer efficacement la préférence pour les sites de ponte.

Dans l’ensemble, les protocoles développés présentent un potentiel important pour un large éventail d’applications dans l’étude du comportement des mouches. Tout d’abord, ces tests peuvent être utilisés pour examiner les effets de divers traitements, tels que des conditions d’élevage ou de développement différentes, sur les préférences des larves ou des femelles au sein d’une même espèce. Cela pourrait potentiellement dévoiler les mécanismes sous-jacents à l’origine des préférences comportementales et leur base génétique, en particulier lorsqu’ils sont couplés à des techniques de séquençage. De plus, ces tests peuvent être étendus pour étudier les préférences de substrat de différentes espèces de mouches, fournissant des informations précieuses sur l’évolution du parasitisme au sein de ce groupe. En se penchant sur les diverses préférences manifestées par les mouches à viande, il est possible de mieux comprendre leurs adaptations écologiques, ce qui fournit des connaissances précieuses pour la gestion et le contrôle futurs des espèces nuisibles.

Enfin, le potentiel des protocoles s’étend au-delà de la seule étude des mouches. Avec des modifications mineures, ces protocoles peuvent être facilement appliqués pour évaluer les espèces de mouches d’autres familles, telles que les mouches domestiques et les mouches à chair, ou même des insectes de taille similaire. L’adaptabilité des protocoles permet également de sélectionner différents substrats pour répondre aux objectifs de recherches scientifiques spécifiques. Par exemple, les chercheurs peuvent modifier le degré de décomposition de la viande ou remplacer la viande bovine par d’autres sources animales (p. ex., poisson, porc) ou des substrats non animaux (p. ex., fruits) pour répondre à diverses questions écologiques. Ces adaptations améliorent non seulement la polyvalence des protocoles, mais permettent également d’explorer les préférences dans un large éventail d’espèces d’insectes et de contextes écologiques, améliorant ainsi la capacité d’élucider les aspects fondamentaux du comportement des insectes et de l’adaptation écologique.

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Disclosures

Aucune n’a été déclarée.

Acknowledgments

Nous remercions Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim et Lucas de Almeida Carvalho pour avoir fourni la colonie de L. cuprina et pour leur aide dans la mise en place de l’expérience. Nous tenons également à remercier Rafael Barros de Oliveira pour le tournage et le montage de la vidéo. Cette recherche a été financée par la subvention de recherche sur les pays en développement de l’Animal Behavior Society à V.A.S.C. et par une subvention FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo à T.T.T. (20/05636-4). S.T. et D.L.F. ont bénéficié d’un soutien de la FAPESP (bourse postdoctorale 19/07285-7 et bourse doctorale 21/10022-8, respectivement). V.A.S.C. et A.V.R. ont été soutenus par des bourses de doctorat du CNPq (141391/2019-7, 140056/2019-0, respectivement). T.T.T. a été soutenu par CNPq (310906/2022-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich 05038-500G For microbiology
Black cardboards - - 70x50 cm
Bovine blood with anticoagulat  - - 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat - - Around 7-8% of fat
Brush - - Made with plastic
Conical tube Falcon or Generic - 50 mL
Cross-shaped glass containers Handmade NA 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer Vidrolabor NA 500 mL
70% Ethanol Synth A1084.01.BL 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder Nalgon or Generic - 500 mL and 50 mL
Heating pad Thermolux - 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer HeTaiDa HTD8808 Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S,
Accuracy: ±0.2 °C,
Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass) Precision NA 150x20 mm dimensions
             (Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS Cralplast 18130 60x15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette - - 3 mL (total volume)
Sodium citrate Synth C11033.01.AG 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons - - More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula Generic - Flat end and spoon end
Stereomicroscope Bioptika - WF10X/22 lenses
Tweezer - - Metal made and fine point
White led light strips NA NA 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)

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Explorer les choix de cycle vital : Utilisation de la température et du type de substrat comme facteurs d’interaction pour les préférences des larves et des femelles de la mouche à viande
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Cunha, V. A. S., Tandonnet, S.,… More

Cunha, V. A. S., Tandonnet, S., Ferreira, D. L., Rodrigues, A. V., Torres, T. T. Exploring Life History Choices: Using Temperature and Substrate Type as Interacting Factors for Blowfly Larval and Female Preferences. J. Vis. Exp. (201), e65835, doi:10.3791/65835 (2023).

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