Summary
Hierin worden twee protocollen beschreven voor het beoordelen van voedselbron- en ovipositievoorkeuren bij larven en vrouwtjes van bromvliegen. Deze bestaan uit vier keuzes met twee factoren die op elkaar inwerken: het type substraat en de temperatuur. De testen maken het mogelijk om de voedselbronvoorkeur van de larven en de voorkeur voor de ovipositieplaats van de vrouwtjes te bepalen.
Abstract
Bromvliegen (Diptera: Calliphoridae) vertonen een breed scala aan larvale levensstijlen, meestal geclassificeerd als obligaat parasitisme, facultatief parasitisme en volledige sapro-necrofagie. Verschillende parasitaire soorten, zowel obligate als facultatieve, worden beschouwd als van sanitair en economisch belang, omdat hun larven myiasis (madenbesmetting in levend weefsel) kunnen veroorzaken. Het is echter opmerkelijk dat het volwassen vrouwtje een beslissende rol speelt bij het kiezen van de ovipositieplaats en daarom grotendeels de voedingsgewoonte en ontwikkelingsomstandigheden van de larven bepaalt. In deze studie worden twee protocollen voorgesteld om de voedingsvoorkeur van larven en de voorkeur voor de vrouwelijke ovipositieplaats te testen, rekening houdend met twee op elkaar inwerkende factoren: het type vleessubstraat en de temperatuur. De hier gepresenteerde opstellingen maakten het mogelijk om Lucilia cuprina-larven en drachtige vrouwtjes te testen in een vierkeuzetest met twee temperaturen (33 ± 2 °C en 25 ± 2 °C) en twee soorten vleessubstraten (vers vlees aangevuld met bloed en 5 dagen oud bedorven vlees). Larven of drachtige vrouwtjes kunnen ervoor kiezen om respectievelijk hun eieren in te graven of te leggen in een van de volgende situaties: bedorven vlees bij 25 °C (simulatie van een acrofaag soort), vers vlees aangevuld met bloed bij 33 °C (simulatie van een parasitaire soortconditie) en twee controles, bedorven vlees bij 33 °C of vers vlees aangevuld met bloed bij 25 °C. De voorkeur wordt beoordeeld door het aantal larven of eieren te tellen dat in elke optie voor elke replica is gelegd. Door de waargenomen resultaten te vergelijken met een willekeurige verdeling, kon de statistische significantie van de voorkeur worden ingeschat. De resultaten gaven aan dat larven van L. cuprina een sterke voorkeur hebben voor het rotte substraat bij 25 °C. Omgekeerd was de voorkeur van vrouwtjes voor de ovipositieplaats meer gevarieerd voor het vleestype. Deze methodologie kan worden aangepast om de voorkeur van andere insectensoorten van vergelijkbare grootte te testen. Andere vragen kunnen ook worden onderzocht door gebruik te maken van alternatieve voorwaarden.
Introduction
Vliegen, met name kelkvormige muskoïden (waaronder bromvliegen, huisvliegen, botvliegen en vleesvliegen), vertonen een breed scala aan levensstijlen, waaronder parasitair en necro-saprofage gedrag. Parasitaire soorten veroorzaken meestal myiasis, een aantasting van levende weefsels door maden (larven)2. In de familie Calliphoridae zijn zowel obligate als facultatieve parasitaire soorten belangrijke veeplagen die verantwoordelijk zijn voor economische verliezen en slecht dierenwelzijn als gevolg van madenplagen 2,3,4,5,6,7. Obligate parasieten, zoals de schroefwormen van de Nieuwe Wereld en de Oude Wereld (respectievelijk Cochliomyia hominivorax en Chrysomyia bezziana), zijn bijzonder problematisch 4,7,8,9,10 samen met facultatieve parasieten, zoals de schapenbromvliegen (Lucilia cuprina en Lucilia sericata)2,5,6, 7. okt. Niet-parasitaire soorten, waaronder sapro-necrofaag, ontwikkelen zich in rottend en necrotisch organisch materiaal en worden vaak aangetroffen in onhygiënische omgevingen. Hun strikt niet-parasitaire levensstijl kan met succes worden gebruikt voor madentherapie, waarbij vliegenlarven worden gebruikt om wonden van necrotische weefsels schoon te maken11,12,13. Bromvliegen worden ook gebruikt in de forensische wetenschap, omdat ze tot de eerste organismen behoren die recent overleden lichamen lokaliseren en koloniseren, waarbij de zich ontwikkelende larven dienen als een middel om het tijdstip van overlijden te schatten14.
De levensstijl van bromvliegen is het onderwerp geweest van verschillende onderzoeken (bijv. 15,16,17,18,19,20,21) vanwege hun betekenis in relatie tot menselijke belangen. Inzicht in de biologische mechanismen die de levensstijl van een soort bepalen, kan waardevolle inzichten opleveren in het verbeteren van methoden die gericht zijn op het bestrijden van plaagsoorten. Bovendien bieden de diversiteit en evolutie van de levensstijl van bromvliegen een ideale context om de oorsprong en mechanismen van complexe eigenschappen (bijv. parasitisme) te bestuderen. Parasitisme als gevolg van maden die zich voeden met levend weefsel is verschillende keren onafhankelijk geëvolueerd binnen de familie Calliphoridae22,23. De evolutionaire geschiedenis van de voedingsgewoonten van bromvliegen is echter nog grotendeels onbekend, met studies die beperkt zijn tot het in kaart brengen van de gewoonten langs fylogenieën (bijv. 16,19,22) zonder de hulp van functionele assays. Het is bijvoorbeeld onzeker of obligate parasieten zijn geëvolueerd uit generalisten (d.w.z. facultatieve parasieten) of rechtstreeks uit necrofaag soorten. De moleculaire, fysiologische en gedragsprocessen die gepaard gaan met de evolutionaire verschuivingen in levensstijl zijn ook grotendeels onbekend.
In deze context bieden facultatieve parasieten, zoals de schaapskogelvlieg Lucilia cuprina, die zich kunnen ontwikkelen als parasieten op een gastheer of als necrofagen op kadavers, de mogelijkheid om de factoren en mechanismen te onderzoeken die levensstijlkeuzes bepalen. Lucilia cuprina is een kosmopolitische soort die bekend staat om het veroorzaken van schapenvliegen, vooral in Australië, waar het als een plaag wordt beschouwd 3,16. Myiasis als gevolg van L. cuprina kan ook voorkomen bij andere veedieren, huisdieren en mensen 3,24,25,26,27,28,29,30. De larven kunnen zich echter ook ontwikkelen in necrotische weefsels en rottend materiaal en deze soort is met succes gebruikt in de forensische entomologie omdat het zeer snel is om lijken te lokaliseren en te koloniseren31,32,33,34. Hoewel de parasitaire versus niet-parasitaire levensstijl van bromvliegen wordt bepaald door het larvale stadium, is het het volwassen vrouwtje dat de ovipositieplaats selecteert. Bijgevolg heeft het volwassen vrouwtje een grote invloed op de levensstijl van de larven, omdat deze laatste een beperkte mobiliteit hebben. De keuze van het vrouwtje betekent echter niet noodzakelijkerwijs dat de larven de voorkeur geven aan hetzelfde substraat wanneer ze een keuze krijgen35. Een hypothese is dat gedragsveranderingen die ertoe leiden dat vrouwtjes hun eieren op levend weefsel leggen, deel kunnen hebben uitgemaakt van een vroege omschakeling naar een parasitaire levensstijl. Pre-adaptaties of fysiologische vermogens van de resulterende larven zouden essentieel zijn geweest voor hun succesvolle ontwikkeling op het levende weefsel, wat leidde tot het ontstaan van de parasitaire levensstijl. Als zodanig hoeven de beïnvloede en geselecteerde processen niet noodzakelijkerwijs op één lijn te liggen tussen beide levensfasen.
In deze context werden twee methoden ontwikkeld om gedragsvoorkeur bij bromvliegen te testen, in het bijzonder voor L. cuprina, met betrekking tot het voedingssubstraat van de larven (larvale voorkeurstest) en de ovipositieplaats (vrouwelijke voorkeurstest). Deze methoden houden rekening met twee op elkaar inwerkende factoren: temperatuur en versheid van het vlees. Temperatuur werd gekozen als een cruciale factor, aangezien de meeste gevallen van myiasis voorkomen bij homeotherme dieren2. Daarom werd een temperatuur van 33 °C gekozen als proxy voor de "parasitaire levensstijlfactor", terwijl een temperatuur van 25 °C (kamertemperatuur) de "niet-parasitaire factor" vertegenwoordigt. Er is gekozen voor een temperatuur van 25 °C omdat deze representatief is voor de gemiddelde jaartemperatuur die in Brazilië is geregistreerd (Nationaal Instituut voor Meteorologie, INMET). Daarnaast werden twee soorten vleessubstraten overwogen, beide afkomstig van runderen: (i) vers vlees aangevuld met bloed, dat het substraat nabootst voor de parasitaire levensstijl, dat wordt gebruikt om de parasitaire bromvlieg Co. hominivorax in laboratoriumomstandigheden te kweken36, en (ii) 5 dagen oud rot vlees, dat het substraat nabootst voor de necrofaag levensstijl. Het rundersubstraat wordt vaak gebruikt om L. cuprina te kweken in laboratoriumomstandigheden 27,37,38,39 omdat het verschillende voordelen biedt op het gebied van beschikbaarheid, kosteneffectiviteit en bruikbaarheid, terwijl het een ecologisch verantwoord substraat is. Andere studies40,41 waarin het effect van rotte versus verse substraten bij bromvliegen werd vergeleken, hebben 7 dagen oud rot substraat gebruikt (in anaërobe omstandigheden) en toonden een nadelig effect van het rotte substraat op ontwikkelingssnelheden, overleving en groei. Omdat bekend is dat L. cuprina verse kadavers koloniseert die meestal aan lucht worden blootgesteld, hebben we besloten om 5 dagen oud rot vlees (rundergehakt) te gebruiken in niet-hermetische potten (aërobe en anaërobe afbraak) om een necrofaag substraat na te bootsen.
De hier gepresenteerde experimentele ontwerpen bieden het voordeel van het onderscheiden van voorkeuren voor individuele factoren en hun gecombineerde effecten. Bovendien zijn de gescoorde fenotypen, namelijk de keuze van het voedingssubstraat voor de larven en het aantal gelegde eieren, direct relevant voor de biologische en ecologische aspecten van bromvliegsoorten. De geschiktheid van deze protocollen wordt benadrukt door hun effectiviteit in L. cuprina aan te tonen. Daarnaast wordt een script voor statistische analyse verstrekt, dat kan worden gebruikt om de waargenomen resultaten verkregen in L. cuprina te vergelijken met gesimuleerde willekeurige gegevens, waardoor robuuste statistische analyse en interpretaties worden gegarandeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vliegenmonsters werden verkregen met behulp van vallen en niet op besmette dieren. Er werd een SISBIO-vergunning (67867-1) afgegeven om vliegen van de familie Calliphoridae in gevangenschap te verzamelen en te houden in laboratoriumomstandigheden. Insectenmonsters zijn vrijgesteld van ethische evaluatie in onderzoek in Brazilië. Rundvlees en -bloed werden commercieel verkregen en er was geen ethische goedkeuring vereist.
1. Voedingsvoorkeur voor larven
- Bereiding van de petrischaaltjes met 2% agar
- Bereid vier petrischaaltjes met 2% agar. Voeg hiervoor 6 g bacteriologische agar toe aan 300 ml water en smelt dit mengsel in een magnetron. Verdeel het volume vervolgens gelijkmatig over vier glazen petrischaaltjes (150 x 20 mm), waarbij je in elk schaaltje ongeveer 70 ml gebruikt.
OPMERKING: Bereid petrischalen die gelijk zijn aan het gewenste aantal experimentele replicaten. In deze studie werden 36 replicaten gebruikt. - Zodra de agar is gestold, gebruikt u een conische buis van 50 ml (diameter van 3 cm) om vier gaatjes in de agar te ponsen, twee aan elke kant van de petrischaal, volgens het meegeleverde snijpatroon (figuur 1).
LET OP: Deze opzet is vergelijkbaar met eerder beschreven protocollen door Fouche et al. (2021)40 en Boulay et al. (2016)42.
- Bereid vier petrischaaltjes met 2% agar. Voeg hiervoor 6 g bacteriologische agar toe aan 300 ml water en smelt dit mengsel in een magnetron. Verdeel het volume vervolgens gelijkmatig over vier glazen petrischaaltjes (150 x 20 mm), waarbij je in elk schaaltje ongeveer 70 ml gebruikt.
- Voorbereiding van substraten
- Om het verse vlees met bloed te bereiden, voegt u 12 ml verdund runderbloed toe aan 200 g vers rundergehakt. Meng. Zorg ervoor dat u voor elk type vlees verschillende maatcilinders en lepels gebruikt om kruisbesmetting tussen substraten te voorkomen.
OPMERKING: Het verdunde bloed bestaat voor 50% uit zuiver bloed gemengd met een antistollingsmiddel (3,8% natriumcitraat) en voor 50% gefilterd water. - Om het rotte substraat te bereiden, voegt u 12 ml gefilterd water toe aan 200 g 5 dagen oud rot rundergehakt en mengt u dit goed.
OPMERKING: Bedorven vlees werd verkregen door versgemalen vlees gedurende vijf dagen bij 25 °C te incuberen in niet-hermetische plastic potten (mix van aërobe en niet-aërobe ontleding). Elke pot bevatte 200 g vers gemalen vlees. Het werd vervolgens ingevroren tot gebruik. - Vul in elk petrischaaltje twee gaatjes met het mengsel van vers vlees en bloed en de overige twee gaatjes met het mengsel van rot vlees en water.
OPMERKING: Om positiefouten te voorkomen, varieert u de plaatsing van de verschillende vleessoorten in de petrischalen. Sommige petrischalen moeten bijvoorbeeld hetzelfde soort vlees tegenover elkaar hebben, terwijl in andere schalen het vleestype moet worden gekruist, zoals weergegeven in figuur 2.
- Om het verse vlees met bloed te bereiden, voegt u 12 ml verdund runderbloed toe aan 200 g vers rundergehakt. Meng. Zorg ervoor dat u voor elk type vlees verschillende maatcilinders en lepels gebruikt om kruisbesmetting tussen substraten te voorkomen.
- Experimentele opstelling
- Plaats het verwarmingskussen bij een kamertemperatuur (RT) van 25 °C direct onder een lichtbron om het experimentele gebied gelijkmatig te verlichten en elke gedragsbias naar of tegen het licht te voorkomen. Plaats kartonnen pads rond het verwarmingskussen om ervoor te zorgen dat de experimentele opstelling waterpas blijft.
NOTITIE: De gebruikte lichtbron was wit licht met lage verwarming, zoals een neonbuis. Het verwarmingskussen werd op een tafel direct onder de plafondlampen geplaatst (Figuur 3). - Bedek het verwarmingskussen en de nivelleringspads met zwart karton en schakel het verwarmingskussen in.
OPMERKING: De zwarte kartonnen omslag moet worden gebruikt om visuele aanwijzingen te vermijden die de gedragstest kunnen beïnvloeden. - Plaats zes petrischaaltjes met agar en vleessubstraat op het zwarte karton met twee substraten, één van elk type, op het verwarmingskussen en de andere twee van het oppervlak van het verwarmingskussen (Figuur 2). Laat de substraten ongeveer 10 minuten opwarmen.
OPMERKING: Er kan condens ontstaan op het deksel van de petrischalen.
- Plaats het verwarmingskussen bij een kamertemperatuur (RT) van 25 °C direct onder een lichtbron om het experimentele gebied gelijkmatig te verlichten en elke gedragsbias naar of tegen het licht te voorkomen. Plaats kartonnen pads rond het verwarmingskussen om ervoor te zorgen dat de experimentele opstelling waterpas blijft.
- Larvale test
- Controleer de temperatuur van de ondergronden (koude kant: 25 ± 2 °C; warme kant: 33 ± 2 °C) met een infraroodthermometer.
NOTITIE: Het verwarmingskussen blijft gedurende de hele duur van het experiment branden. Aan het begin en aan het einde van het experiment werden temperatuurmetingen gedaan. Hoewel de temperatuur met ± 2 °C fluctueerde, was er nog steeds een temperatuurverschil van minimaal 8 °C tussen de warme en koude omstandigheden. - Plaats na het bereiken van de gewenste temperatuur vijf larven van de derde instar in het midden van elke petrischaal met een pincet (Figuur 2) en bedek de petrischalen met de deksels. Laat het keuze-experiment 10 minuten lopen.
OPMERKING: Sommige larven kunnen langs de randen en op het deksel van de petrischalen kruipen. Als er een larve ontsnapt, gebruik dan een pincet om deze terug te plaatsen in het midden van de petrischaal. - Haal na 10 minuten alle petrischaaltjes van het verwarmingskussen en plaats ze op een ander oppervlak om te voorkomen dat de substraten blijven verwarmen. Tel vervolgens het aantal larven in elk substraat, evenals degenen die geen substraat hebben gekozen.
OPMERKING: Lucilia cuprina-larven blijven in het door hen gekozen substraat, zoals waargenomen in dit experiment.
- Controleer de temperatuur van de ondergronden (koude kant: 25 ± 2 °C; warme kant: 33 ± 2 °C) met een infraroodthermometer.
2. Voorkeur voor vrouwelijke ovipositieplaats
- Experimentele opstelling
- Gebruik een gewone plank die eerder is bedekt met zwart karton en gelijkmatig is verlicht met witte LED-lichtstrips.
OPMERKING: De zwarte kartonnen omslagen moeten worden gebruikt om visuele aanwijzingen te vermijden die de gedragstest kunnen beïnvloeden. De witte LED-strips worden in de lengte vastgezet in het midden van de plank recht boven het experiment. De planken die in de opstelling werden gebruikt, werden 45 cm uit elkaar geplaatst. - Plaats bij RT (25 °C) een verwarmingskussen in het midden van de plank. Gebruik kartonnen pads rond het verwarmingskussen als ondersteuning om ervoor te zorgen dat de experimentele opstelling waterpas staat.
- Bedek het verwarmingskussen en de nivelleringskussens met zwart karton om hetzelfde visuele patroon onder alle substraten te behouden.
- Plaats twee kruisvormige glazen containers op één plank, elk moet twee armen over het zwarte karton en het verwarmingskussen hebben. Schakel de witte LED-lichtstrips en de verwarmingskussens in voordat het experiment begint.
- Gebruik 70% ethanol om de kruisen schoon te maken (in het kruis en het deksel) om geurverontreiniging te voorkomen.
- Gebruik een gewone plank die eerder is bedekt met zwart karton en gelijkmatig is verlicht met witte LED-lichtstrips.
- Voorbereiding van substraten
- Bereid vier petrischaaltjes (60 mm x 15 mm) per kruis met 5 g bedorven of vers vlees van 5 dagen oud (twee van elk type substraat).
OPMERKING: Bereid petrischalen die gelijk zijn aan het aantal experimentele replicaten dat vier keer gewenst is. In dit onderzoek werden 30 replicaten gebruikt, in totaal 120 bereide petrischalen. - Voeg 1 ml verdund runderbloed (50% zuiver bloed met antistollingsmiddel en 50% gefilterd water) toe aan het verse vlees en 1 ml gefilterd water aan het bedorven vlees. Meng het vlees (vers of bedorven) grondig met de vloeistof (bloed of water) met een andere lepel voor elke vleessoort.
OPMERKING: De bereiding van het vlees voor de vrouwelijke test lijkt sterk op de larvale test, hoewel de hoeveelheden anders zijn omdat de vrouwelijke test langer zal lopen dan de larvale test. Vergeet niet om voor elk type vlees verschillende pipetpunten en lepels te gebruiken om geurkruisbesmetting tussen substraten te voorkomen. - Controleer of de alcohol volledig uit de kruisen is verdampt. Plaats vervolgens vier petrischaaltjes (één van elke vleessoort op het verwarmingskussen en de andere twee van het oppervlak van het verwarmingskussen) aan het uiteinde van elke arm van het kruis (Figuur 4). Sluit de kruisen met hun deksels en laat de substraten ongeveer 10 minuten opwarmen.
OPMERKING: Om positiefouten te voorkomen, moet u bovendien de plaatsing van de verschillende vleessoorten in de kruisen variëren. Sommige kruisen moeten bijvoorbeeld hetzelfde soort vlees op aangrenzende armen hebben, terwijl in andere kruisen hetzelfde vleestype tegenover elkaar moet staan, zoals weergegeven in figuur 4.
- Bereid vier petrischaaltjes (60 mm x 15 mm) per kruis met 5 g bedorven of vers vlees van 5 dagen oud (twee van elk type substraat).
- Vrouwelijke test
- Verzamel zwangere vrouwtjes in de vliegenkooi en isoleer ze in individuele buizen.
OPMERKING: Zwangere vrouwtjes worden gekenmerkt door een vergroot en witachtig geel achterlijf in tegenstelling tot niet-drachtige vrouwtjes (Figuur 5). Zwangere vrouwtjes werden tussen 10 en 16 dagen na opkomst verzameld voor de experimenten. - Controleer de temperatuur van de ondergronden in de kruisen (koude kant: 25 ± 2 °C; warme kant: 33 ± 2 °C) met behulp van een infraroodthermometer.
OPMERKING: Net als bij de larvale test blijft het verwarmingskussen gedurende de hele duur van het experiment branden. Aan het begin en einde van het experiment werden temperatuurmetingen gedaan. Hoewel de temperatuur met ± 2 °C fluctueerde, was er nog steeds een temperatuurverschil van minimaal 8 °C tussen de warme en koude omstandigheden. - Plaats de buis ondersteboven met daarin een zwangere vrouw in de opening in het midden van elk kruis. Nadat het vrouwtje het kruis is binnengegaan, verwijdert u de buis en sluit u de opening met het kleine deksel. Nadat je alle kruizen hebt gesloten, plaats je een zwart karton vooraan in de plank om de experimentele opstelling in te sluiten. Laat het experiment 4 uur duren.
- Verwijder daarna het vrouwtje door het voorzichtig op te vangen met een buis en controleer of er eieren op de substraten zaten.
- Identificeer het deksel van elke petrischaal met het substraattype van elk kruis. Gebruik 70% ethanol om de kruisen (in het kruis en het deksel) te reinigen van eventuele geuren van de test.
OPMERKING: Als de eieren niet direct na het experiment kunnen worden geteld, kunnen de petrischaaltjes met substraten bij -20 °C worden bewaard.
- Verzamel zwangere vrouwtjes in de vliegenkooi en isoleer ze in individuele buizen.
- Aantal eieren
OPMERKING: Als de substraten in de petrischalen bevroren waren, ontdooi ze dan voordat u gaat tellen.- Gebruik een stereomicroscoop om het aantal eieren te tellen dat in elk substraat is gelegd. Gebruik een borstel en water om de eieren te scheiden om ze te tellen.
3. Data-analyse en statistiek
- Berekening van voorkeursindexen
- Bereken voor elk duplo van larvale (n = 36) en vrouwelijke (n = 30) tests de voorkeursindex voor vlees (aangeduid alsPI-vlees) door de verhouding te bepalen tussen larven of eieren die aanwezig zijn op verse substraten (vers warm en vers koud) en het totale aantal larven of eieren op alle substraten (vers warm + vers koud + rot heet + rot koud).
PIvlees = (# larven of eitjes op verse substraten) / # Totaal larven of eitjes
OPMERKING: De termen "Warm" en "Koud" zijn indicatief voor temperatuuromstandigheden van respectievelijk 33 ± 2 °C en 25 ± 2 °C. - Bereken op dezelfde manier de voorkeursindex voor temperatuur (PI-temp) voor elke replicatie van larvale en vrouwelijke tests als het aantal larven of eieren dat aanwezig is op hete substraten (vers heet en rot heet) gedeeld door het totale aantal larven of eieren op alle substraten (vers warm + vers koud + rot heet + rot koud ).
PItemp = (# larven of eitjes op hete substraten) / # Totaal aantal larven of eitjes
OPMERKING: Waarden dicht bij 1 geven een voorkeur aan voor verse of warme substraten en waarden dicht bij nul duiden op een voorkeur voor rotte of koude substraten. De PI's kunnen handmatig worden berekend of met behulp van de verstrekte code (Supplemental Files S1 en Supplemental Files S2).
- Bereken voor elk duplo van larvale (n = 36) en vrouwelijke (n = 30) tests de voorkeursindex voor vlees (aangeduid alsPI-vlees) door de verhouding te bepalen tussen larven of eieren die aanwezig zijn op verse substraten (vers warm en vers koud) en het totale aantal larven of eieren op alle substraten (vers warm + vers koud + rot heet + rot koud).
- Vergelijking van de waargenomen voorkeur voor gesimuleerde willekeurige gegevens
- Voer de meegeleverde code (aanvullend bestand S1 en aanvullend bestand S1) uit om de gesimuleerde gegevens te genereren en te vergelijken met de waargenomen gegevens.
OPMERKING: Deze code genereert 1000 gesimuleerde willekeurige datasets voor larven en vrouwtjes en berekent de voorkeursindexen (PI's) voor elke replicatie van de gesimuleerde en de waargenomen gegevens van L. cuprina. De simulaties gaan ervan uit dat zowel larven als vrouwtjes geen substraatvoorkeur vertonen en willekeurige keuzes maken. De simulaties omvatten de belangrijkste gedragsaspecten van de dieren, waaronder verschillende scenario's, zoals: de kans dat larven geen substraat kiezen, en volwassen vrouwtjes die hun eileg concentreren op een enkel substraat of hun eieren al dan niet uniform verdelen over verschillende substraten. Gegeneraliseerde lineaire modellen (GLM, familie: quasibinomiaal; link: logit) werden gebruikt om de waargenomen gegevens van de gedragstesten te vergelijken met de gesimuleerde willekeurige gegevens. De gebruikte GLM was zeer geschikt voor deze analyse vanwege het begrensde karakter van de Preference Index (PI), variërend tussen 0 en 1. GLM's zijn bedreven in het omgaan met niet-normaal verdeelde responsvariabelen en maken robuuste statistische vergelijkingen mogelijk. Deze keuze maakte zinvolle inzichten mogelijk door het mogelijk te maken om waargenomen gegevens van gedragstesten effectief te vergelijken met complexe patronen die werden gegenereerd door gesimuleerde willekeurige gegevens. Kleine aanpassingen aan de code kunnen nodig zijn voor andere gestructureerde datasets.
- Voer de meegeleverde code (aanvullend bestand S1 en aanvullend bestand S1) uit om de gesimuleerde gegevens te genereren en te vergelijken met de waargenomen gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de effectiviteit van de gepresenteerde methoden aan te tonen, werden de experimenten uitgevoerd met behulp van een laboratoriumpopulatie van Lucilia cuprina (familie: Calliphoridae), een facultatieve parasitaire bromvlieg2. De volledige ruwe dataset die voor deze soort is verkregen, is te vinden in aanvullend bestand S3 met de resultaten voor de larvale en vrouwelijke substraatvoorkeurstests. Om te beoordelen of de larven en vrouwtjes een voorkeur hebben voor een substraat, werden de waargenomen gegevens vergeleken met 1000 gesimuleerde datasets, die elk een willekeurige keuze vertegenwoordigen (zie code in aanvullend bestand S1). Het percentage statistisch significante vergelijkingen (p < 0,05) werd gebruikt als maatstaf om de voorkeur te beoordelen. Uit deze analyse bleek dat de larven een duidelijke voorkeur vertoonden voor het rotte substraat bij 25 °C (figuur 6A, tabel 1), aangezien alle 1000 vergelijkingen tussen de waargenomen gegevens en elk van de gesimuleerde willekeurige keuzedatasets significant verschillend bleken te zijn voor de vlees- en temperatuuromstandigheden. Ook de vrouwtjes vertoonden een merkbare voorkeur voor 25 °C: 69,7% van de vergelijkingen tussen de waargenomen gegevens en de willekeurige keuze bleken significant verschillend (figuur 6B, tabel 1). Hun voorkeur voor bedorven vlees was echter genuanceerder (Figuur 6B, Tabel 1), aangezien slechts 27,1% van de waargenomen versus willekeurige keuzevergelijkingen significant was. Een andere observatie uit deze studie was dat larven van L. cuprina meestal een snelle keuze maakten en zich binnen de eerste 2 minuten van het experiment in het vleessubstraat ingroeven. Ze veranderden zelden in een andere toestand tijdens het experiment van 10 minuten.
Figuur 1: Voedingspatroon voor larven voor petrischaaltjes met agar. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 2: Bovenaanzicht diagram van de lay-out van de larvale voedingsvoorkeurstest. De keuzes werden willekeurig gepositioneerd en de tests werden uitgevoerd bij RT (25 ± 2 °C). De zwarte rechthoek stelt het verwarmingskussen voor, dat de temperatuur op 33 ± 2 °C houdt. Rode en blauwe cirkels staan respectievelijk voor vers vlees aangevuld met verdund bloed (50%) en bedorven vlees aangevuld met water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Diagram dat illustreert hoe de larvale experimentele opstelling onder de lichtbron moet worden geplaatst om vooroordelen naar of tegen licht te voorkomen. De gebruikte lichtbron was wit licht met lage verwarming (neonbuis). Het verwarmingskussen werd op een tafel direct onder de plafondlamp geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bovenaanzicht diagram van de lay-out van de voorkeurstest voor vrouwelijke ovipositieplaatsen. De keuzes werden willekeurig gepositioneerd en de tests werden uitgevoerd bij RT (25 ± 2 °C). De zwarte rechthoek stelt het verwarmingskussen voor dat de temperatuur op 33 ± 2 °C houdt. Rode cirkels staan voor vers vlees met verdund bloed (50%) en blauwe cirkels, bedorven vlees met water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Foto van een zwangere (rechts) versus een niet-zwangere (links) vrouw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Gemiddelde voorkeursindexen (PI's) voor vleestype en temperatuur voor larven (A) en vrouwtjes (B) weergegeven op een cartesisch vlak. De zwarte cirkels vertegenwoordigen de gemiddelde PI's, rekening houdend met alle experimentele replicaten (n = 36 voor larven en n = 30 voor vrouwelijke experimenten) verkregen voor L. cuprina. Elk van de grijze cirkels geeft de gemiddelde PI's voor vlees en temperatuur aan van een gesimuleerde dataset met vergelijkbare kenmerken als de waargenomen dataset (bijv. hetzelfde aantal replicaten), maar vertegenwoordigt een willekeurige keuze. De gekleurde ruiten dienen als visueel hulpmiddel om de PI-voorkeursgebieden voor elk van de vier keuzes weer te geven, waarbij blauw bedorven vlees aangeeft bij 25 ± 2 °C, groen als bedorven vlees bij 33 ± 2 °C, geel als vers vlees bij 25 ± 2 °C en oranje als vers vlees bij 33 ± 2 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Podium | Vergelijking | Belangrijke vergelijkingen voor PImeat | Belangrijke vergelijkingen voor PItemp |
| Larven | Gesimuleerde vs. nulhypothese (p < 0,05) | 3.8% | 2.1% |
| Waargenomen vs. gesimuleerd (p < 0,05) | 100.0% | 100.0% | |
| Vrouwen | Gesimuleerde vs. nulhypothese (p < 0,05) | 3.3% | 4.6% |
| Waargenomen vs. gesimuleerd (p < 0,05) | 27.1% | 69.7% |
Tabel 1. Percentage significantPI-vlees enPI-temp (p-waarden < 0,05) van de vergelijkingen tussen (i) de gesimuleerde willekeurige gegevens (geen voorkeur) en de statistische nulhypothese, en (ii) de waargenomen gegevens en de gesimuleerde willekeurige gegevens. De resultaten worden afzonderlijk gepresenteerd voor larven en vrouwtjes.
Aanvullend bestand S1: Code die wordt gebruikt voor gegevensanalyse en statistieken in R-afprijzing. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier S2: Verslag van de statistische analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier S3: Ruwe tellingen van Lucilia cuprina voor larvale en vrouwelijke voorkeur voor elk van de vier substraatkeuzes. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de evolutie van voedingsgewoonten te begrijpen, met name in de context van parasitisme bij bromvliegen, is het nodig om de voorkeuren van het substraat te onderzoeken in de verschillende levensfasen voor voeding of ovipositie. Daarom werden in deze studie robuuste en eenvoudige methoden voorgesteld voor het onderzoeken van substraatvoorkeuren bij larven en vrouwtjes van bromvliegen. Deze methoden werden getest in Lucilia cuprina, een facultatieve parasitaire bromvlieg2. Interessant is dat de experimenten een duidelijke neiging voor bedorven vlees bij 25 °C bij L. cuprina-larven aan het licht brachten, in overeenstemming met de omstandigheden die typisch worden gebruikt door acrofaag soorten. Dit verschilde van een studie van Fouche et al40, die een voorkeur voor vers leversubstraat aantoonde in Lucilia sericata en Calliphora vicina en aantoonde dat het rotte substraat een negatieve invloed had op overleving en groei. Het is echter moeilijk om de resultaten van beide onderzoeken te vergelijken, omdat de mate van vleesbederf (zeven dagen versus vijf in ons geval) en het ontbindingsproces (puur anaëroob versus aëroob en anaëroob in ons geval) verschillend waren. De gebruikte soorten waren ook verschillend. Bovendien gaven waarnemingen van de hier gepresenteerde experimenten aan dat vrouwtjes hun eieren bij voorkeur bij 25 °C legden, terwijl ze slechts een lichte voorkeur voor bedorven vlees vertoonden. Deze resultaten laten zien dat de keuzes van larven en vrouwtjes niet hetzelfde zijn en dat de vrouwtjes een meer gevarieerde keuze vertonen voor hun keuze van de ovipositieplaats dan de larven voor het graven en voedselkeuzes. Dit suggereert dat de parasitaire gewoonte in L. cuprina wordt veroorzaakt door veranderingen in de keuze van de vrouwelijke ovipositie en niet door de voedingsvoorkeur van de larven. Deze bevindingen dienen met name als een proof-of-concept-demonstratie van de effectiviteit en bruikbaarheid van de methoden bij het ophelderen van de levensstijl van bromvliegen in verschillende ontwikkelingsstadia.
Verschillende vlees- en temperatuuromstandigheden werden gebruikt om parasitaire en necrofaag leefstijlfactoren na te bootsen. Deze aanpak vergemakkelijkte de evaluatie van de voeding van larven en de voorkeuren van de vrouwelijke ovipositieplaats in een vierkeuzetest, waarbij gebruik werd gemaakt van twee op elkaar inwerkende factoren. De aangenomen protocollen vertegenwoordigen een benadering die afwijkt van de traditionele tweekeuzetechniek die doorgaans in eerdere studies werd gebruikt: 43,44,45,46,47,48,49,50. Om variaties als gevolg van omgevingsfactoren die het gedrag kunnen beïnvloeden, zoals licht-, visuele of geursignalen, tot een minimum te beperken, werden rigoureuze controlemaatregelen geïmplementeerd. Uniforme en consistente verlichting van bovenaf werd gehandhaafd in de tests om vooroordelen naar of tegen licht te voorkomen, aangevuld met het gebruik van een zwarte achtergrond om de impact van mogelijke visuele aanwijzingen op larvale en vrouwelijke voorkeuren te voorkomen. Bovendien werd het risico van kruisbesmetting tussen rotte en verse vleessubstraten vermeden door gebruik te maken van glas of plastic wegwerpmateriaal, handschoenen en apart keukengerei. De toepassing van deze maatregelen bleek van cruciaal belang voor het opzetten van een gecontroleerd en betrouwbaar experimenteel kader, waardoor de robuustheid en betrouwbaarheid van de verkregen resultaten werd gewaarborgd.
Het ontwerp van het larvale experiment was vergelijkbaar met eerder beschreven tweekeuzetests40,42, met aanpassingen om de temperatuurfactor op te nemen. Het hier beschreven larvale protocol bleek snel, robuust en eenvoudig te zijn, aangezien de larven een sterke neiging vertoonden om zich in het door hen gekozen substraat te blijven graven, waardoor de mogelijkheid van dubbelzinnige scoreproblemen als gevolg van het wisselen van substraten aan het einde van het experiment werd geëlimineerd. Deze specifieke functie stelt de onderzoeker in staat om zes of meer replica's tegelijkertijd uit te voeren zonder het risico van onduidelijke of onzekere resultaten. Hoewel de aanwezigheid van meerdere larven binnen hetzelfde replicaat individuele keuzes kan beïnvloeden, maakt het protocol het mogelijk om de algemene substraatvoorkeur te beoordelen door middel van onafhankelijke replicaten. In scenario's waarin mogelijk aggregatief gedrag moet worden vermeden of gecontroleerd, kunnen individuele tests of de integratie van controle-experimenten om rekening te houden met mogelijke invloeden tussen larven worden geïmplementeerd om eventuele vertekening tegen te gaan.
Aan de andere kant biedt het voorkeursprotocol voor de vrouwelijke ovipositieplaats het opmerkelijke voordeel dat de individuele keuze onafhankelijk wordt beoordeeld, vrij van de invloed van de voorkeuren van andere vrouwtjes, waardoor aggregatief gedrag wordt vermeden. Het is inderdaad bekend dat de keuze van de legovipositie van calliforide vrouwen kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van soortgenoten46,47. Niettemin is het belangrijk om de inherente beperking van de experimentele test te erkennen. Eieren mogen niet binnen het experimentele venster van 4 uur worden gelegd vanwege ongeschikte omstandigheden of, waarschijnlijker, de onvolwassenheid van de vrouwtjes. Deze onzekerheid resulteert in een subset van de replicaten zonder dat er eieren zijn gelegd (78% van de proeven). Bovendien introduceert het grote verschil in het aantal eieren dat in elk duplicaat wordt gelegd (26 tot 208, gemiddelde ± standaarddeviatie = 132,4 ± 46,2) aanzienlijke variabiliteit, waardoor het een uitdaging is om onderscheid te maken tussen variaties die worden veroorzaakt door de voorkeur van het vrouwtje en variaties die worden beïnvloed door factoren zoals beperkte eireserves of late eileg tijdens het experiment. Ondanks deze beperkingen zijn de voorgestelde protocollen geschikt om de voorkeur voor de ovipositieplaats effectief te beoordelen.
Over het algemeen hebben de ontwikkelde protocollen een aanzienlijk potentieel voor een breed scala aan toepassingen bij het bestuderen van het gedrag van bromvliegen. Ten eerste kunnen deze tests worden gebruikt om de effecten van verschillende behandelingen, zoals verschillende houderij- of ontwikkelingsomstandigheden, op larvale of vrouwelijke voorkeuren binnen dezelfde soort te onderzoeken. Dit zou mogelijk de onderliggende mechanismen kunnen onthullen die gedragsvoorkeuren en hun genetische basis aansturen, vooral in combinatie met sequencing-technieken. Bovendien kunnen deze tests worden uitgebreid om de substraatvoorkeuren van verschillende bromvliegsoorten te onderzoeken, wat waardevolle inzichten oplevert in de evolutie van parasitisme binnen deze groep. Door zich te verdiepen in de diverse voorkeuren van bromvliegen, kan een beter begrip worden verkregen van hun ecologische aanpassingen, wat waardevolle kennis oplevert voor het toekomstige beheer en de bestrijding van plaagsoorten.
Ten slotte reikt het potentieel van de protocollen verder dan alleen de studie van bromvliegen. Met kleine aanpassingen kunnen deze protocollen gemakkelijk worden toegepast om de vliegensoorten uit andere families te beoordelen, zoals huisvliegen en vleesvliegen, of zelfs insecten van vergelijkbare grootte. Het aanpassingsvermogen van de protocollen maakt het ook mogelijk om verschillende substraten te selecteren die passen bij de doelstellingen van specifiek wetenschappelijk onderzoek. Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld de mate van vleesbederf wijzigen of rundervlees vervangen door alternatieve dierlijke bronnen (bijv. vis, varkensvlees) of niet-dierlijke substraten (bijv. fruit) om verschillende ecologische vragen aan te pakken. Deze aanpassingen vergroten niet alleen de veelzijdigheid van de protocollen, maar maken ook het mogelijk om voorkeuren in een breed scala aan insectensoorten en ecologische contexten te verkennen, waardoor het vermogen om fundamentele aspecten van insectengedrag en ecologische aanpassing op te helderen, wordt vergroot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen gedeclareerd.
Acknowledgments
We danken Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim en Lucas de Almeida Carvalho voor het leveren van de L. cuprina-kolonie en voor hun hulp bij het opzetten van het experiment. We willen ook Rafael Barros de Oliveira bedanken voor het filmen en monteren van de video. Dit onderzoek werd ondersteund door de Developing Nation Research Grant van Animal Behavior Society aan V.A.S.C. en door een FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo grant aan T.T.T. (20/05636-4). S.T. en D.L.F. werden ondersteund door een FAPESP (respectievelijk 19/07285-7 postdoctorale beurs en 21/10022-8 PhD-beurs). V.A.S.C. en A.V.R. werden ondersteund door CNPq PhD-beurzen (respectievelijk 141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. werd ondersteund door CNPq (310906/2022-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
References
- Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
- Zumpt, F. Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , Butterworths. London. (1965).
- Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
- Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
- Mullen, G. R., Durden, L. A. Medical and veterinary entomology. , Academic press. (2009).
- Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
- World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , Paris. (2013).
- Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45 (2018).
- Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30 (2016).
- Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551 (2020).
- Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
- Greenberg, B.
- Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
- Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
- McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
- Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
- Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230 (2021).
- Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
- Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598 (2016).
- Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
- Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
- Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
- Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
- Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
- Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
- Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
- Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
- Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
- Smith, K. G. V. A manual of forensic entomology. , Cornell University Press. UK. (1986).
- Goff, M. L. A Fly for the Prosecution. , Harvard University Press. Cambridge, MA and London, England. (2001).
- CRC Press. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , CRC Press. Boca Raton. (2001).
- Greenberg, B., Kunich, J. C. Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
- Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
- Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
- Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
- Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
- Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
- Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791 (2021).
- Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
- Boulay, J., Deneubourg, J. -L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676 (2016).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
- Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
- Yang, S. -T., Shiao, S. -F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
- Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
- Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
- Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420 (2017).
- Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).
