Summary
Heri beskrives to protokoller til vurdering af fødekilde og ovipositionspræferencer hos larver og hunner af blæsefluer. Disse omfatter fire valg med to interagerende faktorer: substrattype og temperatur. Analyserne gør det muligt at bestemme larvernes fødekildepræference og hunnernes præference for æglægningssted.
Abstract
Blæsefluer (Diptera: Calliphoridae) præsenterer en bred vifte af larvelivsstil, typisk klassificeret som obligatorisk parasitisme, fakultativ parasitisme og fuldstændig sapro-nekrofagi. Flere parasitære arter, både obligatoriske og fakultative, anses for at være af sundhedsmæssig og økonomisk betydning, da deres larver kan forårsage myiasis (maddikeangreb i levende væv). Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at den voksne kvinde spiller en afgørende rolle, da hun vælger ovipositionsstedet og derfor i vid udstrækning bestemmer larvernes fodringsvaner og udviklingsbetingelser. I denne undersøgelse foreslås to protokoller for at teste larvefodringspræference og kvindelig ovipositionsstedpræference under hensyntagen til to interagerende faktorer: kødsubstrattype og temperatur. De opsætninger, der præsenteres her, tillod at teste Lucilia cuprina larver og gravide hunner i et firevalgsassay med to temperaturer (33 ± 2 ° C og 25 ± 2 ° C) og to typer kødsubstrater (fersk kød suppleret med blod og 5 dage gammelt råddent kød). Larver eller drægtige hunner kan vælge at grave eller lægge deres æg i et af følgende: råddent kød ved 25 °C (der simulerer en ådselædende artstilstand), fersk kød suppleret med blod ved 33 °C (der simulerer en parasitisk artstilstand) og to kontroller, råddent kød ved 33 °C eller fersk kød suppleret med blod ved 25 °C. Præferencen vurderes ved at tælle antallet af larver eller æg, der er lagt i hver mulighed for hver replikat. Sammenligning af de observerede resultater med en tilfældig fordeling tillod estimering af den statistiske signifikans af præferencen. Resultaterne viste, at L. cuprina larver har en stærk præference for det rådne substrat ved 25 °C. Omvendt var hunnernes præference for oviposition-site mere varieret for kødtypen. Denne metode kan tilpasses for at teste præferencen for andre insektarter af samme størrelse. Andre spørgsmål kan også udforskes ved hjælp af alternative betingelser.
Introduction
Fluer, især calyptrate muscoider (herunder blowflies, house fluer, bot fluer og kød fluer blandt andre), udviser en bred vifte af livsstil, der omfatter parasitære og nekro-saprophagous adfærd1. Parasitiske arter forårsager typisk myiasis, et angreb af levende væv af maddiker (larver)2. I Calliphoridae-familien er både obligatoriske og fakultative parasitære arter store husdyrskadedyr, der er ansvarlige for økonomiske tab og dårlig dyrevelfærd på grund af maddikeangreb 2,3,4,5,6,7. Obligatoriske parasitter, såsom skrueorm i den nye verden og den gamle verden (henholdsvis Cochliomyia hominivorax og Chrysomyia bezziana), er særligt problematiske 4,7,8,9,10 sammen med fakultative parasitter, såsom fåreblæsefluer (Lucilia cuprina og Lucilia sericata)2,5,6, 7. Ikke-parasitære arter, herunder sapro-nekrofagiske, udvikler sig i rådnende og nekrotisk organisk materiale og findes almindeligvis i uhygiejniske miljøer. Deres strengt ikke-parasitære livsstil kan med succes anvendes til maddiketerapi, der bruger fluelarver til at rense sår af nekrotisk væv11,12,13. Blæsefluer bruges også i retsmedicinsk videnskab, da de er blandt de første organismer til at lokalisere og kolonisere nyligt afdøde kroppe, hvor de udviklende larver tjener som et middel til at estimere dødstidspunktet14.
Blowfly livsstil har været genstand for forskellige forskningsundersøgelser (f.eks. 15,16,17,18,19,20,21) på grund af deres betydning i forhold til menneskelige interesser. Forståelse af de biologiske mekanismer, der styrer en arts livsstil, kan give værdifuld indsigt i forbedring af metoder til bekæmpelse af skadedyrsarter. Desuden tilbyder mangfoldigheden og udviklingen af blowfly livsstil en ideel kontekst til at studere oprindelsen og mekanismerne af komplekse træk (fx parasitisme). Parasitisme på grund af maddiker, der fodrer med levende væv, har udviklet sig uafhængigt flere gange inden for Calliphoridae-familien22,23. Imidlertid er den evolutionære historie om blæsefluers fodringsvaner stadig stort set ukendt, med undersøgelser begrænset til at kortlægge vanerne langs fylogenier (f.eks. 16,19,22) uden hjælp af funktionelle assays. For eksempel er det usikkert, om obligatoriske parasitter udviklede sig fra generalister (dvs. fakultative parasitter) eller direkte fra ådselædende arter. De molekylære, fysiologiske og adfærdsmæssige processer, der ledsager de evolutionære skift i livsstil, er også stort set ukendte.
I denne sammenhæng giver fakultative parasitter, såsom fåreblæseren Lucilia cuprina, der kan udvikle sig som parasitter på en vært eller som nekrofager på kadavere, mulighed for at udforske de faktorer og mekanismer, der styrer livsstilsvalg. Lucilia cuprina er en kosmopolitisk art kendt for at forårsage fårefluestrejke, især i Australien, hvor den betragtes som et skadedyr 3,16. Myiasis på grund af L. cuprina kan også forekomme hos andre husdyr, kæledyr og mennesker 3,24,25,26,27,28,29,30. Imidlertid kan dens larver også udvikle sig i nekrotisk væv og rådnende materiale, og denne art er med succes blevet brugt i retsmedicinsk entomologi, da det er meget hurtigt at lokalisere og kolonisere lig31,32,33,34. Selvom blowflies parasitære versus ikke-parasitære livsstil er defineret af larvestadiet, er det den voksne kvinde, der vælger ovipositionsstedet. Derfor har den voksne hun stor indflydelse på larvernes livsstil, da sidstnævnte har begrænset mobilitet. Hunnens valg betyder dog ikke nødvendigvis, at larverne foretrækker det samme substrat, når de præsenteres for et valg35. En hypotese er, at adfærdsændringer, der fører til, at kvinder lægger deres æg på levende væv, kunne have været en del af et tidligt skift mod en parasitisk livsstil. Fortilpasninger eller fysiologiske evner hos de resulterende larver ville have været afgørende for deres vellykkede udvikling på det levende væv, hvilket førte til fremkomsten af den parasitære livsstil. Som sådan kan de berørte og udvalgte processer ikke nødvendigvis tilpasse sig mellem begge livsfaser.
I denne sammenhæng blev der udviklet to metoder til at teste adfærdsmæssig præference hos blæsefluer, især for L. cuprina, vedrørende larvefodringssubstrat (larvepræferenceassay) og ovipositionssted (kvindelig præferenceanalyse). Disse metoder tager højde for to interaktive faktorer: temperatur og kødfriskhed. Temperatur blev valgt som en afgørende faktor, da de fleste tilfælde af myiasis forekommer hos homøtermiske dyr2. Derfor blev en temperatur på 33 °C valgt som erstatning for den "parasitære livsstilsfaktor", mens en temperatur på 25 °C (stuetemperatur) repræsenterer den "ikke-parasitære faktor". En temperatur på 25 °C blev valgt, da den er repræsentativ for den gennemsnitlige årlige temperatur, der er registreret i Brasilien (National Institute of Meteorology, INMET). Derudover blev to typer kødsubstrater overvejet, begge fra kvægkilder: (i) fersk kød suppleret med blod, der efterligner substratet for den parasitiske livsstil, som bruges til at opdrætte den parasitiske blowfly Co. hominivorax under laboratoriebetingelser36, og (ii) 5 dage gammelt råddent kød, der efterligner substratet for den nekrolædende livsstil. Bovin substrat er almindeligt anvendt til opdræt L. cuprina i laboratorieforhold 27,37,38,39, da det giver flere fordele med hensyn til tilgængelighed, omkostningseffektivitet, og praktisk, samtidig med at det er et økologisk forsvarligt substrat. Andre undersøgelser40,41, der sammenligner effekten af rådne versus friske substrater i blæsefluer, har brugt 7 dage gammelt råddent substrat (under anaerobe forhold) og viste en negativ effekt af det rådne substrat på udviklingshastigheder, overlevelse og vækst. Da L. cuprina er kendt for at kolonisere friske kadavere, som normalt udsættes for luft, besluttede vi at bruge 5 dage gammelt råddent kød (hakket oksekød) i ikke-hermetiske gryder (aerob og anaerob nedbrydning) for at efterligne et nekrofagisk substrat.
De eksperimentelle designs, der præsenteres her, tilbyder fordelen ved at skelne præferencer for individuelle faktorer såvel som deres kombinerede virkninger. Desuden er de scorede fænotyper, nemlig valget af larvefodersubstrat og antallet af æg, der lægges, direkte relevante for de biologiske og økologiske aspekter af blowflyarter. Egnetheden af disse protokoller fremhæves ved at demonstrere deres effektivitet i L. cuprina. Derudover leveres et script til statistisk analyse, som kan bruges til at sammenligne de observerede resultater opnået i L. cuprina med simulerede tilfældige data, hvilket sikrer robust statistisk analyse og fortolkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flueprøver blev opnået ved hjælp af fælder og ikke på angrebne dyr. En SISBIO-licens (67867-1) blev udstedt til at indsamle og holde fluer af Calliphoridae-familien i fangenskab under laboratorieforhold. Insektprøver er undtaget fra etisk evaluering i forskning i Brasilien. Oksekød og blod blev opnået kommercielt, og der var ikke behov for nogen etisk godkendelse.
1. Larve fodring præference
- Tilberedning af petriskåle indeholdende 2% agar
- Tilbered fire petriskåle med 2% agar. For at gøre dette tilsættes 6 g bakteriologisk agar til 300 ml vand og smeltes denne blanding i en mikrobølgeovn. Del derefter volumen jævnt i fire glas petriskåle (150 x 20 mm) med ca. 70 ml i hver skål.
BEMÆRK: Tilbered petriskåle svarende til det ønskede antal eksperimentelle replikater. I denne undersøgelse blev der anvendt 36 replikater. - Når agaren er størknet, skal du bruge et 50 ml konisk rør (3 cm diameter) til at stanse fire huller i agaren, to på hver side af petriskålen, efter det medfølgende skæremønster (figur 1).
BEMÆRK: Denne opsætning ligner tidligere beskrevne protokoller af Fouche et al. (2021)40 og Boulay et al. (2016)42.
- Tilbered fire petriskåle med 2% agar. For at gøre dette tilsættes 6 g bakteriologisk agar til 300 ml vand og smeltes denne blanding i en mikrobølgeovn. Del derefter volumen jævnt i fire glas petriskåle (150 x 20 mm) med ca. 70 ml i hver skål.
- Fremstilling af substrater
- For at tilberede det ferske kød med blod tilsættes 12 ml fortyndet oksekød til 200 g fersk hakket oksekød. Bland grundigt. Sørg for at bruge forskellige graduerede cylindre og skeer til hver type kød for at undgå krydskontaminering mellem underlag.
BEMÆRK: Det fortyndede blod består af 50% rent blod blandet med et antikoagulant (3,8% natriumcitrat) og 50% filtreret vand. - For at forberede det rådne substrat tilsættes 12 ml filtreret vand til 200 g 5 dage gammelt rådnet kvægkød og blandes godt.
BEMÆRK: Råddent kød blev fremstillet ved at inkubere fersk hakket kød i fem dage ved 25 °C i ikke-hermetiske plastpotter (blanding af aerob og ikke-aerob nedbrydning). Hver gryde indeholdt 200 g friskmalet kød. Det blev derefter frosset indtil brug. - Fyld to huller i hver petriskål med blandingen af fersk kød og blod og de resterende to huller med den rådne kød- og vandblanding.
BEMÆRK: For at undgå positionsforstyrrelser skal du variere placeringen af de forskellige kødtyper i petriskålene. For eksempel skal nogle petriskåle have den samme type kød vendt mod hinanden, mens kødtypen i andre retter skal krydses, som vist i figur 2.
- For at tilberede det ferske kød med blod tilsættes 12 ml fortyndet oksekød til 200 g fersk hakket oksekød. Bland grundigt. Sørg for at bruge forskellige graduerede cylindre og skeer til hver type kød for at undgå krydskontaminering mellem underlag.
- Eksperimentel opsætning
- Ved en stuetemperatur (RT) på 25 °C placeres varmepuden direkte under en lyskilde for jævnt at belyse forsøgsområdet og undgå enhver adfærdsbias mod eller mod lyset. Placer pappuder rundt om varmepuden for at sikre, at den eksperimentelle opsætning forbliver nivelleret.
BEMÆRK: Den anvendte lyskilde var hvidt lavt varmeudsendende lys, såsom et neonrør. Varmepuden blev placeret på et bord lige under loftpærerne (figur 3). - Dæk varmepuden og nivelleringspappuderne med sort pap, og tænd for varmepuden.
BEMÆRK: Det sorte papdæksel skal bruges for at undgå visuelle tegn, der kan skævvride adfærdsanalysen. - Læg seks petriskåle med agar og kødsubstrat over det sorte pap med to underlag, et af hver type, på varmepuden og de to andre væk fra varmepudens overflade (figur 2). Lad underlagene varme op i ca. 10 min.
BEMÆRK: Der kan dannes kondens på låget på petriskålene.
- Ved en stuetemperatur (RT) på 25 °C placeres varmepuden direkte under en lyskilde for jævnt at belyse forsøgsområdet og undgå enhver adfærdsbias mod eller mod lyset. Placer pappuder rundt om varmepuden for at sikre, at den eksperimentelle opsætning forbliver nivelleret.
- Larve test
- Kontroller substraternes temperatur (kold side: 25 ± 2 °C; varm side: 33 ± 2 °C) med et infrarødt termometer.
BEMÆRK: Varmepuden forbliver tændt under hele eksperimentets varighed. Temperaturmålinger blev foretaget i begyndelsen og i slutningen af eksperimentet. Selvom temperaturen svingede med ± 2 °C, var der stadig mindst 8 °C temperaturforskel mellem varme og kolde forhold. - Når du har nået den ønskede temperatur, skal du placere fem tredjestjernelarver i midten af hver petriskål ved hjælp af pincet (figur 2) og dække petriskålene med lågene. Lad valgeksperimentet køre i 10 min.
OBS: Nogle larver kan kravle rundt om kanterne og på låget af petriskålene. Hvis en larve undslipper, skal du bruge en pincet til at placere den tilbage til midten af petriskålen. - Efter 10 minutter skal du tage alle petriskålene ud af varmepuden og placere dem på en anden overflade for at undgå fortsat opvarmning af underlagene. Tæl derefter antallet af larver i hvert substrat, såvel som dem, der ikke valgte noget substrat.
BEMÆRK: Lucilia cuprina larver forbliver i deres valgte substrat, som observeret i dette eksperiment.
- Kontroller substraternes temperatur (kold side: 25 ± 2 °C; varm side: 33 ± 2 °C) med et infrarødt termometer.
2. Kvindelig oviposition site præference
- Eksperimentel opsætning
- Brug en almindelig hylde, der tidligere er dækket med sort pap og jævnt oplyst med hvide LED-lysstrimler.
BEMÆRK: De sorte papdæksler skal bruges for at undgå visuelle tegn, der kan skævvride adfærdsanalysen. De hvide LED-strimler er fastgjort på langs midt på hylden lige over eksperimentet. Hylderne, der blev brugt i opsætningen, blev placeret 45 cm fra hinanden. - Ved RT (25 °C) placeres en varmepude i midten af hylden. Brug pappuder omkring varmepuden som støtte for at sikre, at den eksperimentelle opsætning er nivelleret.
- Dæk varmepuden og nivelleringspappuderne med et sort pap for at holde det samme visuelle mønster under alle underlagene.
- Placer to krydsformede glasbeholdere på en hylde, hver skal have to arme over det sorte pap og varmepude. Tænd for de hvide LED-lysstrimler og varmepuderne inden eksperimentets start.
- Brug 70% ethanol til at rengøre krydsene (inde i korset og låget) for at undgå lugtforurening.
- Brug en almindelig hylde, der tidligere er dækket med sort pap og jævnt oplyst med hvide LED-lysstrimler.
- Fremstilling af substrater
- Tilbered fire petriskåle (60 mm x 15 mm) pr. Kryds med 5 g 5 dage gammelt rådnet eller frisk kød (to af hver type substrat).
BEMÆRK: Tilbered petriskåle svarende til antallet af eksperimentelle replikater ønsket gange fire. I denne undersøgelse blev der anvendt 30 replikater, i alt 120 tilberedte petriskåle. - Tilsæt 1 ml fortyndet kvægblod (50% rent blod med antikoagulant og 50% filtreret vand) på det ferske kød og 1 ml filtreret vand på det rådne kød. Bland kødet grundigt (frisk eller rådnet) med væsken (blod eller vand) ved hjælp af en anden ske til hver type kød.
BEMÆRK: Tilberedningen af kødet til den kvindelige analyse ligner meget larveanalysen, selvom mængderne er forskellige, fordi huntesten kører længere end larvetesten. Husk at bruge forskellige pipettespidser og skeer til hver type kød for at undgå krydskontaminering af lugt mellem underlagene. - Kontroller, om alkoholen er helt fordampet fra krydsene. Placer derefter fire petriskåle (en af hver type kød på varmepuden og de to andre ud for varmepudens overflade) yderst på hver korsarm (figur 4). Luk krydsene med deres låg og lad underlagene varme i ca. 10 min.
BEMÆRK: For at undgå positionsforstyrrelser skal du desuden variere placeringen af de forskellige kødtyper i krydsene. For eksempel skal nogle kryds have samme type kød på tilstødende arme, mens i andre kryds skal den samme kødtype være på tværs af hinanden, som vist i figur 4.
- Tilbered fire petriskåle (60 mm x 15 mm) pr. Kryds med 5 g 5 dage gammelt rådnet eller frisk kød (to af hver type substrat).
- Kvindelig test
- Saml gravide kvinder i flyveburet og isoler dem i individuelle rør.
BEMÆRK: Gravide kvinder er kendetegnet ved at have en forstørret og hvidlig-gul mave i modsætning til ikke-gravide kvinder (figur 5). Gravide kvinder blev indsamlet mellem 10 og 16 dage efter fremkomsten til forsøgene. - Kontroller temperaturen på underlagene i krydsene (kold side: 25 ± 2 °C; varm side: 33 ± 2 °C) ved hjælp af et infrarødt termometer.
BEMÆRK: Ligesom i larvetesten forbliver varmepuden tændt under hele eksperimentets længde. Temperaturmålinger blev foretaget i begyndelsen og slutningen af eksperimentet. Selvom temperaturen svingede med ± 2 °C, var der stadig mindst 8 °C temperaturforskel mellem varme og kolde forhold. - Placer røret på hovedet, der indeholder en gravid kvinde i åbningen i midten af hvert kryds. Når kvinden kommer ind i korset, skal du fjerne røret og lukke åbningen med sit lille låg. Når du har lukket alle krydsene, skal du placere en sort pap foran på hylden for at omslutte den eksperimentelle opsætning. Lad eksperimentet køre i 4 timer.
- Derefter fjernes kvinden ved omhyggeligt at fange den med et rør og kontrollere, om der var æg på underlagene.
- Identificer låget på hver petriskål med substrattype fra hvert kryds. Brug 70% ethanol til at rense krydsene (inde i korset og låget) fra enhver lugt fra testen.
OBS: Hvis æggene ikke kan tælles lige efter forsøget, kan petriskåle med substrater opbevares ved -20 °C.
- Saml gravide kvinder i flyveburet og isoler dem i individuelle rør.
- Antal æg
BEMÆRK: Hvis underlagene i petriskålene var frosne, skal de tø dem op inden tælling.- Brug et stereomikroskop til at tælle antallet af æg, der er lagt i hvert substrat. Brug en børste og vand til at hjælpe med at adskille æggene for at tælle dem.
3. Dataanalyse og statistik
- Beregning af præferenceindeks
- For hver replikat af larvetest (n = 36) og huntest (n = 30) beregnes præferenceindekset for kød (betegnet somPI-kød) ved at bestemme forholdet mellem larver eller æg, der findes på friske substrater (frisk varm og frisk kold) til det samlede antal larver eller æg på alle substrater (frisk varm + frisk kold + rådden varm + rådden kold).
PI-kød = (# larver eller æg på friske substrater) / # Samlet antal larver eller æg
BEMÆRK: Udtrykkene "varm" og "kold" angiver temperaturforhold på henholdsvis 33 ± 2 °C og 25 ± 2 °C. - Beregn ligeledes præferenceindekset for temperatur (PI-temp) for hver replikat af larve- og huntest som antallet af larver eller æg, der er til stede på varme substrater (frisk varm og rådden varm) divideret med det samlede antal larver eller æg på alle substrater (frisk varm + frisk kold + rådden varm + rådden kold).
PItemp = (# larver eller æg på varme substrater) / # Samlet antal larver eller æg
BEMÆRK: Værdier tæt på 1 afspejler en præference for friske eller varme substrater, og værdier tæt på nul angiver en præference for rådne eller kolde substrater. PI'erne kan beregnes manuelt eller ved hjælp af den angivne kode (supplerende filer S1 og supplerende filer S2).
- For hver replikat af larvetest (n = 36) og huntest (n = 30) beregnes præferenceindekset for kød (betegnet somPI-kød) ved at bestemme forholdet mellem larver eller æg, der findes på friske substrater (frisk varm og frisk kold) til det samlede antal larver eller æg på alle substrater (frisk varm + frisk kold + rådden varm + rådden kold).
- Sammenligning af den observerede præference for simulerede tilfældige data
- Kør den angivne kode (supplerende fil S1 og supplerende fil S1) for at generere de simulerede data og sammenligne dem med de observerede data.
BEMÆRK: Denne kode genererer 1000 simulerede tilfældige datasæt for larver og hunner og beregner præferenceindekserne (PI'er) for hver replikat af den simulerede og de observerede data for L. cuprina. Simuleringerne antager, at både larver og hunner ikke udviser nogen substratpræference og træffer tilfældige valg. Simuleringerne inkorporerer vigtige adfærdsmæssige aspekter af dyrene, der omfatter forskellige scenarier såsom: sandsynligheden for, at larver ikke vælger noget substrat, og voksne hunner, der koncentrerer deres æglægning på et enkelt substrat eller fordeler deres æg enten ensartet eller ikke blandt forskellige substrater. Generaliserede lineære modeller (GLM, familie: kvasibinomial; link: logit) blev brugt til at sammenligne de observerede data fra adfærdsanalyserne med de simulerede tilfældige data. Den anvendte GLM var velegnet til denne analyse på grund af præferenceindeksets (PI) afgrænsede karakter, der ligger mellem 0 og 1. GLM'er er dygtige til at håndtere ikke-normalt distribuerede responsvariabler og giver mulighed for robuste statistiske sammenligninger. Dette valg lettede meningsfuld indsigt ved at gøre det muligt effektivt at sammenligne observerede data fra adfærdsanalyser med komplekse mønstre genereret af simulerede tilfældige data. Mindre justeringer af koden kan være nødvendige for andre strukturerede datasæt.
- Kør den angivne kode (supplerende fil S1 og supplerende fil S1) for at generere de simulerede data og sammenligne dem med de observerede data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere effektiviteten af de præsenterede metoder blev eksperimenterne udført under anvendelse af en laboratoriepopulation af Lucilia cuprina (familie: Calliphoridae), en fakultativ parasitisk blowfly2. Hele det rå datasæt, der er opnået for denne art, findes i supplerende fil S3 med resultaterne for larve- og hunsubstratpræferencetestene. For at vurdere, om larverne og hunnerne foretrækker et hvilket som helst substrat, blev de observerede data sammenlignet med 1000 simulerede datasæt, der hver repræsenterer et tilfældigt valg (se kode i supplerende fil S1). Procentdelen af statistisk signifikante sammenligninger (p < 0,05) blev brugt som et mål for vurdering af præference. Fra denne analyse var det tydeligt, at larver udviste en markant præference for det rådne substrat ved 25 °C (figur 6A, tabel 1), da alle 1000 sammenligninger mellem de observerede data og hvert af de simulerede tilfældige valgdatasæt blev fundet signifikant forskellige for kød- og temperaturforholdene. Ligeledes viste kvinder også en mærkbar præference for 25 °C: 69,7% af sammenligningerne mellem de observerede data og det tilfældige valg blev fundet signifikant forskellige (figur 6B, tabel 1). Deres præference for råddent kød var imidlertid mere nuanceret (figur 6B, tabel 1), da kun 27,1 % af de observerede sammenlignet med tilfældige valg var signifikante. En anden observation fra denne undersøgelse var, at larver af L. cuprina normalt tog et hurtigt valg og gravede sig ned i kødsubstratet inden for de første 2 minutter af eksperimentet. De skiftede sjældent til en anden tilstand i løbet af 10 minutters eksperimentet.
Figur 1: Larvefodringspræference skæremønster for petriskåle med agar. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Top-view diagram af layoutet af larvefodringspræferenceassayet. Valgene blev tilfældigt placeret, og testene blev udført ved RT (25 ± 2 °C). Det sorte rektangel repræsenterer varmepuden, som holder temperaturer på 33 ± 2 ° C. Røde og blå cirkler repræsenterer fersk kød suppleret med henholdsvis fortyndet blod (50%) og rådnet kød suppleret med vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Diagram, der illustrerer, hvordan larveforsøgsopstillingen placeres under lyskilden for at undgå forstyrrelser mod eller imod lys. Den anvendte lyskilde var hvidt lavvarmemitterende lys (neonrør). Varmepuden blev placeret på et bord lige under loftlyset. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Top-view diagram over layoutet af Female oviposition site preference assay. Valgene blev tilfældigt placeret, og testene blev udført ved RT (25 ± 2 °C). Det sorte rektangel repræsenterer varmepuden, der holder temperaturen på 33 ± 2 °C. Røde cirkler repræsenterer fersk kød med fortyndet blod (50%) og blå cirkler, rådnet kød med vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fotografi af en gravid (højre) versus en ikke-gravid (venstre) kvinde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Gennemsnitlige præferenceindekser (PI'er) for kødtype og temperatur for larver (A) og hunner (B) vist på et kartesisk plan. De sorte cirkler repræsenterer de gennemsnitlige PI'er under hensyntagen til alle eksperimentelle replikater (n = 36 for larver og n = 30 for kvindelige forsøg) opnået for L. cuprina. Hver af de grå cirkler angiver de gennemsnitlige PI'er for kød og temperatur for et simuleret datasæt med lignende karakteristika som det observerede datasæt (f.eks. samme antal replikater), men repræsenterer et tilfældigt valg. De farvede ruder tjener som et visuelt hjælpemiddel til at forestille sig PI-præferenceområderne for hvert af de fire valg med blåt, der angiver råddent kød ved 25 ± 2 °C, grønt som råddent kød ved 33 ± 2 °C, gul som fersk kød ved 25 ± 2 °C og orange som fersk kød ved 33 ± 2 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Stadie | Sammenligning | Væsentlige sammenligninger for PImeat | Væsentlige sammenligninger for PItemp |
| Larver | Simuleret vs. nulhypotese (p < 0,05) | 3.8% | 2.1% |
| Observeret vs. simuleret (p < 0,05) | 100.0% | 100.0% | |
| Kvinder | Simuleret vs. nulhypotese (p < 0,05) | 3.3% | 4.6% |
| Observeret vs. simuleret (p < 0,05) | 27.1% | 69.7% |
Tabel 1. Procentdel af signifikant PI-kød ogPI-temp (p-værdier < 0,05) af sammenligningerne mellem i) de simulerede tilfældige data (ingen præference) og den statistiske nulhypotese og ii) de observerede data og de simulerede tilfældige data. Resultaterne præsenteres separat for larver og kvinder.
Supplerende fil S1: Kode, der anvendes til dataanalyse og statistik i R-markdown. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil S2: Rapport om den statistiske analyse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil S3: Rå tællinger af Lucilia cuprina for larve- og hunpræference på hvert af de fire substratvalg. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forståelse af udviklingen af fodringsvaner, især i forbindelse med parasitisme hos blæsefluer, kræver undersøgelse af substratpræferencer gennem forskellige livsstadier for fodring eller oviposition. Derfor blev der i denne undersøgelse foreslået robuste og ligetil metoder til at undersøge substratpræferencer hos larver og hunner af blæsefluer. Disse metoder blev testet i Lucilia cuprina, en fakultativ parasitisk blowfly2. Interessant nok afslørede eksperimenterne en tydelig tilbøjelighed til råddent kød ved 25 ° C blandt L. cuprina larver, der stemmer overens med forhold, der typisk anvendes af ådselædende arter. Dette adskilte sig fra en undersøgelse af Fouche et al40, som viste en præference for frisk leversubstrat i Lucilia sericata og Calliphora vicina og viste, at det rådne substrat negativt påvirkede overlevelse og vækst. Det er imidlertid vanskeligt at sammenligne resultaterne af begge undersøgelser, da graden af kødforfald (syv dage mod fem i vores tilfælde) og nedbrydningsprocessen (rent anaerob versus aerob og anaerob i vores tilfælde) var forskellige. De anvendte arter var også forskellige. Derudover viste observationer fra eksperimenterne, der præsenteres her, at hunnerne foretrak at lægge deres æg ved 25 °C, mens de kun udviste en lille præference for råddent kød. Disse resultater viser, at larver og kvindelige valg ikke er de samme, og at hunnerne viser et mere varieret valg for deres valg af æglægningssted end larverne til gravning og fødevalg. Dette tyder på, at den parasitære vane i L. cuprina ledes af ændringer i det kvindelige ovipositionsvalg og ikke af larvefodringspræference. Disse resultater tjener især som en proof-of-concept-demonstration af effektiviteten og anvendeligheden af metoderne til belysning af blæsefluers livsstil på forskellige udviklingsstadier.
Forskellige kød- og temperaturforhold blev brugt til at efterligne parasitære og ådselædende livsstilsfaktorer. Denne tilgang lettede evalueringen af larvefodring og kvindelige ovipositionsstedpræferencer i et firevalgsassay ved hjælp af to interagerende faktorer. De vedtagne protokoller repræsenterer en tilgang, der afviger fra den traditionelle tovalgsteknik, der typisk blev anvendt i tidligere undersøgelser 43,44,45,46,47,48,49,50. For at minimere variationer som følge af miljømæssige faktorer, der kan påvirke adfærd, såsom lys, visuelle eller lugtsignaler, blev der implementeret strenge kontrolforanstaltninger. Ensartet og konsistent belysning ovenfra blev opretholdt i analyserne for at undgå enhver bias mod eller imod lys, suppleret med brugen af en sort baggrund for at forhindre potentielle visuelle tegns indvirkning på larve og kvindelige præferencer. Desuden blev risikoen for krydskontaminering mellem rådne og ferske kødsubstrater undgået ved at anvende glas eller engangsplastmateriale, handsker og separate redskaber. Anvendelsen af disse foranstaltninger viste sig at være afgørende for etableringen af en kontrolleret og pålidelig forsøgsramme og dermed sikre robustheden og pålideligheden af de opnåede resultater.
Larveeksperimentets design lignede tidligere beskrevne tovalgsanalyser40,42, med tilpasninger foretaget for at inkorporere temperaturfaktoren. Larveprotokollen, der er beskrevet her, viste sig at være hurtig, robust og ligetil, da larverne udviste en stærk tendens til at forblive gravet ned i deres valgte substrat, hvilket eliminerede muligheden for tvetydige scoringsproblemer som følge af skift af substrater i slutningen af eksperimentet. Denne særlige funktion gør det muligt for eksperimentatoren at udføre seks eller flere replikater samtidigt uden risiko for uklare eller usikre resultater. Selvom tilstedeværelsen af flere larver inden for samme replikat kan påvirke individuelle valg, giver protokollen mulighed for vurdering af generel substratpræference gennem uafhængige replikater. I scenarier, hvor mulig aggregerende adfærd skal undgås eller kontrolleres, kan individuel test eller inkorporering af kontroleksperimenter for at tage højde for potentielle påvirkninger mellem larver implementeres for at modvirke enhver bias.
På den anden side tilbyder den kvindelige oviposition site preference protokol den bemærkelsesværdige fordel at vurdere det individuelle valg uafhængigt, fri for indflydelse fra andre kvinders præferencer, og dermed undgå aggregerende adfærd. Faktisk er det kendt, at kalliphorid kvindelig ovipositionsvalg kan påvirkes af tilstedeværelsen af konspecifikke fluer46,47. Ikke desto mindre er det vigtigt at erkende den iboende begrænsning af det eksperimentelle assay. Æg må ikke lægges inden for 4-timers forsøgsvinduet på grund af uegnede forhold eller mere sandsynligt hunnernes umodenhed. Denne usikkerhed resulterer i en delmængde af replikaterne uden æg lagt (78% af forsøgene). Desuden introducerer den brede vifte i antallet af æg, der lægges i hver replikat (26 til 208, gennemsnit ± standardafvigelse = 132,4 ± 46,2) betydelig variation, hvilket gør det vanskeligt at skelne mellem variationer drevet af hunnens præference og dem, der påvirkes af faktorer som begrænsede ægreserver eller sen æglægning under eksperimentet. På trods af disse begrænsninger er de foreslåede protokoller egnede til effektivt at vurdere præferencen for ovipositionssteder.
Samlet set har de udviklede protokoller et betydeligt potentiale for en bred vifte af applikationer til at studere blowfly-adfærd. For det første kan disse tests anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige behandlinger, såsom forskellige opdræts- eller udviklingsforhold, på larve- eller hunpræferencer inden for samme art. Dette kan potentielt afsløre de underliggende mekanismer, der driver adfærdsmæssige præferencer og deres genetiske grundlag, især når de kombineres med sekventeringsteknikker. Desuden kan disse tests udvides til at undersøge substratpræferencerne hos forskellige blowfly-arter, hvilket giver værdifuld indsigt i udviklingen af parasitisme inden for denne gruppe. Ved at dykke ned i de forskellige præferencer, som blæsefluer udviser, kan der opnås en dybere forståelse af deres økologiske tilpasninger, hvilket giver værdifuld viden til fremtidig forvaltning og bekæmpelse af skadedyrsarter.
Endelig strækker protokollernes potentiale sig ud over studiet af blæsefluer alene. Med mindre ændringer kan disse protokoller let anvendes til at vurdere fluearter fra andre familier, såsom stuefluer og kødfluer eller endda insekter af samme størrelse. Protokollernes tilpasningsevne gør det også muligt at vælge forskellige substrater, der svarer til målene for specifikke videnskabelige undersøgelser. For eksempel kan forskere ændre graden af kødforfald eller erstatte oksekød med alternative animalske kilder (f.eks. Fisk, svinekød) eller ikke-animalske substrater (f.eks. Frugt) for at løse forskellige økologiske spørgsmål. Disse tilpasninger forbedrer ikke kun protokollernes alsidighed, men muliggør også udforskning af præferencer i en bred vifte af insektarter og økologiske sammenhænge og forbedrer derved kapaciteten til at belyse grundlæggende aspekter af insektadfærd og økologisk tilpasning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen erklæret.
Acknowledgments
Vi anerkender Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim og Lucas de Almeida Carvalho for at levere L. cuprina-kolonien og for deres hjælp til at oprette eksperimentet. Vi vil også gerne takke Rafael Barros de Oliveira for at filme og redigere videoen. Denne forskning blev støttet af Developing Nation Research Grant fra Animal Behavior Society til V.A.S.C. og af et FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo-tilskud til T.T.T. (20/05636-4). ST og D.L.F. blev støttet af en FAPESP (henholdsvis 19/07285-7 postdoc-stipendium og 21/10022-8 ph.d.-stipendium). V.A.S.C. og A.V.R. blev støttet af CNPq ph.d.-stipendier (henholdsvis 141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. blev støttet af CNPq (310906/2022-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
| Black cardboards | - | - | 70x50 cm |
| Bovine blood with anticoagulat | - | - | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
| Bovine ground Meat | - | - | Around 7-8% of fat |
| Brush | - | - | Made with plastic |
| Conical tube | Falcon or Generic | - | 50 mL |
| Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
| Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
| 70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
| Graduated cylinder | Nalgon or Generic | - | 500 mL and 50 mL |
| Heating pad | Thermolux | - | 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
| Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
| Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150x20 mm dimensions |
| (Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
| Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60x15 mm dimensions |
| Plastic Pasteur pipette | - | - | 3 mL (total volume) |
| Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
| Spoons | - | - | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
| Stainless steel spatula | Generic | - | Flat end and spoon end |
| Stereomicroscope | Bioptika | - | WF10X/22 lenses |
| Tweezer | - | - | Metal made and fine point |
| White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |
References
- Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
- Zumpt, F. Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , Butterworths. London. (1965).
- Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
- Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
- Mullen, G. R., Durden, L. A. Medical and veterinary entomology. , Academic press. (2009).
- Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
- World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , Paris. (2013).
- Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45 (2018).
- Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30 (2016).
- Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551 (2020).
- Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
- Greenberg, B.
- Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
- Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
- McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
- Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
- Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230 (2021).
- Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
- Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598 (2016).
- Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
- Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
- Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
- Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
- Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
- Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
- Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
- Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
- Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
- Smith, K. G. V. A manual of forensic entomology. , Cornell University Press. UK. (1986).
- Goff, M. L. A Fly for the Prosecution. , Harvard University Press. Cambridge, MA and London, England. (2001).
- CRC Press. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , CRC Press. Boca Raton. (2001).
- Greenberg, B., Kunich, J. C. Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
- Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
- Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
- Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
- Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
- Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
- Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791 (2021).
- Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
- Boulay, J., Deneubourg, J. -L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676 (2016).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
- Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
- Yang, S. -T., Shiao, S. -F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
- Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
- Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
- Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420 (2017).
- Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).
