يؤكد التحقيق الأولي أن النزف تحت العنكبوتية (SAH) يسبب زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. يتطلب تقييم انقباض الخلايا المحيطة بعد SAH التمييز بين خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة. ومن ثم ، تم تطوير إجراء لتسمية pericytes الدماغ قابلة للحياة وغير قابلة للحياة في وقت واحد في أقسام الدماغ ، مما يسهل الملاحظة باستخدام مجهر متحد البؤر عالي الدقة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ بعد النزف تحت العنكبوتية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا المحيطة هي خلايا جدارية حاسمة تقع داخل دوران الأوعية الدقيقة الدماغية ، وهي محورية في تعديل تدفق الدم الدماغي بنشاط عن طريق تعديلات الانقباض. تقليديا ، يتم قياس انقباضها من خلال مراقبة التحولات المورفولوجية وتغيرات قطر الشعيرات الدموية القريبة في ظل ظروف محددة. ومع ذلك ، فإن تثبيت ما بعد الأنسجة ، وتقييم الحيوية وما يترتب على ذلك من انقباض pericyte للخلايا المحيطة بالدماغ المصورة يصبح معرضا للخطر. وبالمثل ، فإن وضع العلامات الوراثية على الخلايا المحيطة بالدماغ يقصر في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، لا سيما في الحالات العصبية مثل النزف تحت العنكبوتية (SAH) ، حيث يتحقق تحقيقنا الأولي من صحة زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. تم وضع بروتوكول موثوق للتغلب على هذه القيود ، مما يتيح وضع علامات الفلورسنت في وقت واحد لكل من pericytes الدماغ الوظيفية وغير الوظيفية في أقسام الدماغ. تسمح طريقة وضع العلامات هذه بتصور مجهر متحد البؤر عالي الدقة ، مع وضع علامة متزامنة على الأوعية الدموية الدقيقة لشريحة الدماغ. يوفر هذا البروتوكول المبتكر وسيلة لتقييم انقباض pericyte في الدماغ ، وتأثيره على قطر الشعيرات الدموية ، وهيكل pericyte. إن التحقيق في انقباض الخلايا المحيطة بالدماغ في سياق SAH يعطي فهما ثاقبا لآثاره على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية.
المقدمة
تحيط الخلايا المحيطة بالدماغ ، التي تتميز بنتوءاتها النحيلة وأجسام الخلايا البارزة ، دوران الأوعية الدقيقة 1,2. في حين أن زيادة تدفق الدم الدماغي مدفوعة في الغالب بتمدد الشعيرات الدموية ، فإن الشرايين الأصغر تظهر معدلات تمدد أبطأ3. يمارس انقباض Pericyte تأثيرا على قطر الشعيرات الدموية ومورفولوجيا pericyte ، مما يؤثر على ديناميكيات الأوعية الدموية4. يؤدي تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ إلى انقباض الشعيرات الدموية ، وفي السيناريوهات المرضية ، قد يعيق الانكماش المفرط تدفق كرات الدم الحمراء5. يمكن لعوامل مختلفة ، بما في ذلك النورإبينفرين المنطلق ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات واستخدام بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). تم استخدام فئران Sprague-Dawley (SD) من كلا الجنسين ، 300-350 جم ، في هذه الدراسة.
1. تحفيز نموذج SAH
- تخدير الفئران باستخدام 2٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين. الحفاظ على التخدير عن طريق توفير التخدير المستمر بالاستنشاق مع الأيزوفلوران (1٪ -3٪). تأمين رأس الجرذ باستخدام جهاز تجسيمي (انظر جدول المواد).
- قم بإنشاء نموذج SAH باتباع الخطوات أدناه.
- أدخل إبرة الحقن المجهري في الصهريج فوق السيلار. بعد ذلك ، قم بحقن الدم الذاتي من شريان ذيل الفئران (بدون مضادات التخثر) في الخزان فوق السيلار ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في ظل الظروف الفسيولوجية الطبيعية ، لا تخضع خلايا الدماغ عموما لموت الخلايا. يوضح الشكل 6 هذه الظاهرة ، حيث يشير اللون الأصفر إلى وجود خلايا محيطية حيوية في الدماغ. لا تظهر الخلايا المحيطة بالدماغ أي تلطيخ مع PI ، مما يشير إلى صلاحيتها. لمزيد من التحقيق فيما إذا كانت الخلايا المحيطة تظل مرتبطة بالأوعية الدموية الدقيقة بعد موت الخلية ، تم استخدام طرق في نموذج الفئران SAH ، وتم إجراء التصوير اللاحق.
تم تطوير طرق لتصوير كل من خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطوير تقنيات تصوير متحدة البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ الحيوية ، وخلايا الدماغ غير الحيوية ، والأوعية الدموية الدقيقة في شرائح الدماغ. في شرائح دماغ الفئران الحادة ، تستلزم العملية وضع العلامات الأولية على الخلايا المحيطة ب TO-PRO-311 ، تليها الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة مع IB412. في وقت لاحق ، يتم تحديد pericytes المتوفى باستخدام PI. هذا البروتوكول واضح ومباشر وقابل للتكرار وقابل للتطبيق بدرجة كبيرة على البحث الوظيفي.
لتتبع الخلاي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81960226,81760223); مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة يوننان (202001AS070045،202301AY070001-011)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 6 آبار لوحة | ABC الكيمياء الحيوية | ABC703006 | RT |
| أدوبي فوتوشوب | أدوبي | المصور CS6 16.0.0 | RT |
| رقائق الألومنيوم | MIAOJIE | 225 مم × 273 مم | RT |
| CaCl 2< sub> middot ؛ 2H2< / sub>O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| برنامج التصوير متحد البؤر | نيكون | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | نيكون | N-SIM / C2si | RT |
| خزان الغاز (5٪ CO2< / sub> ، 95٪ O2< / sub>) | PENGYIDA | 40L | RT |
| أطباق زجاجية متحدة البؤر | Beyotime | FCFC020-10 قطع | RT |
| الجلوكوز | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| الغراء | EVOBOND | KH-502 | RT |
| آلة صنع الثلج | XUEKE | IMS-20 | RT |
| برنامج تحليل الصور | المعاهد الوطنية للصحة | صورة J | RT |
| التخدير بالاستنشاق | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4- FITC | SIGMA | L2895 &ndash ؛ 2MG | متجر aliquots في – 20 درجة ؛ C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447 &ndash ؛ 40 & ndash ؛ 7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647 & ndash; 14 – 5 | RT |
| NaH2PO4· H2< / sub>O | Sigma-Aldrich | 10049 – 21 – 5 | RT |
| NaHCO3< / sub> | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| ماصة باستور | NEST التكنولوجيا الحيوية | 318314 | RT |
| المضخة التمعجية | Scientific Industries Inc | نموذج 203 | RT |
| بروبيديوم (اليود) Med | Chem Express | HY-D0815 / CS-7538 | تخزين aliquots في &ndash ؛ 20 درجة ؛ C |
| جهاز التجسيم | SCIENCE | QA | RT |
| مضخة حقنة | هارفارد | مضخة مضخة 11 ELITE Nanomite | RT |
| حمام مائي ترموستاتي | OLABO | HH-2 | RT |
| يهتز ميكروتوم | Leica | VT1200 | RT |
المراجع
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
