Summary
L’enquête préliminaire confirme que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) provoque la mort du péricyte cérébral. L’évaluation de la contractilité des péricytes après l’HSA nécessite de différencier les péricytes cérébraux viables et non viables. Par conséquent, une procédure a été mise au point pour marquer simultanément les péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes cérébrales, facilitant ainsi l’observation à l’aide d’un microscope confocal à haute résolution.
Abstract
Les péricytes sont des cellules murales cruciales situées dans la microcirculation cérébrale, essentielles à la modulation active du flux sanguin cérébral via des ajustements de la contractilité. Classiquement, leur contractilité est mesurée en observant les changements morphologiques et les changements de diamètre capillaire à proximité dans des circonstances spécifiques. Pourtant, la fixation post-tissulaire, l’évaluation de la vitalité et la contractilité péricytaire qui en résulte des péricytes cérébraux imagés sont compromises. De même, le marquage génétique des péricytes cérébraux ne permet pas de distinguer les péricytes viables des péricytes non viables, en particulier dans les affections neurologiques telles que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA), où notre enquête préliminaire valide la mort des péricytes cérébraux. Un protocole fiable a été mis au point pour surmonter ces contraintes, permettant le marquage simultané par fluorescence des péricytes cérébraux fonctionnels et non fonctionnels dans les coupes cérébrales. Cette méthode de marquage permet une visualisation au microscope confocal à haute résolution, marquant simultanément la microvascularisation de la tranche de cerveau. Ce protocole innovant permet d’évaluer la contractilité des péricytes cérébraux, son impact sur le diamètre capillaire et la structure des péricytes. L’étude de la contractilité des péricytes cérébraux dans le contexte de l’HSA permet de mieux comprendre ses effets sur la microcirculation cérébrale.
Introduction
Les péricytes cérébraux, qui se distinguent par leurs protubérances minces et leurs corps cellulaires saillants, entourent la microcirculation 1,2. Alors que l’augmentation du flux sanguin cérébral est principalement entraînée par la dilatation capillaire, les artères plus petites présentent des taux de dilatation plus lents3. La contractilité des péricytes exerce une influence sur le diamètre capillaire et la morphologie des péricytes, ce qui a un impact sur la dynamique vasculaire4. La contraction des péricytes cérébraux entraîne une constriction capillaire et, dans les scénarios pathologiques, une contraction excessive peut entraver l’écoulement des érythrocytes5. Divers facteurs, y compris la noradrénaline libérée par le locus coeruleus, peuvent induire une contraction du péricyte cérébral dans les capillaires6. Jouant un rôle régulateur dans le flux sanguin cérébral, les péricytes présentent une synthèse de 20-HETE, servant de capteur d’oxygène pendant l’hyperoxie7. La contraction des péricytes cérébraux déclenchée par le stress oxydatif-nitritif affecte négativement les capillaires5. Malgré des études in vivo et ex vivo sur la contraction des péricytes cérébraux8, les connaissances persistent concernant l’imagerie des péricytes cérébraux viables et non viables dans les coupes de cerveau.
De manière cruciale, l’imagerie post-fixation tissulaire des péricytes cérébraux compromet leur vitalité et l’évaluation ultérieure de la contractilité. De plus, dans des scénarios tels que les troubles neurologiques (par exemple, l’hémorragie sous-arachnoïdienne - SAH), le marquage transgénique des péricytes cérébraux ne parvient pas à différencier les péricytes viables et non viables, comme le confirme notre étude préliminaire sur la mort des péricytes cérébraux induite par la SAH9.
Pour surmonter ces défis, nous avons utilisé TO-PRO-3 pour marquer les péricytes vivants, tandis que les péricytes décédés ont été colorés avec de l’iodure de propidium (IP). Nous avons utilisé des technologies d’imagerie confocale à haute résolution pour visualiser les péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes de cerveau tout en préservant l’activité des tranches pendant l’imagerie. Cet article vise à présenter une méthode reproductible d’imagerie des péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes de cerveau, servant d’outil précieux pour sonder l’impact des péricytes cérébraux sur la microcirculation cérébrale après l’HSA.
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Protocol
Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité d’éthique et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Kunming (kmmu20220945). Des rats Sprague-Dawley (SD) des deux sexes, de 300 à 350 g, ont été utilisés pour la présente étude.
1. Induire le modèle SAH
- Anesthésier les rats avec 2 % d’isoflurane et 100 % d’oxygène. Maintenir l’anesthésie en fournissant de l’isoflurane (1 % à 3 %) à une anesthésie par inhalation continue. Fixez la tête du rat à l’aide d’un appareil stéréotaxique (voir le tableau des matériaux).
- Créez le modèle SAH en suivant les étapes ci-dessous.
- Insérez une aiguille de micro-injection dans la citerne suprasellaire. Ensuite, injecter du sang autologue de l’artère caudale du rat (sans anticoagulant) dans la citerne suprasellaire à l’aide d’un pousse-seringue (voir le tableau des matériaux).
- Implanter une aiguille de micro-injection dans le ventricule cérébral latéral droit en utilisant les coordonnées mentionnées : bregma, −0,8 mm ; latérale, 1,4 mm ; profondeur, 4 mm9. Pour les groupes d’HSA, injecter 0,2 mL de sang de l’artère de la queue de rat. Pour les groupes fictifs, administrer le même volume de solution saline isotonique (Figure 1A).
2. Préparation et stabilisation des tranches de cerveau
- Anesthésier profondément les rats en inhalant de l’isoflurane à 2 %. Après la décapitation, extrayez le cerveau entier et plongez-le dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) glacé.
REMARQUE : Utilisez des solutions d’ACSF fraîchement préparées avec la composition suivante : 134 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 29 mM de NaHCO3, 1,1 mM de NaH 2 PO 4, 1,5 mM de MgSO4, 2,5 mM de CaCl2et 10,11 mM de D-Glucose (voir le tableau des matériaux). Maintenez un pH entre 7,3 et 7,4. - À l’aide d’un vibratome (voir le tableau des matériaux), préparer des tranches de cerveau aiguës d’une épaisseur de 200 μm provenant de rats SD dans de l’ACSF glacé aéré avec 5 % de CO 2 et 95 % d’O 2 (Figure 2).
- Placez les tranches de cerveau aiguë de 200 μm d’épaisseur dans une chambre de stockage sur un treillis en nylon immergé dans de l’ACSF. Équilibrer la solution ACSF avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2, en maintenant une plage de température de 35 à 37 °C. Laissez les tranches de cerveau se stabiliser pendant 2 h, ce qui leur donne le temps de s’ajuster (Figure 3).
3. Marquage des péricytes dans les coupes de cerveau aiguë avec TO-PRO-3
REMARQUE : Les péricytes des coupes de cerveau aiguë ont été marqués par fluorescence à l’aide du traceur TO-PRO-310.
- Ajouter le colorant fluorescent TO-PRO-3 à l’ACSF, jusqu’à obtenir une concentration finale de 1 μM. Incuber les tranches de cerveau aiguës à température ambiante dans un environnement sombre avec l’ACSF contenant du TO-PRO-3 pendant 20 min.
REMARQUE : N’oubliez pas de porter des gants en latex lorsque vous manipulez TO-PRO-3 pour vous protéger. - Transférez la crépine en maille de nylon, transportant les tranches de cerveau, de la chambre de chargement à une chambre de rinçage de la plaque à 6 puits (voir le tableau des matériaux). Laissez les tranches de cerveau rester dans la chambre de rinçage pendant 10 minutes (Figure 4D).
REMARQUE : Cette étape de rinçage met fin au processus de coloration, diminue l’étiquetage de fond et empêche les taches non spécifiques. - Rincez les préparations pendant un total de 15 min avec une solution ACSF équilibrée avec un mélange de 5 % de CO 2 et 95 % d’O2. Cette étape de rinçage permet d’arrêter l’absorption du colorant et de minimiser l’étiquetage de fond (figure 4C).
4. Coloration des péricytes non vitaux de la microcirculation cérébrale dans les coupes cérébrales aiguës
- Incuber des tranches de cerveau préchargées avec TO-PRO-3 à 37 °C avec de l’isolectine B4 conjuguée à Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4 ; 5 μg/mL, voir le tableau des matériaux) pendant 30 min dans un environnement sombre. Après l’incubation, rincez les tranches de cerveau pendant 15 minutes dans de l’ACSF (Figure 4E).
- Incuber les tranches de cerveau dans de l’ACSF gazé avec 5 % de CO 2 et 95 % d’O2 comme d’habitude. Ajouter de l’iodure de propidium (IP) à une concentration de 37 μM aux deux solutions à 37 °C. Cela permettra d’étiqueter les péricytes cérébraux non vitaux. Incuber les préparations dans cette solution ACSF pendant 60 min dans l’obscurité (Figure 4F).
- Ensuite, rincez les préparations pendant 15 minutes avec des solutions ACSF pour arrêter l’absorption du colorant et minimiser l’étiquetage de fond.
5. Imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans des coupes cérébrales aiguës
- Transférer délicatement les tranches de cerveau dans des boîtes confocaux à fond en verre (voir le tableau des matériaux) à l’aide de pipettes Pasteur en plastique. Remplissez les plats avec une solution d’ACSF préalablement équilibrée avec 5 % de CO 2 et 95 % d’O2. Utilisez un treillis de fer pour fixer les tranches de cerveau de rat en place.
- Transférez les boîtes confocaux à fond de verre sur la platine d’un microscope confocal. Positionner la tranche aiguë de cerveau au fond de la boîte et la perfuser9 avec une solution d’ACSF équilibrée avec un mélange de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2 lors de l’imagerie par microscopie confocale (Figure 5A et Figure 5Ab').
- Visualisez les cellules de la paroi de la microvascularisation corticale cérébrale à l’aide d’un objectif 40x. Capturez des piles d’images à l’aide d’un logiciel compatible (voir la table des matériaux). Utiliser des filtres appropriés pour IB4 (excitation/émission 460 nm/520 nm), PI (excitation/émission 545 nm/595 nm) et TO-PRO-3 (excitation/émission 606 nm/666 nm) (Figure 5D).
REMARQUE : Capturez des images avec les détails suivants : objectif DIC N1 40×, 3 × 12 bits : 512 × 512 pixels (0,22 × 0,22 mm), étalonnage : 0,42 μm/px. - Identifier la microvascularisation cérébrale et les péricytes en fonction de leur réseau et de leur morphologie. Localisez une région spécifique contenant un réseau de microvascularisation cérébrale sur chaque tranche de cerveau et capturez des images.
- Notez soigneusement l’emplacement de l’imagerie pour assurer la cohérence des captures subséquentes (Figure 5B, C). Pour un traitement et une analyse ultérieurs, utilisez un logiciel d’analyse d’images (ImageJ) et un logiciel de retouche photo (voir la table des matériaux).
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Representative Results
Dans des conditions physiologiques normales, les péricytes cérébraux ne subissent généralement pas de mort cellulaire. La figure 6 illustre ce phénomène, le jaune indiquant la présence de péricytes cérébraux vitaux ; Les péricytes cérébraux ne présentent aucune coloration par IP, ce qui indique leur viabilité. Pour étudier plus en détail si les péricytes restent attachés à la microvascularisation après la mort cellulaire, des méthodes ont été employées dans un modèle de rat SAH, et une imagerie ultérieure a été effectuée.
Des méthodes d’imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans des coupes de cerveau après HSA ont été développées. Comme le montre la figure 7, les péricytes cérébraux vitaux (flèches bleues) sont situés dans la microvascularisation, tandis que les péricytes cérébraux non vitaux sont représentés par des flèches blanches. Cette visualisation simultanée permet d’identifier les péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans les tranches de cerveau. De plus, il a été observé que les péricytes cérébraux non vitaux marqués par IP restaient attachés à l’ensemble de la microvascularisation.
Figure 1 : Modèle de HSA. (A) La tête du rat était solidement fixée à l’appareil stéréotaxique pour assurer sa stabilité. Le modèle SAH a été induit en insérant soigneusement une aiguille stéréotaxique dans la citerne suprasellaire. (B,C) Dans le modèle SAH, le sang pénètre dans l’espace sous-arachnoïdien à l’intérieur du crâne, affectant le cerveau. Les hémisphères cérébraux se remplissent de sang environ 24 h après l’HSA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation aiguë d’une tranche de cerveau entier. (A) La chambre inférieure a été enduite de colle d’agarose pour la fixation. (B) La colle a été méticuleusement appliquée sur la chambre inférieure pour adhérer fermement au cerveau. (C) Le réservoir environnant a été rempli d’ACSF glacé pour maintenir la température. (D) L’épaisseur de section souhaitée a été soigneusement définie. (E,F). Les tranches de cerveau ont été méticuleusement transférées sur une plaque à 6 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Transfert des pipettes et chargement du colorant dans une plaque à 6 puits. (A) Des coupes de cerveau aiguë ont été transférées à l’aide de pipettes Pasteur en plastique (3 mL). La longueur de la pipette utilisée en (a) était de 18,2 cm. Pour les points b) et c), la pointe fine de la pipette Pasteur en plastique a été soigneusement taillée afin d’éviter tout dommage potentiel aux tranches de cerveau pendant le transfert. Les plaques à 6 puits ont été efficacement transférées de (B) à (C) pour la coloration par fluorescence dans un bain-marie à 37 °C. (B) L’un des puits de la plaque à 6 puits accueillait une petite crépine en treillis de nylon, avec un tube fin positionné pour l’acheminement du gaz. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Incubation de coupes de cerveau aiguës. Une procédure systématique a été méticuleusement suivie pour marquer les péricytes avec TO-PRO-3 dans les coupes de cerveau aiguës. (A) Initialement, un puits d’une plaque à six puits (12 × 8 cm) a été rempli de 10 mL d’ACSF, assurant une bonne aération en faisant bouillonner la solution à l’aide d’un tube fin relié à un mélange de 95 % d’O 2 et de 5 % de CO2. (B) Par la suite, les tranches de cerveau ont été méticuleusement transférées sur la plaque à six puits. (C) 10 μL de la solution mère TO-PRO-3 ont été introduits dans la chambre de chargement du colorant, en agitant doucement pour faciliter la dissolution du colorant (D). (E,F) Pour mieux caractériser les coupes de cerveau, une coloration avec IB4 (1 μM dans l’ACSF) et PI (1 μM dans l’ACSF) a été effectuée. Ces étapes séquentielles ont permis de marquer avec succès les péricytes avec TO-PRO-3 dans des coupes cérébrales aiguës, facilitant ainsi l’analyse et l’examen ultérieurs des péricytes cérébraux marqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans des coupes de cerveau. (A) La solution est équilibrée avec un mélange de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2 délivré par le tube. (B-E) Configuration pour l’imagerie haute résolution de cellules endothéliales marquées TO-PRO-3, IB4 et marquées PI dans des coupes cérébrales aiguës. (E) Microscopie confocale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Image des péricytes cérébraux vitaux dans des coupes de cerveau. (A) La microvascularisation cérébrale a été marquée avec IB4 (vert). (B) Les cellules non vitales ont été marquées avec PI. (C) Les péricytes vitaux ont été marqués avec TO-PRO-3 (jaune). (D) L’image fusionnée s’affiche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Image représentative des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans une coupe de cerveau après HSA. (A) La microvascularisation cérébrale a été marquée avec IB4 (vert). (B) Les cellules non vitales ont été marquées avec PI (rouge). (C) Les péricytes vitaux ont été marqués avec TO-PRO-3 (jaune). (D) L’image fusionnée s’affiche. Les flèches bleues indiquent des exemples de péricytes cérébraux vitaux, tandis que les flèches blanches indiquent des exemples de péricytes cérébraux non vitaux. Notamment, les noyaux des péricytes ne dépassent pas la surface microvasculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Corrélation positive entre le nombre de péricytes non vitaux et le temps après l’HSA. L’imagerie confocale à haute résolution a été utilisée pour capturer les péricytes cérébraux à différents moments après l’HSA. La mort cellulaire notable des péricytes cérébraux a commencé 6 h après l’HSA, comme indiqué par les flèches blanches en (A). Par la suite, il y a eu une augmentation substantielle de la mortalité péricytaire à partir de 6 h. Le nombre de péricytes non vitaux a montré une corrélation positive avec le temps écoulé après l’HSA, comme illustré en (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des techniques d’imagerie confocale à haute résolution ont été mises au point pour visualiser les péricytes cérébraux vitaux, les péricytes cérébraux non vitaux et la microvascularisation dans les coupes de cerveau. Dans les coupes aiguës de cerveau de rat, le processus implique un marquage initial des péricytes avec TO-PRO-311, suivi des cellules endothéliales microvasculaires avec IB412 ; par la suite, l’identification des péricytes décédés est effectuée à l’aide de l’IP. Ce protocole est simple, reproductible et hautement applicable à la recherche fonctionnelle.
Pour tracer spécifiquement les péricytes cérébraux dans le système nerveux, le fluorophore rouge lointain TO-PRO-3 est utilisé. Alors que TO-PRO-3 colore principalement les noyaux des tissus fixés13, il s’incorpore sélectivement dans les péricytes vivants ex vivo lorsqu’il est appliqué dans une solution saline physiologique14. Des études antérieures ont confirmé l’identification sans équivoque des péricytes cérébraux murins à l’aide de TO-PRO-315. Ce fluorophore marque efficacement les péricytes vitauxdu cerveau 11. En revanche, le PI, un fluorochrome chargé couramment utilisé pour l’évaluation de la viabilité cellulaire en temps réel12, sert de marqueur pour la détérioration des cellules lorsqu’il est appliqué avant la fixation (coloration PI avant fixation)16. Cependant, étant donné que les caractéristiques morphologiques des péricytes, en particulier de leurs noyaux, ne s’étendent pas au-delà de la surface microvasculaire, il peut être difficile de faire la distinction entre les noyaux endothéliaux et péricytaires à l’aide de la coloration PI, comme l’indique la flèche blanche de la figure 8A. Des études impliquant la microscopie électronique pour la reconstruction tridimensionnelle de la région CA1 de l’hippocampe du rat ont suggéré qu’environ un tiers de l’endothélium est recouvert par les somas et les processus des péricytes17.
Sur la figure 6, des péricytes cérébraux marqués avec TO-PRO-3 sont observés dans la microvascularisation. Les images confocales de la microvascularisation cérébrale marquées avec IB4 et PI révèlent que seules quelques cellules subissent une mort cellulaire pendant le processus de section, comme en témoigne l’absence de cellules mortes PI-positives dans la figure 6. Par conséquent, le modèle SAH est utilisé pour étudier la présence de péricytes non vitaux. La figure 7 montre que, dans les coupes de cerveau, la mort cellulaire est plus importante dans les péricytes que dans les cellules endothéliales. De plus, dans la figure 8A, une augmentation significative de la mortalité péricytaire est observée à partir de 6 h après l’HSA. La figure 8B montre une corrélation positive entre le nombre de péricytes non vitaux et le temps écoulé après l’HSA. Néanmoins, une étude complète d’imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux n’a pas été documentée au mieux des connaissances actuelles.
À l’heure actuelle, on ne sait toujours pas avec certitude si les péricytes d’autres espèces ou systèmes (p. ex., cœur, intestin grêle) manifestent également des états vitaux et non vitaux dans les tranches aiguës après une HSA. En conclusion, le protocole fourni offre une approche reproductible pour l’imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans des coupes de cerveau post-HSA. En raison de sa simplicité et de sa fiabilité, cette technique peut être utilisée pour dévoiler la diversité fonctionnelle et structurelle des péricytes dans des coupes de cerveau et faciliter des investigations cellulaires détaillées dans divers modèles de maladies liés à la physiopathologie des péricytes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
L’étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81960226,81760223) ; la Fondation des sciences naturelles de la province du Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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