Summary
初步调查证实，蛛网膜下腔出血 （SAH） 会导致脑周细胞死亡。评估 SAH 后周细胞收缩力需要区分活的和无活的脑周细胞。因此，已经开发了一种在脑切片中同时标记活和无活脑周细胞的程序，便于使用高分辨率共聚焦显微镜进行观察。
Abstract
周细胞是位于大脑微循环内的关键壁细胞，在通过收缩力调节主动调节脑血流方面发挥着关键作用。传统上，它们的收缩力是通过观察特定情况下的形态变化和附近的毛细管直径变化来衡量的。然而，组织固定后、评估活力和随之而来的成像脑周周细胞的周细胞收缩力会受到影响。同样，对脑周细胞进行基因标记在区分活细胞和非活周细胞方面存在不足，特别是在蛛网膜下腔出血（SAH）等神经系统疾病中，我们的初步研究证实了脑周细胞的死亡。已经设计了一种可靠的方案来克服这些限制，能够在脑切片中同时对功能性和非功能性脑周细胞进行荧光标记。这种标记方法允许高分辨率共聚焦显微镜可视化，同时标记脑切片微血管系统。这种创新方案提供了一种评估脑周细胞收缩性、其对毛细血管直径和周细胞结构的影响的方法。在 SAH 背景下研究脑周细胞收缩力可以深入了解其对脑微循环的影响。
Introduction
脑周细胞以其细长的突起和突出的细胞体为特征，环绕着微循环 1,2。虽然脑血流增加主要由毛细血管扩张驱动，但较小的动脉表现出较慢的扩张速度3。周细胞收缩力对毛细血管直径和周细胞形态产生影响，影响血管动力学4.脑周细胞的收缩导致毛细血管收缩，在病理情况下，过度收缩可能会阻碍红细胞流动5.多种因素，包括从蓝斑释放的去甲肾上腺素，可诱导毛细血管内的脑周细胞收缩6.周细胞在脑血流中起调节作用，表现出 20-HETE 合成，在高氧期间充当氧传感器7。氧化-硝化应激引发的脑周细胞收缩对毛细血管产生不利影响5.尽管对脑周细胞收缩进行了体内和体外研究8，但关于脑切片中活和非活脑周细胞成像的知识仍然有限。
至关重要的是，脑周细胞的组织固定后成像会影响其活力和随后的收缩性评估。此外，在神经系统疾病（例如蛛网膜下腔出血 - SAH）等情况下，脑周细胞的转基因标记无法区分活的和无活的周细胞，正如我们初步的 SAH 诱导的脑周细胞死亡研究所证实的那样9.
为了克服这些挑战，我们使用 TO-PRO-3 标记活周细胞，同时用碘化丙啶 （PI） 染色死亡周细胞。我们使用高分辨率共聚焦成像技术来可视化脑切片中活的和无活的脑周细胞，同时在成像过程中保持切片活性。本文旨在提出一种可重复的方法，用于对脑切片中活的和无活的脑周细胞进行成像，作为探究脑周细胞对 SAH 后脑微循环影响的宝贵工具。
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Protocol
该实验方案已获得昆明医科大学动物伦理与使用委员会（kmmu20220945）的批准。本研究使用Sprague-Dawley（SD）两性大鼠，300-350g。
1. 诱导SAH模型
- 使用2%异氟烷和100%氧气麻醉大鼠。通过提供异氟烷（1%-3%）的连续吸入麻醉来维持麻醉。使用立体定位装置固定大鼠的头部（参见 材料表）。
- 按照以下步骤创建 SAH 模型。
- 将显微注射针插入鞍上蓄水池。然后，使用注射泵将来自大鼠尾动脉（不含抗凝剂）的自体血液注入鞍上池（参见 材料表）。
- 使用上述坐标将显微注射针植入右侧脑室：前囟，-0.8 mm;横向，1.4毫米;深度，4 mm9。对于 SAH 组，注射 0.2 mL 大鼠尾动脉血。对于假组，施用相同体积的等渗盐水（图1A）。
2. 脑切片的制备和稳定
- 使用2%异氟烷吸入深度麻醉大鼠。斩首后，取出整个大脑并将它们浸入冰冷的人工脑脊液 （ACSF） 中。
注：使用具有以下成分的新鲜制备的 ACSF 溶液：134 mM NaCl、2.8 mM KCl、29 mM NaHCO3、1.1 mM NaH 2 PO 4、1.5 mM MgSO4、2.5 mM CaCl 2和 10.11 mM D-葡萄糖（参见材料表）。将 pH 值保持在 7.3 到 7.4 之间。 - 使用振动切片机（参见材料表）在用5%CO2和95%O 2充气的冰冷ACSF中制备厚度为200μm的SD大鼠的急性脑切片（图2）。
- 将 200 μm 厚的急性脑切片放入浸没在 ACSF 中的尼龙网的储存室中。用95%O 2和5%CO2平衡ACSF溶液，保持35-37°C的温度范围。 让脑切片稳定2小时，让它们有时间调整（图3）。
3. 用 TO-PRO-3 标记急性脑切片中的周细胞
注：使用示踪剂 TO-PRO-310 荧光标记来自急性脑切片的周细胞。
- 将荧光染料TO-PRO-3加入ACSF中，达到1μM的终浓度。 将急性脑切片在室温下与含有TO-PRO-3的ACSF在黑暗环境中孵育20分钟。
注意： 请记住在处理 TO-PRO-3 时戴上乳胶手套以提供保护。 - 将携带脑切片的尼龙网过滤器从装载室转移到 6 孔板冲洗室（参见 材料表）。让脑切片在冲洗室中停留10分钟（图4D）。
注意：此冲洗步骤终止染色过程，减少背景标记，并防止非特异性染色。 - 使用与 5% CO 2 和 95% O2 的混合物平衡的 ACSF 溶液冲洗制剂共 15 分钟。该冲洗步骤可阻止染料吸收并最大限度地减少背景标记（图4C）。
4.急性脑切片中脑微循环的非重要周细胞染色
- 在黑暗环境中，将预装有TO-PRO-3的脑切片与Alexa Fluor 488（FITC-ISOB4;5μg/ mL，参见 材料表）偶联的异凝集素B4在37°C孵育30分钟。孵育后，在ACSF中冲洗脑切片15分钟（图4E）。
- 像往常一样，在用 5% CO 2 和 95% O2 充气的 ACSF 中孵育脑切片。在37°C下将浓度为37μM的碘化丙啶（PI）加入两种溶液中。 这将标记非重要的脑周细胞。将制剂在该ACSF溶液中在黑暗中孵育60分钟（图4F）。
- 接下来，用ACSF溶液冲洗制剂15分钟，以阻止染料吸收并最大限度地减少背景标记。
5. 急性脑切片中重要和非重要脑周细胞的成像
- 使用塑料巴斯德移液管轻轻地将脑切片转移到玻璃底共聚焦培养皿（见材料表）上。用先前用 5% CO 2 和 95% O2 平衡的 ACSF 溶液填充培养皿。使用铁网将大鼠脑切片固定到位。
- 将玻璃底共聚焦培养皿转移到共聚焦显微镜的载物台上。将急性脑切片放置在培养皿底部，并在共聚焦显微镜成像期间用95%O 2和5%CO2的混合物平衡的ACSF溶液灌注9（图5A和图5Ab'）。
- 使用 40 倍物镜可视化大脑皮质微血管系统的壁细胞。使用兼容软件捕获图像堆栈（参见 材料表）。对IB4（激发/发射460nm/520nm）、PI（激发/发射545nm/595nm）和TO-PRO-3（激发/发射606nm/666nm）使用适当的滤光片（图5D）。
注意：使用以下详细信息捕获图像：40×DIC N1 物镜，3 × 12 位：512 × 512 像素（0.22 × 0.22 mm），校准：0.42 μm/px。 - 根据脑微血管系统和周细胞的网络和形态识别它们。在每个脑切片上找到一个包含脑微血管系统网络的特定区域并捕获图像。
- 仔细记录成像位置，以确保后续捕获的一致性（图5B，C）。如需进一步处理和分析，请使用图像分析软件（ImageJ）和照片编辑软件（参见材料表）。
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Representative Results
在正常生理条件下，脑周细胞一般不会发生细胞死亡。 图 6 说明了这种现象，黄色表示存在重要的脑周细胞;脑周细胞未显示 PI 染色，表明其活力。为了进一步研究细胞死亡后周细胞是否仍然附着在微血管系统上，在SAH大鼠模型中采用了方法，并进行了随后的成像。
已经开发了对 SAH 后脑切片中重要和非重要脑周细胞进行成像的方法。如 图 7 所示，重要的脑周细胞（蓝色箭头）位于微血管系统内，而非重要的脑周细胞由白色箭头表示。这种同时可视化允许识别脑切片中的重要和非重要脑周细胞。此外，观察到 PI 标记的非重要脑周细胞仍然附着在整个微血管系统上。
图 1：SAH 模型 。 （A）将大鼠的头部牢固地固定在立体定位装置上，以确保稳定性。通过小心地将立体定位针插入鞍上蓄水池来诱导 SAH 模型。（乙，三）在SAH模型中，血液进入颅骨内的蛛网膜下腔，影响大脑。SAH后约24小时大脑半球充满血液。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：急性全脑切片制备 。 （A）底部腔室涂有琼脂糖胶进行固定。（B）将胶水一丝不苟地涂在底部腔室上，以牢固地粘附在大脑上。（C）周围的储罐装满了冰冷的ACSF以保持温度。（D） 仔细定义所需的截面厚度。（E，F）。将脑切片小心翼翼地转移到 6 孔板上。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：在 6 孔板中转移移液器和染料上样 。 （A） 使用塑料巴斯德移液器 （3 mL） 转移急性脑切片。（a）中使用的移液器长度为18.2厘米。对于（b）和（c），塑料巴斯德移液器的细尖端经过仔细修剪，以防止在转移过程中对脑切片造成任何潜在损伤。将6孔板有效地从（B）过渡到（C），以便在37°C水浴中进行荧光染色。（B） 6 孔板的一个孔装有一个小的尼龙网过滤器，并配有用于输送气体的细管。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：急性脑切片的孵育。 仔细遵循系统程序，在急性脑切片中用 TO-PRO-3 标记周细胞。（A） 最初，将六孔板（12 × 8 cm）的一个孔中填充 10 mL ACSF，通过使用连接到 95% O2 和 5% CO2 混合物的细管鼓泡溶液来确保适当的曝气。（B）随后，将脑切片小心翼翼地转移到六孔板上。（C） 将 10 μL 的 TO-PRO-3 储备溶液引入染料加载室，轻轻搅拌以促进染料溶解 （D）。（E，F）为了进一步表征脑切片，用IB4（1μM在ACSF中）和PI（在ACSF中1μM）进行染色。这些连续步骤使得在急性脑切片中用 TO-PRO-3 成功标记周细胞，从而促进了对标记的脑周细胞的后续分析和检查。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：脑切片中重要和非重要脑周细胞的成像。 （A） 溶液与通过管道输送的 95% O 2 和 5% CO2 的混合物平衡。（B-E）用于对急性脑切片中 TO-PRO-3 标记、IB4 标记的内皮细胞和 PI 标记细胞进行高分辨率成像的设置。（E） 共聚焦显微镜。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：脑切片中重要脑周细胞的图像 。 （A） 用 IB4（绿色）标记脑微血管系统。（B）非生命细胞用PI标记。（C） 用 TO-PRO-3（黄色）标记重要周细胞。（D） 显示合并后的图像。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：SAH 后脑切片中重要和非重要脑周细胞的代表性图像 。 （A） 用 IB4（绿色）标记脑微血管系统。（B） 非生命细胞用PI（红色）标记。（C） 用 TO-PRO-3（黄色）标记重要周细胞。（D） 显示合并后的图像。蓝色箭头表示重要脑周细胞的例子，而白色箭头表示非重要脑周细胞的例子。值得注意的是，周细胞的细胞核不会突出到微血管表面上方。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：非重要周细胞数量与 SAH 后时间之间的正相关。 采用高分辨率共聚焦成像来捕获 SAH 后不同时间点的脑周细胞。SAH后6小时开始出现明显的脑周细胞死亡，如（A）中的白色箭头所示。随后，从 6 小时开始，周细胞死亡显着增加。如（B）所示，非重要周细胞的计数与SAH后经过的时间呈正相关。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
开发的是高分辨率共聚焦成像技术，用于可视化重要的脑周细胞、非重要的脑周细胞和脑切片中的微血管系统。在急性大鼠脑切片中，该过程需要用 TO-PRO-311 初始标记周细胞，然后用 IB412 标记微血管内皮细胞;随后，使用PI进行死亡周细胞的鉴定。该协议简单明了，可重复，并且高度适用于功能研究。
为了特异性地追踪神经系统内的脑周细胞，使用了远红色荧光团 TO-PRO-3。虽然 TO-PRO-3 主要对固定组织的细胞核进行染色13，但当应用于生理盐水14 时，它选择性地在体外掺入活周细胞中。先前的研究已经证实了使用 TO-PRO-315 明确鉴定鼠脑周细胞。这种荧光团有效地标记重要的脑周细胞11。相比之下，PI是一种常用于实时细胞活力评估的带电荧光染料12，在固定前应用（预固定PI染色）时可作为细胞劣化的标记物16。然而，由于周细胞的形态特征，特别是它们的细胞核，不会延伸到微血管表面以上，因此使用 PI 染色区分内皮细胞核和周细胞核可能具有挑战性，如 图 8A 中的白色箭头所示。涉及电子显微镜对大鼠海马体的 CA1 区域进行三维重建的研究表明，大约三分之一的内皮细胞被周细胞的体细胞和突起覆盖17。
在 图 6 中，在微血管系统内观察到用 TO-PRO-3 标记的脑周细胞。用 IB4 和 PI 标记的大脑微血管系统的共聚焦图像显示，在切片过程中只有少数细胞经历细胞死亡，如 图 6 中 PI 阳性死细胞的缺失所证明的那样。因此，SAH模型被用于研究非重要周细胞的存在。 图7 表明，在脑切片中，与内皮细胞相比，周细胞中的细胞死亡更为突出。此外，在 图 8A 中，从 SAH 后 6 小时开始观察到周细胞死亡显着增加。 图8B 显示了非重要周细胞的数量与SAH后经过的时间之间的正相关。然而，就目前所知，尚未对重要和非重要脑周细胞进行成像的综合研究。
目前，尚不确定来自其他物种或系统（例如心脏、小肠）的周细胞是否也在 SAH 后的急性切片中表现出重要和非重要状态。总之，提供的方案提供了一种可复制的方法，用于对 SAH 后脑切片中的重要和非重要脑周细胞进行成像。由于其简单性和可靠性，该技术可用于揭示脑切片中周细胞的功能和结构多样性，并促进与周细胞病理生理学相关的各种疾病模型中的详细细胞研究。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
该研究得到了国家自然科学基金（81960226,81760223）的资助;云南省自然科学基金（202001AS070045,202301AY070001-011）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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