Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65873
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, 2Clinical Medical Research Center, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

Summary

החקירה הראשונית מאשרת כי דימום תת-עכבישי (SAH) גורם למוות של פריציטים במוח. הערכת התכווצות פריציטים לאחר SAH דורשת הבחנה בין פריציטים חיים ולא קיימא במוח. לפיכך, פותח הליך לסימון פריציטים במוח בני קיימא ושאינם בני קיימא בו זמנית בקטעי מוח, מה שמקל על תצפית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה.

Abstract

פריציטים הם תאי קיר חיוניים הממוקמים בתוך מיקרוסירקולציה מוחית, חיוניים בוויסות פעיל של זרימת הדם במוח באמצעות התאמות התכווצות. באופן קונבנציונלי, ההתכווצות שלהם נמדדת על ידי התבוננות בתזוזות מורפולוגיות ושינויים בקוטר הנימים הסמוכים בנסיבות ספציפיות. עם זאת, קיבוע לאחר רקמות, הערכת חיוניות והתכווצות פריציטים כתוצאה מכך של פריציטים במוח המודמיים נפגעים. באופן דומה, תיוג גנטי של פריציטים במוח אינו מבחין בין פריציטים בני קיימא ושאינם בני קיימא, במיוחד במצבים נוירולוגיים כמו דימום תת-עכבישי (SAH), שם החקירה הראשונית שלנו מאמתת את מותו של פריציטים במוח. פרוטוקול אמין פותח כדי להתגבר על אילוצים אלה, המאפשר תיוג פלואורסצנטי בו זמנית של פריציטים במוח תפקודיים ולא פונקציונליים באזורי מוח. שיטת תיוג זו מאפשרת הדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה, ובו זמנית מסמנת את פרוסת המוח microvasculature. פרוטוקול חדשני זה מציע אמצעי להערכת התכווצות הפריציטים במוח, השפעתה על קוטר הנימים ומבנה הפריציטים. חקירת התכווצות פריציטים במוח בהקשר SAH מניבה הבנה מעמיקה של השפעותיה על מיקרו-סירקולציה מוחית.

Introduction

פריציטים במוח, המובחנים על ידי הבליטות הדקות שלהם וגופי התא הבולטים, מקיפים את microcirculation 1,2. בעוד שהגברת זרימת הדם במוח מונעת בעיקר על ידי התרחבות נימית, עורקים קטנים יותר מציגים קצב התרחבות איטי יותר3. התכווצות פריציטים משפיעה על קוטר הנימים ועל המורפולוגיה של הפריציטים, ומשפיעה על דינמיקת כלי הדם4. התכווצות של פריציטים במוח מובילה להתכווצות נימית, ובתרחישים פתולוגיים, התכווצות יתר עלולה לעכב את זרימת אריתרוציטים5. גורמים שונים, כולל נוראפינפרין המשתחרר מהלוקוס קורולוס, יכולים לגרום להתכווצות פריציטים במוח בתוך נימים6. עם תפקיד מווסת בזרימת הדם במוח, פריציטים מציגים סינתזת 20-HETE, ומשמשים כחיישן חמצן במהלך היפראוקסיה7. התכווצות המופעלת על ידי מתח חמצוני-חנקני של פריציטים במוח משפיעה לרעה על נימים5. למרות מחקרי in vivo ו-ex vivo על התכווצות פריציטים במוח8, קיים ידע מוגבל בנוגע לדימות של פריציטים מוחיים בני קיימא ובלתי ברי קיימא בתוך פרוסות מוח.

באופן מכריע, דימות לאחר קיבוע רקמות של פריציטים במוח פוגע בחיוניותם ובהערכת ההתכווצות שלאחר מכן. יתר על כן, בתרחישים כגון הפרעות נוירולוגיות (למשל, דימום תת-עכבישי - SAH), תיוג מהונדס של פריציטים במוח אינו מצליח להבדיל בין פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא, כפי שאושר במחקר המוות הראשוני שלנו של פריציטים במוח הנגרם על ידי SAH9.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, השתמשנו ב-TO-PRO-3 כדי לתייג פריציטים חיים, בעוד שהמתים הוכתמו בפרופידיום יודיד (PI). השתמשנו בטכנולוגיות דימות קונפוקלי ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש פריציטים חיים ולא בני קיימא במוח בפרוסות מוח, תוך שמירה על פעילות הפרוסות במהלך ההדמיה. מאמר זה נועד להציג שיטה הניתנת לשחזור לדימות פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא במוח בפרוסות מוח, המשמשת ככלי רב ערך לחקירת ההשפעה של פריציטים במוח על מיקרו-סירקולציה מוחית לאחר SAH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD) משני המינים, 300-350 גרם.

1. השראת מודל SAH

  1. מרדימים את החולדות באמצעות 2% איזופלורן ו-100% חמצן. לשמור על הרדמה על ידי אספקת הרדמה רציפה עם איזופלורן (1%-3%). אבטחו את ראש החולדה באמצעות מנגנון סטריאוטקסי (ראו טבלת חומרים).
  2. צור את מודל SAH לפי השלבים הבאים.
    1. הכנס מחט מיקרו-הזרקה לבור המים העל-סלרי. לאחר מכן, הזריקו דם אוטולוגי מעורק הזנב של החולדה (ללא נוגדי קרישה) לבור המים העל-סלרי באמצעות משאבת מזרק (ראו טבלת חומרים).
    2. להשתיל מחט microinjection לתוך החדר המוחי לרוחב ימין באמצעות הקואורדינטות שהוזכרו: bregma, −0.8 מ"מ; לרוחב, 1.4 מ"מ; עומק, 4 מ"מ9. עבור קבוצות SAH, להזריק 0.2 מ"ל של דם עורק זנב חולדה. עבור קבוצות דמה, יש לתת את אותו נפח של מי מלח איזוטוניים (איור 1A).

2. הכנת פרוסת המוח וייצוב

  1. מרדימים עמוקות את החולדות באמצעות שאיפת איזופלורן 2%. לאחר עריפת הראש, חלצו את כל המוחות וטבלו אותם בנוזל מוחי מלאכותי קר כקרח (ACSF).
    הערה: השתמש בפתרונות ACSF טריים שהוכנו עם ההרכב הבא: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2ו- 10.11 mM D-Glucose (ראה טבלת חומרים). שמור על pH בין 7.3 ל 7.4.
  2. השתמשו בוויברטום (ראו טבלת חומרים) כדי להכין פרוסות מוח חריפות בעובי של 200 מיקרומטר מחולדות SD ב-ACSF קר כקרח שמאוורר עם 5% CO 2 ו-95% O 2 (איור 2).
  3. הניחו את פרוסות המוח החריפות בעובי 200 מיקרומטר בתא אחסון על רשת ניילון שקועה ב-ACSF. אזנו את תמיסת ACSF עם 95% O 2 ו-5% CO2, תוך שמירה על טווח טמפרטורות של 35-37°C. אפשרו לפרוסות המוח להתייצב במשך שעתיים, מה שנתן להן זמן להסתגל (איור 3).

3. תיוג פריציטים בפרוסות מוח חריפות עם TO-PRO-3

הערה: פריציטים מפרוסות מוח חריפות סומנו באופן פלואורסצנטי באמצעות נותב TO-PRO-310.

  1. הוסיפו את הצבע הפלואורסצנטי TO-PRO-3 ל-ACSF והגיעו לריכוז סופי של 1 מיקרומטר. דגרו על פרוסות המוח החריפות בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה עם ACSF המכיל TO-PRO-3 למשך 20 דקות.
    הערה: זכור ללבוש כפפות לטקס בעת הטיפול ב-TO-PRO-3 להגנה.
  2. מעבירים את מסננת רשת הניילון, הנושאת את פרוסות המוח, מתא ההעמסה לתא שטיפת צלחות בעל 6 בארות (ראו טבלת חומרים). אפשרו לפרוסות המוח להישאר בתא השטיפה במשך 10 דקות (איור 4D).
    הערה: שלב שטיפה זה מסיים את תהליך הצביעה, מפחית את תיוג הרקע ומונע כתמים לא ספציפיים.
  3. שטפו את התכשירים במשך 15 דקות בסך הכל באמצעות תמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 5% CO 2 ו-95% O2. שלב השטיפה הזה עוצר את ספיגת הצבע וממזער את תיוג הרקע (איור 4C).

4. צביעת פריציטים לא חיוניים של microcirculation מוחי בפרוסות מוח חריפה

  1. דגרו פרוסות מוח טעונות מראש ב-TO-PRO-3 בטמפרטורה של 37°C עם איזולקטין B4 מצומד ל-Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 מיקרוגרם/מ"ל, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בסביבה חשוכה. לאחר הדגירה, שטפו את פרוסות המוח במשך 15 דקות ב-ACSF (איור 4E).
  2. לדגור על פרוסות המוח בגז ACSF עם 5% CO 2 ו 95% O2 כרגיל. הוסף פרופידיום יודיד (PI) בריכוז של 37 מיקרומטר לשתי התמיסות ב 37 ° C. זה יתייג פריציטים במוח שאינם חיוניים. דגרו על התכשירים בתמיסת ACSF זו במשך 60 דקות בחושך (איור 4F).
  3. לאחר מכן, שטפו את התכשירים במשך 15 דקות עם תמיסות ACSF כדי לעצור את ספיגת הצבע ולמזער את תיוג הרקע.

5. הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח חריפות

  1. מעבירים בעדינות פרוסות מוח לכלים קונפוקליים בתחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) בעזרת פיפטות פלסטיק של פסטר. מלאו את הכלים בתמיסת ACSF ששוותה בעבר עם 5% CO 2 ו-95% O2. השתמשו ברשת ברזל כדי לאבטח פרוסות מוח של חולדות במקומן.
  2. מעבירים את הכלים הקונפוקליים בתחתית הזכוכית לשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי. מקמו את פרוסת המוח החריפה בתחתית הצלחתונתלו 9 אותה בתמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 95% O2 ו-5%CO2 במהלך דימות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 5A ואיור 5Ab).
  3. דמיינו את תאי הקיר של כלי הדם בקליפת המוח באמצעות מטרה של פי 40. לכוד אוספי תמונות באמצעות תוכנה תואמת (ראה רשימת חומרים). השתמש במסננים מתאימים עבור IB4 (עירור/פליטה 460 ננומטר/520 ננומטר), PI (עירור/פליטה 545 ננומטר/595 ננומטר) ו-TO-PRO-3 (עירור/פליטה 606 ננומטר/666 ננומטר) (איור 5D).
    הערה: צלם תמונות עם הפרטים הבאים: 40× DIC N1 עדשה אובייקטיבית, 3 × 12 סיביות: 512 × 512 פיקסלים (0.22 × 0.22 מ"מ), כיול: 0.42 מיקרומטר/פיקסלים.
  4. לזהות microvasculature מוחי ו pericytes מבוסס על הרשת שלהם ואת המורפולוגיה. אתר אזור ספציפי המכיל רשת כלי דם מוחיים על כל פרוסת מוח וצלם תמונות.
  5. שימו לב בזהירות למיקום ההדמיה כדי להבטיח עקביות בלכידות הבאות (איור 5B,C). לעיבוד וניתוח נוספים, השתמש בתוכנה לניתוח תמונות (ImageJ) ובתוכנה לעריכת תמונות (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בתנאים פיזיולוגיים רגילים, פריציטים במוח בדרך כלל אינם עוברים מוות תאי. איור 6 ממחיש את התופעה הזו, כאשר צהוב מציין נוכחות של פריציטים חיוניים במוח; פריציטים במוח אינם מראים כתמים עם PI, מה שמצביע על יכולת הקיום שלהם. כדי להמשיך ולחקור אם פריציטים נשארים מחוברים לכלי הדם הזעירים לאחר מוות תאי, נעשה שימוש בשיטות במודל של חולדות SAH, ולאחר מכן נערכו הדמיות.

פותחו שיטות לדימות פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר SAH. כפי שמתואר באיור 7, פריציטים חיוניים במוח (חיצים כחולים) ממוקמים בתוך כלי הדם, בעוד פריציטים לא חיוניים במוח מיוצגים על-ידי חיצים לבנים. הדמיה סימולטנית זו מאפשרת זיהוי של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בתוך פרוסות מוח. יתר על כן, נצפה כי פריציטים במוח שאינם חיוניים המסומנים PI נותרו מחוברים לכל כלי הדם הזעירים.

Figure 1
איור 1: מודל SAH . (A) ראש החולדה היה מחובר היטב למנגנון הסטריאוטקסי כדי להבטיח יציבות. מודל SAH הושרה על ידי החדרה זהירה של מחט סטריאוטקסית לבור המים העל-סלרי. (ב,ג) במודל SAH, הדם נכנס לחלל התת עכבישי בתוך הגולגולת, ומשפיע על המוח. ההמיספרות המוחיות מתמלאות בדם כ -24 שעות לאחר SAH. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכנה חריפה של פרוסת מוח שלמה . (A) החדר התחתון היה מצופה בדבק אגרוז לצורך קיבוע. (B) הדבק הודבק בקפידה על החדר התחתון כדי להיצמד היטב למוח. (C) המיכל שמסביב היה מלא ב-ACSF קר כקרח כדי לשמור על טמפרטורה. (ד) עובי החתך הרצוי הוגדר בקפידה. (ה,ו). פרוסות המוח הועברו בקפידה לצלחת בת 6 בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: העברת פיפטות והעמסת צבע בצלחת בעלת 6 בארות. (A) פרוסות מוח אקוטיות הועברו באמצעות פיפטות פסטר מפלסטיק (3 מ"ל). אורך הפיפטה ששימשה ב-(a) היה 18.2 ס"מ. עבור (b) ו-(c), הקצה הדק של פיפטת פסטר מפלסטיק נחתך בקפידה כדי למנוע נזק פוטנציאלי לפרוסות המוח במהלך ההעברה. לוחות 6 הבארות הועברו ביעילות מ- (B) ל- (C) לצביעת פלואורסצנטיות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. (B) באר אחת מתוך צלחת 6 הקידוחים הכילה מסננת רשת ניילון קטנה, עם צינורות עדינים הממוקמים להובלת גז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דגירה של פרוסות מוח חריפות. הליך שיטתי בוצע בקפידה כדי לתייג פריציטים עם TO-PRO-3 בפרוסות המוח החריפות. (A) בתחילה, באר אחת של צלחת בעלת שש בארות (12 × 8 ס"מ) הייתה מלאה ב-10 מ"ל של ACSF, מה שהבטיח אוורור נאות על ידי בעבוע התמיסה באמצעות צינורות עדינים המחוברים לתערובת של 95% O 2 ו-5% CO2. (B) לאחר מכן, פרוסות המוח הועברו בקפידה לצלחת בעלת שש בארות. (C) 10 μL של תמיסת מלאי TO-PRO-3 הוכנסו לתא טעינת הצבע, בעדינות כדי להקל על המסת הצבע (D). (ה,ו) כדי לאפיין עוד יותר את פרוסות המוח, בוצע צביעה עם IB4 (1 מיקרומטר ב- ACSF) ו- PI (1 מיקרומטר ב- ACSF). שלבים רציפים אלה אפשרו תיוג מוצלח של פריציטים עם TO-PRO-3 בפרוסות מוח חריפות, ובכך אפשרו ניתוח ובחינה מאוחרים יותר של פריציטים במוח המסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח. (A) התמיסה מאוזנת עם תערובת של 95% O 2 ו-5% CO2 המועברת דרך הצינור. (ב-ה) הגדרה לדימות ברזולוציה גבוהה של תאים המסומנים בתווית TO-PRO-3, אנדותל עם תווית IB4 ותאי PI בפרוסות מוח חריפות. (E) מיקרוסקופ קונפוקלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונה של פריציטים חיוניים במוח בפרוסות מוח. (A) כלי דם מוחיים סומנו ב-IB4 (ירוק). (B) תאים לא חיוניים סומנו ב-PI. (C) פריציטים חיוניים סומנו ב-TO-PRO-3 (צהוב). (D) התמונה הממוזגת מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תמונה מייצגת של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסת מוח אחרי SAH. (A) כלי דם מוחיים סומנו ב-IB4 (ירוק). (B) תאים לא חיוניים סומנו ב-PI (אדום). (C) פריציטים חיוניים סומנו ב-TO-PRO-3 (צהוב). (D) התמונה הממוזגת מוצגת. חיצים כחולים מציינים דוגמאות של פריציטים חיוניים במוח, בעוד שחצים לבנים מציינים דוגמאות של פריציטים במוח שאינם חיוניים. יש לציין כי גרעיני הפריציטים אינם בולטים מעל פני השטח המיקרו-וסקולריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: מתאם חיובי בין מספר הפריציטים הלא חיוניים לבין הזמן שלאחר SAH. הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה שימשה ללכידת פריציטים במוח בנקודות זמן שונות לאחר SAH. מוות תאי ניכר של פריציטים במוח החל בשעה 6 שעות לאחר SAH, כפי שמצוין על ידי חצים לבנים ב-(A). לאחר מכן, חלה עלייה משמעותית במוות של פריציטים מסימן 6 שעות ואילך. ספירת הפריציטים הלא חיוניים הראתה מתאם חיובי עם הזמן שחלף לאחר SAH, כפי שמתואר ב-(B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פותחו טכניקות הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה להדמיית פריציטים חיוניים במוח, פריציטים לא חיוניים במוח והמיקרו-כלי דם בפרוסות מוח. בפרוסות מוח חריפות של חולדות, התהליך כרוך בתיוג ראשוני של פריציטים עם TO-PRO-311, ואחריו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם IB412; לאחר מכן, זיהוי של pericytes שנפטרו מתבצע באמצעות PI. פרוטוקול זה הוא פשוט, ניתן לשחזור וישים מאוד למחקר פונקציונלי.

כדי לעקוב באופן ספציפי אחר פריציטים במוח בתוך מערכת העצבים, נעשה שימוש בפלואורופור האדום הרחוק TO-PRO-3. בעוד TO-PRO-3 מכתים בעיקר את הגרעינים של רקמה קבועה13, הוא משולב באופן סלקטיבי לתוך pericytes ex vivo חי כאשר מיושם מלוחים פיזיולוגיים14. מחקרים קודמים אישרו את הזיהוי החד משמעי של פריציטים במוח באמצעות TO-PRO-315. פלואורופור זה מתייג ביעילות פריציטים חיוניים במוח11. לעומת זאת, PI, פלואורוכרום טעון נפוץ להערכת כדאיות תאים בזמן אמת12, משמש סמן להידרדרות תאים כאשר הוא מיושם לפני קיבוע (צביעת PI לפני קיבוע)16. אולם מאחר שהמאפיינים המורפולוגיים של פריציטים, במיוחד גרעיניהם, אינם משתרעים מעל פני השטח המיקרו-וסקולריים, ההבחנה בין גרעיני אנדותל ופריציטים באמצעות צביעת PI יכולה להיות מאתגרת, כפי שמצוין בחץ הלבן באיור 8A. מחקרים שכללו מיקרוסקופ אלקטרונים לשחזור תלת-ממדי של אזור CA1 בהיפוקמפוס של חולדה הציעו שכשליש מהאנדותל מכוסה על ידי סומות ותהליכים של פריציטים17.

באיור 6, פריציטים במוח המסומנים ב-TO-PRO-3 נצפים בתוך כלי הדם הזעירים. תמונות קונפוקליות של כלי הדם המוחיים המסומנים ב-IB4 וב-PI מגלות שרק תאים מעטים עוברים מוות תאי במהלך תהליך החיתוך, כפי שמעידה היעדרם של תאים מתים חיוביים ל-PI באיור 6. כתוצאה מכך, מודל SAH משמש לחקר נוכחותם של פריציטים לא חיוניים. איור 7 ממחיש שבתוך פרוסות מוח, מוות תאי בולט יותר בפריציטים בהשוואה לתאי אנדותל. נוסף על כך, באיור 8A נצפתה עלייה משמעותית במוות של פריציטים החל מ-6 שעות לאחר SAH. איור 8B מדגים מתאם חיובי בין מספר הפריציטים הלא חיוניים לבין הזמן שחלף לאחר SAH. עם זאת, מחקר מקיף המדמה פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח לא תועד למיטב הידע הנוכחי.

נכון לעכשיו, עדיין לא ברור אם פריציטים ממינים או מערכות אחרות (למשל, לב, מעי דק) גם מבטאים מצבים חיוניים ולא חיוניים בפרוסות חריפות לאחר SAH. לסיכום, הפרוטוקול המסופק מציע גישה ניתנת לשכפול להדמיית פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר SAH. בשל פשטותה ואמינותה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחשוף את המגוון התפקודי והמבני של פריציטים בפרוסות מוח ולהקל על חקירות תאיות מפורטות במודלים שונים של מחלות הקשורות לפתופיזיולוגיה של פריציטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226,81760223); הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045,202301AY070001-011)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate ABC biochemistry ABC703006 RT
Adobe Photoshop Adobe Adobe Illustrator CS6 16.0.0 RT
Aluminium foil MIAOJIE 225 mm x 273 mm RT
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881 RT
Confocal imaging software Nikon NIS-Elements 4.10.00 RT
Confocal Laser Scanning Microscope Nikon N-SIM/C2si RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2) PENGYIDA 40L RT
Glass Bottom Confocal Dishes Beyotime FCFC020-10pcs RT
Glucose Sigma-Aldrich G5767 RT
Glue EVOBOND KH-502 RT
Ice machine XUEKE IMS-20 RT
Image analysis software National Institutes of Health Image J RT
Inhalation anesthesia system SCIENCE QAF700 RT
Isolectin B 4-FITC SIGMA L2895–2MG Store aliquots at –20 °C
KCl Sigma-Aldrich 7447–40–7 RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 RT
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506 RT
NaCl Sigma-Aldrich 7647–14–5 RT
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich 10049–21–5 RT
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761 RT
Pasteur pipette NEST Biotechnology 318314 RT
Peristaltic Pump Scientific Industries Inc Model 203 RT
Propidium (Iodide) Med Chem Express HY-D0815/CS-7538 Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus SCIENCE QA RT
Syringe pump Harvard PUMP PUMP 11 ELITE Nanomite RT
Thermostatic water bath OLABO HH-2 RT
Vibrating microtome Leica VT1200 RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
  2. Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
  3. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  4. Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
  5. Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
  6. Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
  7. Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
  8. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  9. Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
  10. Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
  11. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  12. Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
  13. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  14. Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
  15. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  16. Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
  17. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).

Tags

פריציטים במוח דימום תת-עכבישי מיקרוסירקולציה מוחית התאמות התכווצות שינויים מורפולוגיים שינויים בקוטר נימי קיבוע לאחר רקמות הערכת חיוניות התכווצות פריציטים תיוג גנטי פריציטים ברי קיימא פריציטים שאינם ברי קיימא מצבים נוירולוגיים פרוטוקול אמין תיוג פלואורסצנטי פריציטים תפקודיים במוח פריציטים במוח שאינם פונקציונליים הדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה כלי דם מיקרו-וסקולטוריים של פרוסת המוח פריציט מבנה הקשר SAH השפעות מיקרוסירקולציה מוחית
הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y. J., Li, Y. C., Yu, H. F.,… More

Zhang, Y. J., Li, Y. C., Yu, H. F., Li, C., Deng, H. J., Dong, Y. H., Li, G. B., Wang, F. Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (198), e65873, doi:10.3791/65873 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter