Summary
Her beskriver vi en metode til tarmisolering fra zebrafisklarver 5 dage efter befrugtning til enkeltcelle RNA-sekventeringsanalyse.
Abstract
Mave-tarmkanalen (GI) udfører en række funktioner, der er afgørende for livet. Medfødte defekter, der påvirker dets udvikling, kan føre til enteriske neuromuskulære lidelser, hvilket fremhæver vigtigheden af at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for GI-udvikling og dysfunktion. I dette studie præsenterer vi en metode til tarmisolering fra zebrafisklarver 5 dage efter befrugtning for at opnå levende, levedygtige celler, som kan bruges til enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) analyse. Denne protokol er baseret på manuel dissektion af zebrafiskens tarm efterfulgt af enzymatisk dissociation med papain. Derefter sendes celler til fluorescensaktiveret cellesortering, og levedygtige celler indsamles til scRNA-seq. Med denne metode var vi i stand til med succes at identificere forskellige tarmcelletyper, herunder epitel-, stromal-, blod-, muskel- og immunceller samt enteriske neuroner og glia. Derfor anser vi det for at være en værdifuld ressource til at studere sammensætningen af mave-tarmkanalen i sundhed og sygdom ved hjælp af zebrafisken.
Introduction
Mave-tarmkanalen (GI) er et komplekst system, der spiller en afgørende rolle i den generelle sundhed og trivsel. Det er ansvarligt for fordøjelsen og absorptionen af næringsstoffer samt eliminering af affaldsprodukter 1,2. GI-kanalen består af flere celletyper, herunder epitelceller, glatte muskelceller, immunceller og det enteriske nervesystem (ENS), som kommunikerer tæt sammen for at regulere og opretholde korrekt tarmfunktion 3,4,5. Defekter i udviklingen af mave-tarmkanalen kan have vidtrækkende virkninger på forskellige aspekter såsom næringsstofabsorption, mikrobiotasammensætning, tarm-hjerneaksen og ENS, hvilket fører til flere enteriske neuromuskulære lidelser, såsom Hirschsprungs sygdom og kronisk intestinal pseudoobstruktion 6,7. Disse lidelser er karakteriseret ved alvorlig tarmdysmotilitet forårsaget af ændringer i forskellige nøgleceller, såsom de interstitielle celler i Cajal, glatte muskelceller og ENS 6,8,9. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for GI-udvikling og dysfunktion, stadig dårligt forstået.
Zebrafisken er en værdifuld modelorganisme til at studere GI-udvikling og dysfunktion på grund af dens hurtige embryonale udvikling, gennemsigtighed under embryonale og larvestadier og genetisk trækbarhed 10,11,12,13,14. Talrige transgene zebrafiskelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner, er tilgængelige. Et eksempel på en sådan linje er tg (phox2bb: GFP) zebrafisk, der almindeligvis anvendes til at studere ENS, da alle phox2bb + celler, herunder enteriske neuroner, er mærket15,16. Her præsenterer vi ved hjælp af zebrafisklinjen tg (phox2bb: GFP) en metode til tarmisolering af 5 dage efter befrugtning (dpf) larver til enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) analyse (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt zebrafiskeopdræt og alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer i Erasmus MC og dyrevelfærdslovgivningen. Brugen af zebrafisklarver 5 dage efter befrugtning falder ind under kategorien forsøg, der ikke kræver formel etisk godkendelse, som beskrevet i de hollandske regler.
1. Opnåelse af 5 dage efter befrugtning (dpf) vildtype og tg (phox2bb: GFP) larver
- Opsæt opdræt af vildtype zebrafisk og saml 50 æg i HEPES-bufret E3 medium (i det efterfølgende benævnt E3) i en 15 cm petriskål. Brug disse fisk som en negativ kontrol til fluorescensaktiveret cellesortering (FAC'er).
- Sæt opdræt af tg (phox2bb: GFP) zebrafisk og saml ca. 300 æg i E3 i en 15 cm petriskål.
- Opbevar befrugtede æg i E3 (højst 50 æg / skål) på en 14 timer / 10 timers lys / mørk cyklus i en inkubator ved 28,5 ° C.
- Ved 1 dpf skal du fjerne ufrugtede æg og lade de befrugtede udvikle sig til 5 dpf.
- Vælg tg(phox2bb:GFP) larver ved 1 dpf.
2. Dissociation af vildtype hele larver
- Bedøv 5 dpf larver med 0,016% Tricaine.
- Hak 30 zebrafisk i små stykker ved hjælp af et barberblad i en petriskål indeholdende 1 ml 10x trypsin-EDTA-opløsning.
- Overfør den hakkede zebrafisk til et mikrocentrifugerør med et samlet volumen på 2 ml 10x trypsin-EDTA-opløsning og lad den stå på is i 3 timer. Pipette op og ned med en P1000-pipette hver time for at stimulere dissociation.
3. Tarmisolering
- Placer 6-10 5 dpf larver bedøvet med 0,016% Tricaine i træk på en 1,8% agaroseplade (0,45 g agarose i 25 ml E3) under et dissektionsmikroskop
- Sæt en insektnål i hovedet på zebrafisken.
- Fjern alle resterende E3 ved hjælp af en serviet.
- Isoler tarmen ved hjælp af en anden insektstift uden at forstyrre andre organer. Sørg for, at æggeblommen er fjernet (supplerende figur S1A).
- Når den er isoleret, skal du inspicere tarmen og fjerne alt ikke-tarmmateriale (f.eks. Hud, fedt, lever), hvis det er nødvendigt.
- Saml tarmen med pincet og læg den i et mikrocentrifugerør, der indeholder fosfatbufret saltvand (PBS) med 10% føtalt kalveserum (FCS), på is.
BEMÆRK: Mindst 244 tarme skal isoleres, idet den samlede dissektionstid holdes på 3 timer. Dette er muligt med to personer, der arbejder parallelt.
4. Tarm dissociation
- Umiddelbart efter dissektion af alle tarmene centrifugeres mikrocentrifugerøret ved fuld hastighed (13.800 × g) i 30 s.
- Fjern PBS / 10% FCS, men lad en lille mængde (~ 100 μL) for at forhindre tarmene i at tørre ud. Tilsæt 500 μL 2,17 mg/ml papain i HBSS indeholdendeCaCl2 ogMgCl2 for at dissociere celler.
- Aktivér papain med 2,5 μL cystein (1 M).
- Inkuber tarmene i et vandbad ved 37 °C i 10 minutter. Pipette op og ned halvvejs (efter 5 min) for at stimulere enzymatisk vævsfordøjelse.
- Overfør celler til et FACS-rør ved hjælp af en 35 μm cellesi, forvædet med 0,5 ml PBS / 10% FCS.
- Sien vaskes ved at tilsætte i alt 2 ml PBS/10% FCS i trin på 0,5 ml.
- Der centrifugeres ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes i 300 μl PBS/10% FCS.
- Der tilsættes 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) for at mærke døde celler (1:1.000) og inkuberes i 5 minutter for at tillade deres udelukkelse under FACS.
5. FACS-berigelse
- Brug vildtypeprøven til at indstille portene til den sorterede cellepopulation ved at registrere 3.000 celler på flowcytometeret (supplerende figur S1B-E).
- Brug en 100 μm dyse, indstil sorteringspræcision på renhed, og sæt opsamlingsrøret indeholdende 200 μL PBS/5% FCS i FACS-maskinen.
- Læg cellesuspensionen af tarmene og sorter levende (DAPI-negative), enkeltceller i opsamlingsrøret (figur 2C) ved at udelukke dubletter (figur 2B) og døde celler (figur 2C).
BEMÆRK: For tg(phox2bb) zebrafisken kontrolleres andelen af GFP+ celler kun for reference, da alle enkelte levende celler sorteres. - Opbevar opsamlingsrøret på is efter cellesortering.
- Cellesuspensionen tælles med et hæmocytometer, herunder en levedygtighedskontrol med trypanblåt. Hvis levedygtigheden er mindst 80%, fortsæt med næste trin.
- Celler er nu klar til behandling for scRNAseq (dvs. 10x Genomics Chromium-platform). Brug ca. 20.000 celler pr. prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denne protokol opnåede vi vellykket isolering og dissociation af hele tarmene fra 5 dpf larver. Ved at bruge papain som dissociationsenzym forbedrede vi signifikant cellelevedygtigheden, hvilket muliggjorde indfangning af 46.139 hændelser, der involverede enkelte, levedygtige celler (6,4% af alle celler) ud af 244 isolerede tarme (figur 2A). Vildtype-hellarver blev brugt som kontrol for at sikre, at sorteringsprocessen blev optimeret, hvilket muliggjorde effektiv celleidentifikation og sortering. Hele larver kunne bruges, da vi kun sorterer efter levende, enkeltceller (supplerende figur S1B-E). Alle sorterede tarmceller blev efterfølgende sendt til scRNA seq-platformen. I alt blev 9.858 celler sekventeret med gennemsnitlige aflæsninger pr. celle på 21.106. Til scRNA-seq-analyse brugte vi Seurat V317. I alt blev 48 klynger identificeret, der repræsenterer 12 forskellige celletyper, herunder epitel-, stromal-, blod-, muskel- og immunceller samt enteriske neuroner og glia18.
Figur 1: Eksperimentelt design til enkeltcelle RNA-sekventering af isolerede zebrafisktarme. Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; scRNA-seq = enkeltcelle RNA-sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gating strategi til at sortere levende, enkelte celler fra zebrafiskens tarm. (A) Postsorteringsanalyse med FCS/SSC-størrelsesgating. (B) Dobbelt forskelsbehandling. (C) Levende/døde celler og sorteret population. (D) Phox2bb:GFP+ celler, der findes i den sorterede levende population. I hvert panel vises procentdelen af lukkede celler. Forkortelser: FCS-A = fremadrettet spredning-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; GFP = grønt fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Tarmisolering og gating-strategi til sortering af levende, enkeltceller fra hele vildtype zebrafisklarver. (A) Brightfield billede af tarmisolering fra 5 dage efter befrugtning zebrafisklarver. Den røde linje angiver dissektionslinjen. (B) Post-sort analyse, der viser alle celler med FCS / SSC størrelse gating. (C) Singlet udvælgelse. (D) DAPI-gating. E) Phox2bb:GFP+ gating. Procentdelen af lukkede celler vises i hvert panel. Forkortelser: FCS-A = fremadrettet spredning-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; GFP = grønt fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en metode til isolering og dissociation af tarmen hos 5 dpf zebrafisklarver ved hjælp af FACS. Med denne metode blev forskellige tarmcelletyper med succes indsamlet og analyseret af scRNA-seq ved hjælp af 10x Genomics Chromium-platformen. Vi valgte zebrafisklinjen tg(phox2bb:GFP), da vi ønskede en indikation af, at levedygtige ENS-celler også ville blive isoleret (figur 2D). Det er dog vigtigt at bemærke, at denne metode let kan udvides til andre zebrafiskelinjer af interesse, da vi kun brugte phox2bb-gatingen til at vurdere neuronal levedygtighed og ikke til at vælge en bestemt cellepopulation. Da vi besluttede at bruge en upartisk tilgang til at indsamle alle tarmceller, der er til stede ved 5 dpf, afhænger sorteringskriteriet primært af at identificere levende, individuelle celler. Dette er også grunden til brugen af hele larver til at etablere en pålidelig og konsekvent gating-strategi. I betragtning af det arbejde, der er involveret i isolering af individuelle tarme, bliver det upraktisk at isolere flere tarme for at tjene som en negativ kontrol inden for den givne tidsramme for dette eksperiment. Selvom vi anerkender, at celletyper fra hele larverne adskiller sig fra dem, der findes i tarmen, og endda forskellige dissociationsmetoder blev brugt, er det bemærkelsesværdigt, at gating-strategien, der anvendes til at sortere tarmceller, oprindeligt kan valideres ved hjælp af hele larver, da vi kun var interesserede i at vurdere cellelevedygtighed.
For at udføre scRNA-seq ville et kritisk trin i denne protokol være at isolere et tilstrækkeligt antal levedygtige celler (~ 20.000 celler). Samtidig bør den tid, der bruges til tarmisolering, holdes så kort som muligt for at undgå en skadelig virkning på cellelevedygtigheden. Tidligere rapporter med fokus på zebrafisklarver, tarme anvendte accutase eller trypsin til celledissociation 19,20,21. Mens begge dissociationsenzymer var i stand til at isolere nok levedygtige celler til scRNA-seq, tillod accutase imidlertid ikke indfangning af enteriske neuronale celler 19,20. Trypsin fangede imidlertid overvejende epitelceller, hvilket kun gav et lavt antal enteriske neuronale celler21. Papain er almindeligt anerkendt for sin blidhed, hvilket kan være særligt gavnligt for at bevare enterisk neuronal integritet22. Vores resultater viste, at papain faktisk er effektiv til at opretholde levedygtigheden af neuronale celler, hvilket bekræfter tidligere anvendelser, hvor dette enzym blev brugt til at fordøje zebrafiskens voksne nethinde og hjerne23,24. Det er dog bemærkelsesværdigt at nævne, at selv med papain var cellelevedygtighed efter tarmisolering og dissociation kun 6,4%. Dette tyder på, at det efterfølgende FACS-trin derfor er afgørende for at selektere for levedygtige celler. Sådanne resultater kan betragtes som en begrænsning, især når man beskæftiger sig med knappe og udfordrende at fange celler af interesse.
Fremtidige undersøgelser bør fokusere på nye dissociationsmetoder til forbedring af cellelevedygtigheden under isolationsprotokollen. Når den er øget, bliver denne metode mulig til at sortere reporter-positive celler og udføre scRNA-seq på specifikke tarmcelletyper. Ikke desto mindre tillader metoden, der præsenteres her, indfangning af nok levedygtige celler til efterfølgende identifikation af forskellige celletyper i tarmen, såsom epitel, stromal, blod, muskler, immunceller og endda enteriske neuroner og glia, som ikke er blevet fanget før på dette cellestadium ved hjælp af lignende tilgange. Da evnen til at isolere og analysere disse forskellige celletyper er afgørende for at få mere indsigt i GI-udvikling og dysfunktion, anser vi denne metode for at være særlig værdifuld, da den giver en pålidelig tilgang til at studere tarmsammensætningen ved hjælp af zebrafisken som modelorganisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af venner af Sophia Foundation (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
