Tarmisolering fra zebrafisklarver til enkeltcelle RNA-sekventering
Summary
Her beskriver vi en metode til tarmisolering fra zebrafisklarver 5 dage efter befrugtning til enkeltcelle RNA-sekventeringsanalyse.
Abstract
Mave-tarmkanalen (GI) udfører en række funktioner, der er afgørende for livet. Medfødte defekter, der påvirker dets udvikling, kan føre til enteriske neuromuskulære lidelser, hvilket fremhæver vigtigheden af at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for GI-udvikling og dysfunktion. I dette studie præsenterer vi en metode til tarmisolering fra zebrafisklarver 5 dage efter befrugtning for at opnå levende, levedygtige celler, som kan bruges til enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) analyse. Denne protokol er baseret på manuel dissektion af zebrafiskens tarm efterfulgt af enzymatisk dissociation med papain. Derefter sendes celler til fluorescensaktiveret cellesortering, og levedygtige celler indsamles til scRNA-seq. Med denne metode var vi i stand til med succes at identificere forskellige tarmcelletyper, herunder epitel-, stromal-, blod-, muskel- og immunceller samt enteriske neuroner og glia. Derfor anser vi det for at være en værdifuld ressource til at studere sammensætningen af mave-tarmkanalen i sundhed og sygdom ved hjælp af zebrafisken.
Introduction
Mave-tarmkanalen (GI) er et komplekst system, der spiller en afgørende rolle i den generelle sundhed og trivsel. Det er ansvarligt for fordøjelsen og absorptionen af næringsstoffer samt eliminering af affaldsprodukter 1,2. GI-kanalen består af flere celletyper, herunder epitelceller, glatte muskelceller, immunceller og det enteriske nervesystem (ENS), som kommunikerer tæt sammen for at regulere og opretholde korrekt tarmfunktion 3,4,5. Defekter i udviklingen af mave-tarmkanalen kan have vidtrækkende virkninger på forskellige aspekter såsom næringsstofabsorption, mikrobiotasammensætning, tarm-hjerneaksen og ENS, hvilket fører til flere enteriske neuromuskulære lidelser, såsom Hirschsprungs sygdom og kronisk intestinal pseudoobstruktion 6,7. Disse lidelser er karakteriseret ved alvorlig tarmdysmotilitet forårsaget af ændringer i forskellige nøgleceller, såsom de interstitielle celler i Cajal, glatte muskelceller og ENS 6,8,9. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for GI-udvikling og dysfunktion, stadig dårligt forstået.
Zebrafisken er en værdifuld modelorganisme til at studere GI-udvikling og dysfunktion på grund af dens hurtige embryonale udvikling, gennemsigtighed under embryonale og larvestadier og genetisk trækbarhed 10,11,12,13,14. Talrige transgene zebrafiskelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner, er tilgængelige. Et eksempel på en sådan linje er tg (phox2bb: GFP) zebrafisk, der almindeligvis anvendes til at studere ENS, da alle phox2bb + celler, herunder enteriske neuroner, er mærket15,16. Her præsenterer vi ved hjælp af zebrafisklinjen tg (phox2bb: GFP) en metode til tarmisolering af 5 dage efter befrugtning (dpf) larver til enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) analyse (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi en metode til isolering og dissociation af tarmen hos 5 dpf zebrafisklarver ved hjælp af FACS. Med denne metode blev forskellige tarmcelletyper med succes indsamlet og analyseret af scRNA-seq ved hjælp af 10x Genomics Chromium-platformen. Vi valgte zebrafisklinjen tg(phox2bb:GFP), da vi ønskede en indikation af, at levedygtige ENS-celler også ville blive isoleret (figur 2D). Det er dog vigtigt at bemærke, at denne metode let kan udvides til andre zebrafiskel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af venner af Sophia Foundation (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
