Summary
Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
Abstract
Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l'importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell'intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.
Introduction
Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell'assorbimento dei nutrienti, nonché dell'eliminazione dei prodotti di scarto 1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale 3,4,5. I difetti nello sviluppo del tratto gastrointestinale possono avere effetti di vasta portata su vari aspetti come l'assorbimento dei nutrienti, la composizione del microbiota, l'asse intestino-cervello e l'ENS, portando a diversi disturbi neuromuscolari enterici, come la malattia di Hirschsprung e la pseudo-ostruzione intestinale cronica 6,7. Questi disturbi sono caratterizzati da una grave dismotilità intestinale causata da alterazioni in varie cellule chiave, come le cellule interstiziali di Cajal, le cellule muscolari lisce e l'ENS 6,8,9. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale sono ancora poco compresi.
Il pesce zebra è un prezioso organismo modello per lo studio dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale grazie al suo rapido sviluppo embrionale, alla trasparenza durante le fasi embrionali e larvali e alla trattabilità genetica 10,11,12,13,14. Sono disponibili numerose linee di zebrafish transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Un esempio di tale linea è il pesce zebra tg(phox2bb:GFP), comunemente usato per studiare l'ENS, poiché tutte le cellule phox2bb+, compresi i neuroni enterici, sono marcate15,16. Qui, utilizzando la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale di larve 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) (Figura 1).
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Protocol
Tutti gli allevamenti e gli esperimenti di zebrafish sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali dell'Erasmus MC e la legislazione sul benessere degli animali. L'uso di larve di pesce zebra a 5 giorni dalla fecondazione rientra nella categoria degli esperimenti che non richiedono un'approvazione etica formale, come delineato dalle normative olandesi.
1. Ottenimento di 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) wildtype e larve di tg (phox2bb: GFP)
- Avviare l'allevamento di zebrafish wildtype e raccogliere 50 uova in terreno E3 tamponato con HEPES (di seguito denominato E3) in una capsula di Petri da 15 cm. Utilizzare questi pesci come controllo negativo per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FAC).
- Impostare l'allevamento di pesce zebra tg(phox2bb:GFP) e raccogliere circa 300 uova in E3 in una capsula di Petri da 15 cm.
- Conservare gli ovuli fecondati in E3 (massimo 50 uova/piatto) con un ciclo di luce/buio di 14 ore/10 ore, in un'incubatrice a 28,5 °C.
- A 1 dpf, rimuovere gli ovuli non fecondati e lasciare che quelli fecondati si sviluppino fino a 5 dpf.
- Selezionare le larve di tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.
2. Dissociazione di larve intere di tipo selvatico
- Anestetizzare 5 larve dpf con lo 0,016% di tricaina.
- Tritare 30 zebrafish in piccoli pezzi usando una lama di rasoio in una capsula di Petri contenente 1 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA.
- Trasferire il pesce zebra tritato in una provetta per microcentrifuga con un volume totale di 2 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA e lasciare sul ghiaccio per 3 ore. Pipettare su e giù con una pipetta P1000 ogni ora per stimolare la dissociazione.
3. Isolamento intestinale
- Posizionare 6-10 larve da 5 dpf anestetizzate con tricaina allo 0,016% in fila, su una piastra di agarosio all'1,8% (0,45 g di agarosio in 25 mL di E3), sotto un microscopio da dissezione
- Metti uno spillo per insetti nella testa del pesce zebra.
- Rimuovere tutto l'E3 rimanente utilizzando un fazzoletto.
- Isolare l'intestino usando un altro spillo per insetti, senza disturbare gli altri organi. Assicurarsi che il tuorlo sia stato rimosso (Figura supplementare S1A).
- Una volta isolato, ispezionare l'intestino e rimuovere tutto il materiale non intestinale (ad es. pelle, grasso, fegato) se necessario.
- Raccogliere l'intestino con una pinzetta e metterlo in una provetta per microcentrifuga, contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), su ghiaccio.
NOTA: È necessario isolare un minimo di 244 intestini, mantenendo il tempo totale di dissezione a 3 ore. Questo è fattibile con due persone che lavorano in parallelo.
4. Dissociazione intestinale
- Subito dopo la dissezione di tutti gli intestini, centrifugare la provetta per microcentrifuga alla massima velocità (13.800 × g) per 30 s.
- Rimuovere il PBS/10% FCS ma lasciarne una piccola quantità (~100 μL) per evitare che l'intestino si secchi. Aggiungere 500 μL di papaina 2,17 mg/mL in HBSS contenente CaCl2 e MgCl2 per dissociare le cellule.
- Attivare la papaina con 2,5 μL di cisteina (1 M).
- Incubare le budella a bagnomaria a 37 °C per 10 min. Pipettare su e giù a metà (dopo 5 minuti) per stimolare la digestione enzimatica dei tessuti.
- Trasferire le cellule in una provetta FACS utilizzando un filtro cellulare da 35 μm, prebagnato con 0,5 mL di PBS/10% FCS.
- Lavare il filtro aggiungendo un totale di 2 mL di PBS/10% FCS con incrementi di 0.5 mL.
- Centrifugare a 700 × g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 300 μL di PBS/10% FCS.
- Aggiungere 1 μg/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per marcare le cellule morte (1:1.000) e incubare per 5 minuti per consentirne l'esclusione durante la FACS.
5. Arricchimento FACS
- Utilizzare il campione wildtype per impostare le porte della popolazione cellulare ordinata registrando 3.000 cellule sul citometro a flusso (Figura supplementare S1B-E).
- Utilizzare un ugello da 100 μm, impostare la precisione di ordinamento sulla purezza e inserire la provetta di raccolta contenente 200 μL di PBS/5% FCS nella macchina FACS.
- Caricare la sospensione cellulare dell'intestino e selezionare le singole cellule vive (DAPI-negative) nella provetta di raccolta (Figura 2C), escludendo i doppietti (Figura 2B) e le cellule morte (Figura 2C).
NOTA: Per il pesce zebra tg(phox2bb), la proporzione di cellule GFP+ viene controllata solo come riferimento, poiché tutte le singole cellule vive vengono ordinate. - Tenere la provetta di raccolta su ghiaccio dopo lo smistamento delle cellule.
- Contare la sospensione cellulare con un emocitometro, incluso un controllo di vitalità con blu di tripano. Se la fattibilità è almeno dell'80%, continuare con il passaggio successivo.
- Le cellule sono ora pronte per l'elaborazione per scRNAseq (cioè la piattaforma 10x Genomics Chromium). Utilizzare circa 20.000 cellule per campione.
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Representative Results
Con questo protocollo, abbiamo ottenuto con successo l'isolamento e la dissociazione di interi intestini da 5 larve dpf. Utilizzando la papaina come enzima di dissociazione, abbiamo migliorato significativamente la vitalità cellulare, consentendo la cattura di 46.139 eventi che coinvolgono singole cellule vitali (6,4% di tutte le cellule) su 244 intestini isolati (Figura 2A). Le larve intere di tipo selvatico sono state utilizzate come controllo per garantire che il processo di selezione fosse ottimizzato, consentendo un'efficace identificazione e selezione delle cellule. Le larve intere potrebbero essere utilizzate in quanto selezioniamo solo per singole cellule vive (Figura supplementare S1B-E). Tutte le cellule intestinali selezionate sono state successivamente inviate alla piattaforma scRNA seq. In totale, sono state sequenziate 9.858 cellule con letture medie per cella di 21.106. Per l'analisi scRNA-seq, abbiamo utilizzato Seurat V317. In totale, sono stati identificati 48 cluster che rappresentano 12 diversi tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia18.
Figura 1: Disegno sperimentale per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula di budella isolate di zebrafish. Abbreviazioni: FACS = fluorescenza-activated cell sorting; scRNA-seq = sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating per selezionare singole cellule vive dall'intestino del pesce zebra. (A) Analisi post-ordinamento con gating delle dimensioni FCS/SSC. (B) Discriminazione del doppietto. (C) Gating a cellule vive/morte e popolazione selezionata. (D) Cellule Phox2bb:GFP+ presenti nella popolazione viva selezionata. In ogni pannello viene mostrata la percentuale di celle gated. Abbreviazioni: FCS-A = area di dispersione diretta-picco; SSC-A = area di dispersione-picco laterale; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; GFP = proteina fluorescente verde; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: Isolamento intestinale e strategia di gating per selezionare singole cellule vive da intere larve di pesce zebra wildtype. (A) Immagine in campo chiaro dell'isolamento intestinale da 5 giorni dopo la fecondazione di larve di pesce zebra. La linea rossa indica la linea di dissezione. (B) Analisi post-sort, che mostra tutte le celle con gating delle dimensioni FCS/SSC. (C) Selezione della singoletto. (D) Regolazione DAPI. (E) Phox2bb:GFP+ gating. La percentuale di celle gated viene mostrata in ogni pannello. Abbreviazioni: FCS-A = area di dispersione diretta-picco; SSC-A = area di dispersione-picco laterale; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; GFP = proteina fluorescente verde; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Qui, presentiamo un metodo per l'isolamento e la dissociazione dell'intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un'indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che questo metodo può essere facilmente esteso ad altre linee di zebrafish di interesse, poiché abbiamo utilizzato il gating phox2bb solo per valutare la vitalità neuronale e non per selezionare una specifica popolazione cellulare. Dal momento che abbiamo deciso di utilizzare un approccio imparziale per raccogliere tutte le cellule intestinali presenti a 5 dpf, il criterio di selezione si basa principalmente sull'identificazione di singole cellule vive. Questo è anche il motivo alla base dell'uso di larve intere per stabilire una strategia di gating affidabile e coerente. Considerando il lavoro necessario per isolare le singole viscere, diventa poco pratico isolare più intestini per fungere da controllo negativo, entro il periodo di tempo stabilito per questo esperimento. Pertanto, pur riconoscendo che i tipi di cellule delle larve intere differiscono da quelli che si trovano nell'intestino e che sono stati utilizzati anche metodi di dissociazione distinti, è interessante notare che la strategia di gating applicata per ordinare le cellule intestinali può essere inizialmente convalidata utilizzando larve intere, poiché eravamo interessati solo a valutare la vitalità cellulare.
Per eseguire scRNA-seq, un passaggio fondamentale in questo protocollo sarebbe quello di isolare un numero sufficiente di cellule vitali (~20.000 cellule). Allo stesso tempo, il tempo trascorso per l'isolamento intestinale dovrebbe essere mantenuto il più breve possibile per evitare un effetto dannoso sulla vitalità cellulare. Precedenti rapporti incentrati sull'intestino delle larve di zebrafish impiegavano accutasi o tripsina per la dissociazione cellulare 19,20,21. Tuttavia, mentre entrambi gli enzimi di dissociazione sono stati in grado di isolare un numero sufficiente di cellule vitali per scRNA-seq, l'accutasi non ha permesso la cattura delle cellule neuronali enteriche19,20. La tripsina, tuttavia, ha catturato prevalentemente le cellule epiteliali, producendo solo un basso numero di cellule neuronali enteriche21. La papaina è comunemente riconosciuta per la sua delicatezza, che può essere particolarmente utile per preservare l'integrità neuronale enterica22. I nostri risultati hanno mostrato che la papaina è effettivamente efficace nel mantenere la vitalità delle cellule neuronali, confermando le precedenti applicazioni in cui questo enzima è stato utilizzato per digerire la retina e il cervello adulti del pesce zebra23,24. Tuttavia, è interessante ricordare che anche con la papaina, la vitalità cellulare dopo l'isolamento intestinale e la dissociazione era solo del 6,4%. Ciò suggerisce che la successiva fase FACS è, quindi, cruciale per selezionare le cellule vitali. Tali risultati possono essere considerati un limite, in particolare quando si ha a che fare con cellule di interesse scarse e difficili da catturare.
Gli studi futuri dovrebbero concentrarsi su nuovi metodi di dissociazione per migliorare la vitalità cellulare durante il protocollo di isolamento. Una volta aumentato, questo metodo diventa fattibile per selezionare le cellule reporter-positive ed eseguire scRNA-seq su specifici tipi di cellule intestinali. Tuttavia, il metodo qui presentato consente la cattura di un numero sufficiente di cellule vitali per la successiva identificazione di diversi tipi di cellule all'interno dell'intestino, come cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari, immunitarie e persino neuroni enterici e glia, che non sono stati catturati prima in questa fase cellulare utilizzando approcci simili. Poiché la capacità di isolare e analizzare questi diversi tipi di cellule è essenziale per ottenere maggiori informazioni sullo sviluppo e la disfunzione gastrointestinale, riteniamo che questo metodo sia particolarmente prezioso, in quanto fornisce un approccio affidabile per studiare la composizione intestinale utilizzando il pesce zebra, come organismo modello.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Amici di Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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