Summary
هنا ، نصف طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ، لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
Abstract
يؤدي الجهاز الهضمي (GI) مجموعة من الوظائف الأساسية للحياة. يمكن أن تؤدي العيوب الخلقية التي تؤثر على تطورها إلى اضطرابات عصبية عضلية معوية ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب للحصول على خلايا حية قابلة للحياة والتي يمكن استخدامها لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). يعتمد هذا البروتوكول على التشريح اليدوي لأمعاء الزرد ، يليه التفكك الأنزيمي مع غراء. بعد ذلك ، يتم تقديم الخلايا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، ويتم جمع الخلايا القابلة للحياة من أجل scRNA-seq. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من تحديد أنواع الخلايا المعوية المختلفة بنجاح ، بما في ذلك الخلايا الظهارية واللحمية والدم والعضلات والخلايا المناعية ، وكذلك الخلايا العصبية المعوية والدبقية. لذلك ، نعتبره موردا قيما لدراسة تكوين الجهاز الهضمي في الصحة والمرض ، باستخدام الزرد.
Introduction
الجهاز الهضمي (GI) هو نظام معقد يلعب دورا حيويا في الصحة العامة والرفاهية. وهي مسؤولة عن هضم وامتصاص العناصر الغذائية ، وكذلك القضاء على النفايات 1,2. يتكون الجهاز الهضمي من أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الظهارية وخلايا العضلات الملساء والخلايا المناعية والجهاز العصبي المعوي (ENS) ، والتي تتواصل بشكل وثيق معا لتنظيم وظيفة الأمعاء المناسبة والحفاظ عليها3،4،5. يمكن أن يكون للعيوب في تطور الجهاز الهضمي آثار بعيدة المدى على جوانب مختلفة مثل امتصاص العناصر الغذائية ، وتكوين الجراثيم ، ومحور الأمعاء والدماغ ، و ENS، مما يؤدي إلى العديد من الاضطرابات العصبية العضلية المعوية ، مثل مرض هيرشسبرونغ وانسداد الأمعاء المزمن 6,7. تتميز هذه الاضطرابات بخلل شديد في حركة الأمعاء ناتج عن تغيرات في الخلايا الرئيسية المختلفة ، مثل الخلايا الخلالية ل Cajal وخلايا العضلات الملساء و ENS6،8،9. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.
يعتبر الزرد كائنا نموذجيا قيما لدراسة تطور الجهاز الهضمي واختلاله الوظيفي بسبب تطوره الجنيني السريع ، والشفافية خلال المراحل الجنينية واليرقات ، وقابلية السحب الوراثية10،11،12،13،14. تتوفر العديد من خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية. مثال على هذا الخط هو سمك الزرد tg (phox2bb: GFP) ، الذي يشيع استخدامه لدراسة ENS، حيث يتم تصنيف جميع خلايا phox2bb + ، بما في ذلك الخلايا العصبية المعوية ،15,16. هنا ، باستخدام خط الزرد tg (phox2bb: GFP) ، نقدم طريقة لعزل الأمعاء لمدة 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) يرقات لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع عمليات تربية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لتشريع Erasmus MC ورعاية. يندرج استخدام يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ضمن فئة التجارب التي لا تتطلب موافقة أخلاقية رسمية ، على النحو المبين في اللوائح الهولندية.
1. الحصول على 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) من النوع البري ويرقات tg (phox2bb: GFP)
- قم بإعداد تربية الزرد من النوع البري وجمع 50 بيضة في وسط E3 المخزن HEPES (المشار إليه فيما يلي باسم E3) في طبق بتري 15 سم. استخدم هذه الأسماك كعنصر تحكم سلبي لفرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACs).
- قم بإعداد تربية سمك الزرد tg (phox2bb: GFP) وجمع ما يقرب من 300 بيضة في E3 في طبق بتري 15 سم.
- احتفظ بالبيض المخصب في E3 (بحد أقصى 50 بيضة / طبق) في دورة ضوء / مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات ، في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية.
- عند 1 dpf ، قم بإزالة البيض غير المخصب واترك البيض المخصب يتطور إلى 5 dpf.
- حدد يرقات tg (phox2bb: GFP) عند 1 dpf.
2. تفكك اليرقات الكاملة من النوع البري
- تخدير 5 يرقات dpf مع 0.016 ٪ تريكايين.
- قم بتقطيع 30 سمكة زرد إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة في طبق بتري يحتوي على 1 مل من محلول 10x trypsin-EDTA.
- انقل سمك الزرد المفروم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم إجمالي 2 مل من محلول 10x trypsin-EDTA واتركه على الثلج لمدة 3 ساعات. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 كل ساعة لتحفيز التفكك.
3. عزل الأمعاء
- ضع 6-10 5 يرقات dpf مخدرة بنسبة 0.016٪ تريكايين على التوالي ، على صفيحة أغاروز 1.8٪ (0.45 جم من الأغاروز في 25 مل من E3) ، تحت مجهر تشريح
- ضع دبوس حشرة واحد في رأس الزرد.
- قم بإزالة كل ما تبقى من E3 باستخدام منديل.
- عزل الأمعاء باستخدام دبوس حشرة آخر ، دون إزعاج أي أعضاء أخرى. تأكد من إزالة صفار البيض (الشكل التكميلي S1A).
- بمجرد عزلها ، افحص الأمعاء وقم بإزالة جميع المواد غير المعوية (مثل الجلد والدهون والكبد) إذا لزم الأمر.
- جمع الأمعاء مع ملاقط ووضعها في أنبوب الطرد المركزي ، التي تحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 10 ٪ مصل العجل الجنيني (FCS) ، على الجليد.
ملاحظة: يجب عزل ما لا يقل عن 244 أمعاء ، مع الحفاظ على إجمالي وقت التشريح عند 3 ساعات. هذا ممكن مع شخصين يعملان بالتوازي.
4. تفكك القناة الهضمية
- مباشرة بعد تشريح جميع الأمعاء ، يقوم جهاز الطرد المركزي بأنبوب الطرد المركزي الدقيق بأقصى سرعة (13800 × جم) لمدة 30 ثانية.
- قم بإزالة PBS / 10٪ FCS ولكن اترك كمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) لمنع الأمعاء من الجفاف. أضف 500 ميكرولتر من غراء 2.17 مجم / مل في HBSS يحتوي على CaCl2 و MgCl2 ، لفصل الخلايا.
- تنشيط غراء مع 2.5 ميكرولتر من السيستين (1 م).
- احتضان الأحشاء في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ماصة صعودا وهبوطا في منتصف الطريق (بعد 5 دقائق) لتحفيز هضم الأنسجة الأنزيمية.
- نقل الخلايا إلى أنبوب FACS باستخدام مصفاة خلية 35 ميكرومتر ، مبللة مسبقا ب 0.5 مل من PBS / 10٪ FCS.
- اغسل المصفاة بإضافة إجمالي 2 مل من PBS / 10٪ FCS في خطوات 0.5 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS / 10٪ FCS.
- أضف 1 ميكروغرام / مل من 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لتسمية الخلايا الميتة (1: 1000) واحتضانها لمدة 5 دقائق للسماح باستبعادها أثناء FACS.
5. تخصيب نظام مراقبة الأصول الميدانية
- استخدم عينة النوع البري لتعيين بوابات مجموعة الخلايا التي تم فرزها عن طريق تسجيل 3000 خلية على مقياس التدفق الخلوي (الشكل التكميلي S1B-E).
- استخدم فوهة 100 ميكرومتر ، واضبط دقة الفرز على النقاء ، وضع أنبوب التجميع الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من PBS / 5٪ FCS ، في آلة FACS.
- قم بتحميل تعليق الخلية في الأمعاء وفرز الخلايا الحية (سلبية DAPI) ، والخلايا المفردة في أنبوب التجميع (الشكل 2C) ، عن طريق استبعاد الخلايا المزدوجة (الشكل 2B) والخلايا الميتة (الشكل 2C).
ملاحظة: بالنسبة لسمك الزرد tg (phox2bb) ، يتم فحص نسبة خلايا GFP + فقط للرجوع إليها ، حيث يتم فرز جميع الخلايا الحية الفردية. - احتفظ بأنبوب التجميع على الثلج بعد فرز الخلايا.
- عد تعليق الخلية باستخدام مقياس الدم ، بما في ذلك فحص الجدوى باستخدام التريبان الأزرق. إذا كانت الجدوى 80٪ على الأقل ، فتابع الخطوة التالية.
- الخلايا جاهزة الآن لمعالجة scRNAseq (أي منصة الكروم الجينومية 10x). استخدم ما يقرب من 20000 خلية لكل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع هذا البروتوكول ، حققنا عزلا ناجحا وتفككا للأمعاء بأكملها من 5 يرقات dpf. باستخدام غراء كإنزيم تفكك ، عززنا بشكل كبير صلاحية الخلية ، مما مكن من التقاط 46139 حدثا يتضمن خلايا مفردة قابلة للحياة (6.4٪ من جميع الخلايا) من أصل 244 أمعاء معزولة (الشكل 2 أ). تم استخدام اليرقات الكاملة من النوع البري كعنصر تحكم لضمان تحسين عملية الفرز ، مما يتيح التعرف الفعال على الخلايا وفرزها. يمكن استخدام اليرقات الكاملة لأننا نفرز فقط الخلايا الحية المفردة (الشكل التكميلي S1B-E). تم تقديم جميع الخلايا المعوية المصنفة لاحقا إلى منصة scRNA seq. في المجموع ، تم تسلسل 9,858 خلية بمتوسط قراءات لكل خلية يبلغ 21,106. لتحليل scRNA-seq ، استخدمنا Seurat V317. في المجموع ، تم تحديد 48 مجموعة تمثل 12 نوعا مختلفا من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الظهارية واللحمية والدم والعضلات والخلايا المناعية ، بالإضافة إلى الخلايا العصبية المعوية والدبقية18.
الشكل 1: تصميم تجريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأمعاء الزرد المعزولة. الاختصارات: FACS = فرز الخلايا المنشطة بالتألق ؛ scRNA-seq = تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية البوابات لفرز الخلايا الحية المفردة من أمعاء الزرد. (أ) تحليل ما بعد الفرز باستخدام بوابات بحجم FCS / SSC. (ب) التمييز المزدوج. ج: بوابات الخلايا الحية / الميتة والسكان المصنفين. (د) Phox2bb: خلايا GFP+ الموجودة في المجتمع الحي المصنف. في كل لوحة ، يتم عرض النسبة المئوية للخلايا المسورة. الاختصارات: FCS-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: عزل الأمعاء واستراتيجية البوابات لفرز الخلايا الحية المفردة من يرقات الزرد البرية الكاملة. (أ) صورة برايتفيلد لعزل الأمعاء من 5 أيام بعد الإخصاب يرقات الزرد. يشير الخط الأحمر إلى خط التشريح. (B) تحليل ما بعد الفرز ، يظهر جميع الخلايا ذات بوابات بحجم FCS / SSC. (ج) الاختيار الفردي. (د) بوابات DAPI. (ه) Phox2bb: بوابات GFP +. يتم عرض النسبة المئوية للخلايا المسورة في كل لوحة. الاختصارات: FCS-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، نقدم طريقة لعزل وتفكك أمعاء 5 يرقات الزرد dpf باستخدام FACS. باستخدام هذه الطريقة ، تم جمع أنواع مختلفة من الخلايا المعوية وتحليلها بنجاح بواسطة scRNA-seq ، باستخدام منصة 10x Genomics Chromium. اخترنا خط الزرد tg (phox2bb: GFP) ، حيث أردنا مؤشرا على أن خلايا ENS القابلة للحياة ستكون معزولة أيضا (الشكل 2D). ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه الطريقة يمكن أن تمتد بسهولة إلى خطوط اهتمام الزرد الأخرى ، حيث استخدمنا فقط بوابة phox2bb لتقييم صلاحية الخلايا العصبية ، وليس لاختيار مجموعة خلايا معينة. نظرا لأننا قررنا استخدام نهج غير متحيز لجمع جميع خلايا الأمعاء الموجودة عند 5 dpf ، فإن معيار الفرز يتوقف بشكل أساسي على تحديد الخلايا الحية الفردية. هذا هو أيضا السبب وراء استخدام اليرقات الكاملة لإنشاء استراتيجية بوابات موثوقة ومتسقة. بالنظر إلى المخاض المتضمن في عزل الأمعاء الفردية ، يصبح من غير العملي عزل المزيد من الأمعاء لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي ، خلال الإطار الزمني المحدد لهذه التجربة. لذلك ، بينما نعترف بأن أنواع الخلايا من اليرقات بأكملها تختلف عن تلك الموجودة في الأمعاء ، وحتى طرق التفكك المميزة تم استخدامها ، فمن الجدير بالذكر أن استراتيجية البوابات المطبقة لفرز الخلايا المعوية يمكن التحقق من صحتها في البداية باستخدام يرقات كاملة ، حيث كنا مهتمين فقط بتقييم صلاحية الخلية.
لتنفيذ scRNA-seq ، ستكون الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي عزل عدد كاف من الخلايا القابلة للحياة (~ 20000 خلية). في الوقت نفسه ، يجب أن يظل الوقت المستغرق في عزل الأمعاء قصيرا قدر الإمكان لتجنب التأثير الضار على صلاحية الخلية. استخدمت التقارير السابقة التي تركز على أمعاء يرقات الزرد أكوتاز أو التربسين لتفكك الخلايا19،20،21. ومع ذلك ، في حين أن كلا إنزيمي التفكك كانا قادرين على عزل ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة ل scRNA-seq ، لم يسمح accutase بالتقاط الخلايا العصبية المعوية19,20. ومع ذلك ، فإن التربسين يلتقط في الغالب الخلايا الظهارية ، مما ينتج عنه عدد قليل فقط من الخلايا العصبية المعوية21. يعرف غراء عادة بلطفه ، والذي يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص للحفاظ على سلامة الخلايا العصبية المعوية22. أظهرت نتائجنا أن غراء فعال بالفعل في الحفاظ على صلاحية الخلايا العصبية ، مما يؤكد التطبيقات السابقة التي تم فيها استخدام هذا الإنزيم لهضم شبكية العين البالغة الزرد والدماغ23,24. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه حتى مع غراء ، كانت صلاحية الخلية بعد عزل الأمعاء وتفككها 6.4٪ فقط. وهذا يشير إلى أن الخطوة اللاحقة لنظام مراقبة الأصول الميدانية حاسمة لاختيار الخلايا القابلة للحياة. يمكن اعتبار هذه النتائج قيدا خاصة عند التعامل مع الخلايا النادرة والصعبة للقبض عليها.
يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على طرق التفكك الجديدة لتحسين صلاحية الخلية أثناء بروتوكول العزل. بمجرد زيادتها ، تصبح هذه الطريقة مجدية لفرز الخلايا الإيجابية للمراسلين وإجراء scRNA-seq على أنواع معينة من الخلايا المعوية. ومع ذلك ، فإن الطريقة المعروضة هنا تسمح بالتقاط ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة للتعرف لاحقا على أنواع الخلايا المختلفة داخل الأمعاء ، مثل الخلايا الظهارية واللحمية والدم والعضلات والخلايا المناعية وحتى الخلايا العصبية المعوية والدبقية ، والتي لم يتم التقاطها من قبل في هذه المرحلة الخلوية باستخدام طرق مماثلة. نظرا لأن القدرة على عزل وتحليل هذه الأنواع المختلفة من الخلايا أمر ضروري للحصول على مزيد من الأفكار حول تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي ، فإننا نعتبر هذه الطريقة ذات قيمة خاصة ، لأنها توفر نهجا موثوقا به لدراسة تكوين الأمعاء باستخدام الزرد ، ككائن نموذجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل أصدقاء مؤسسة صوفيا (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
