Summary
Здесь мы опишем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для анализа секвенирования РНК одной клетки.
Abstract
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) выполняет ряд функций, необходимых для жизни. Врожденные дефекты, влияющие на его развитие, могут привести к нервно-мышечным расстройствам кишечника, что подчеркивает важность понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для получения живых, жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Этот протокол основан на ручном рассечении кишечника данио-рерио с последующей ферментативной диссоциацией папаином. Затем клетки подвергают флуоресцентно-активированной клеточной сортировке, а жизнеспособные клетки отбирают для scRNA-seq. С помощью этого метода мы смогли успешно идентифицировать различные типы кишечных клеток, включая эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные и иммунные клетки, а также кишечные нейроны и глию. Поэтому мы считаем его ценным ресурсом для изучения состава желудочно-кишечного тракта в норме и при заболеваниях, используя рыбок данио.
Introduction
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) — это сложная система, которая играет жизненно важную роль в общем здоровье и благополучии. Он отвечает за переваривание и усвоение питательных веществ, а также за выведение продуктов жизнедеятельности 1,2. Желудочно-кишечный тракт состоит из нескольких типов клеток, включая эпителиальные клетки, гладкомышечные клетки, иммунные клетки и энтеральную нервную систему (ЭНС), которые тесно взаимодействуют друг с другом, регулируя и поддерживая надлежащую функцию кишечника 3,4,5. Дефекты развития желудочно-кишечного тракта могут иметь далеко идущие последствия для различных аспектов, таких как всасывание питательных веществ, состав микробиоты, ось кишечник-мозг и ЭНС, приводя к ряду кишечных нервно-мышечных заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга и хроническая кишечная псевдообструкция 6,7. Эти расстройства характеризуются тяжелой дисмоторикой кишечника, вызванной изменениями в различных ключевых клетках, таких как интерстициальные клетки Кахаля, гладкомышечные клетки и ENS 6,8,9. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта, до сих пор плохо изучены.
Рыбка данио-рерио является ценным модельным организмом для изучения развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта благодаря своему быстрому эмбриональному развитию, прозрачности на эмбриональной и личиночной стадиях, а также генетической трактовке 10,11,12,13,14. Существуют многочисленные трансгенные линии данио-рерио, экспрессирующие флуоресцентные белки. Примером такой линии является рыбка данио-рерио tg(phox2bb:GFP), обычно используемая для изучения ЭНС, поскольку все клетки phox2bb+, включая энтеральные нейроны, помечены15,16. Здесь, используя линию данио-рерио tg(phox2bb:GFP), мы представляем метод кишечной изоляции личинок через 5 дней после оплодотворения (dpf) для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все разведение рыбок данио и эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами Erasmus MC и законодательством о благополучии животных. Использование личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения подпадает под категорию экспериментов, которые не требуют формального этического одобрения, как указано в голландских правилах.
1. Получение личинок дикого типа и tg(phox2bb:GFP) через 5 дней после оплодотворения (dpf)
- Наладьте разведение рыбок данио-рерио дикого типа и соберите 50 яиц в среде E3 с буфером HEPES (далее E3) в чашке Петри диаметром 15 см. Используйте этих рыб в качестве отрицательного контроля для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FAC).
- Наладьте разведение данио-рерио tg(phox2bb:GFP) и соберите около 300 икринок в E3 в чашке Петри диаметром 15 см.
- Храните оплодотворенные яйца в E3 (максимум 50 яиц в чашке) в течение 14 ч/10 ч светлый/темный, в инкубаторе при температуре 28,5 °C.
- При 1 dpf удалите неоплодотворенные яйцеклетки и дайте оплодотворенным развиться до 5 dpf.
- Выберите личинки tg(phox2bb:GFP) при 1 dpf.
2. Диссоциация целых личинок дикого типа
- Обезболивайте личинки 5 dpf 0,016% трикаином.
- Измельчите 30 рыбок данио на мелкие кусочки с помощью лезвия бритвы в чашке Петри, содержащей 1 мл 10-кратного раствора трипсина-ЭДТА.
- Переложите измельченных данио-рерио в микроцентрифужную пробирку общим объемом 2 мл 10-кратного раствора трипсина-ЭДТА и оставьте на льду на 3 ч. Пипетка вверх и вниз пипеткой P1000 каждый час, чтобы стимулировать диссоциацию.
3. Изоляция кишечника
- Помещают 6-10 личинок 5 dpf, обезболинных 0,016% трикаином, в ряд, на 1,8% агарозную пластину (0,45 г агарозы в 25 мл Е3), под микроскопом для вскрытия
- Вставьте одну булавку для насекомых в голову рыбки данио.
- Удалите все оставшиеся E3 с помощью салфетки.
- Изолируйте кишечник с помощью другого булавки от насекомых, не потревожив другие органы. Убедитесь, что желток удален (дополнительный рисунок S1A).
- После изоляции осмотрите кишечник и при необходимости удалите весь некишечный материал (например, кожу, жир, печень).
- Соберите кишечник пинцетом и поместите его в микроцентрифужную пробирку, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS) с 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует изолировать минимум 244 кишечника, сохраняя общее время вскрытия 3 ч. Это возможно при параллельной работе двух человек.
4. Диссоциация кишечника
- Сразу после вскрытия всех кишечников центрифугировать микроцентрифужную пробирку на полной скорости (13 800 × г) в течение 30 с.
- Удалите PBS/10% FCS, но оставьте небольшое количество (~100 мкл), чтобы предотвратить высыхание кишечника. Добавьте 500 мкл папаина 2,17 мг/мл в HBSS, содержащий CaCl2 и MgCl2, для диссоциации клеток.
- Активируйте папаин 2,5 мкл цистеина (1 М).
- Кишки инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 мин. Пипетка вверх и вниз на полпути (через 5 минут) для стимуляции ферментативного переваривания тканей.
- Пересадите клетки в пробирку FACS с помощью ситечка для клеток 35 мкм, предварительно смочив 0,5 мл PBS/10% FCS.
- Промойте ситечко, добавив в общей сложности 2 мл PBS/10% FCS с шагом 0,5 мл.
- Центрифугу при 700 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл PBS/10% FCS.
- Добавьте 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для мечения мертвых клеток (1:1000) и инкубируйте в течение 5 мин, чтобы обеспечить их исключение во время FACS.
5. Обогащение FACS
- Используйте образец дикого типа, чтобы установить ворота отсортированной клеточной популяции, записав 3000 клеток на проточный цитометр (дополнительный рисунок S1B-E).
- Используйте сопло 100 мкм, установите точность сортировки по чистоте и поместите сборную пробирку, содержащую 200 мкл PBS/5% FCS, в машину FACS.
- Загрузите клеточную суспензию кишечника и отсортируйте живые (DAPI-отрицательные), одиночные клетки в пробирку для сбора (Рисунок 2C), исключив дублеты (Рисунок 2B) и мертвые клетки (Рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для рыбок данио-рерио tg(phox2bb) пропорция клеток GFP+ проверяется только для справки, так как все одиночные живые клетки сортируются. - После сортировки клеток держите сборную пробирку на льду.
- Подсчитывают клеточную суспензию гемоцитометром, включая проверку жизнеспособности трипановым синим. Если жизнеспособность составляет не менее 80%, переходите к следующему шагу.
- Теперь клетки готовы к обработке scRNAseq (т.е. 10-кратной платформы Genomics Chromium). Используйте примерно 20 000 клеток на образец.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью этого протокола мы добились успешной изоляции и диссоциации всего кишечника от 5 личинок dpf. Используя папаин в качестве фермента диссоциации, мы значительно повысили жизнеспособность клеток, позволив зафиксировать 46 139 событий, связанных с одиночными жизнеспособными клетками (6,4% всех клеток) из 244 изолированных кишок (рис. 2A). Целые личинки дикого типа использовались в качестве контроля, чтобы обеспечить оптимизацию процесса сортировки, что позволило эффективно идентифицировать и сортировать клетки. Можно использовать целых личинок, так как мы сортируем только живые, одиночные клетки (дополнительный рисунок S1B-E). Все отсортированные клетки кишечника впоследствии были отправлены на платформу scRNA seq. В общей сложности было секвенировано 9 858 клеток со средним значением считывания на клетку 21 106. Для анализа scRNA-seq мы использовали Seurat V317. В общей сложности было идентифицировано 48 кластеров, представляющих 12 различных типов клеток, включая эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные и иммунные клетки, а также энтеральные нейроны иглию 18.
Рисунок 1: Дизайн эксперимента по секвенированию одноклеточной РНК изолированных кишок рыбок данио. Сокращения: FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; scRNA-seq = секвенирование РНК одной клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия стробирования для сортировки живых одиночных клеток из кишечника рыбки данио. (A) Анализ после сортировки с помощью стробирования FCS/SSC по размеру. (Б) Дублетная дискриминация. (C) Стробирование живых/мертвых клеток и отсортированная популяция. (D) Клетки Phox2bb:GFP+, присутствующие в отсортированной живой популяции. В каждой панели отображается процент ячеек стробирования. Сокращения: FCS-A = область прямого рассеяния; SSC-A = площадь бокового пика рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; GFP = зеленый флуоресцентный белок; FITC = флуоресцеина изотиоцианат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Стратегия изоляции кишечника и стробирования для сортировки живых одиночных клеток от целых личинок данио-рерио дикого типа. (A) Светлопольное изображение изоляции кишечника через 5 дней после оплодотворения личинок данио-рерио. Красной линией обозначена линия препарирования. (B) Анализ после сортировки, показывающий все ячейки с построением размера FCS/SSC. (C) Выбор синглета. (D) Стробирование DAPI. (E) Стробирование Phox2bb:GFP+. Процентное соотношение ячеек стробирования отображается на каждой панели. Сокращения: FCS-A = область прямого рассеяния; SSC-A = площадь бокового пика рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; GFP = зеленый флуоресцентный белок; FITC = флуоресцеина изотиоцианат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе мы представляем метод выделения и диссоциации кишечника личинок данио-рерио 5 dpf с использованием FACS. С помощью этого метода различные типы клеток кишечника были успешно собраны и проанализированы с помощью scRNA-seq с использованием платформы 10x Genomics Chromium. Мы выбрали линию данио-рерио tg(phox2bb:GFP), так как хотели получить указание на то, что жизнеспособные клетки ENS также будут выделены (рис. 2D). Тем не менее, важно отметить, что этот метод может быть легко распространен на другие интересующие нас линии данио-рерио, поскольку мы использовали стробирование phox2bb только для оценки жизнеспособности нейронов, а не для отбора для конкретной клеточной популяции. Поскольку мы решили использовать беспристрастный подход для сбора всех клеток кишечника, присутствующих при 5 dpf, критерий сортировки в первую очередь зависит от идентификации живых, отдельных клеток. Это также является причиной использования целых личинок для создания надежной и последовательной стратегии стробирования. Принимая во внимание трудозатраты, связанные с изоляцией отдельных кишок, становится нецелесообразным изолировать больше кишечника в качестве отрицательного контроля в течение заданного периода времени этого эксперимента. Таким образом, хотя мы признаем, что типы клеток целых личинок отличаются от тех, которые были обнаружены в кишечнике, и даже использовались различные методы диссоциации, примечательно, что стратегия стробирования, применяемая для сортировки кишечных клеток, может быть первоначально подтверждена с использованием целых личинок, поскольку нас интересовала только оценка жизнеспособности клеток.
Для выполнения scRNA-seq критическим шагом в этом протоколе является выделение достаточного количества жизнеспособных клеток (~20 000 клеток). В то же время время, затрачиваемое на изоляцию кишечника, должно быть как можно короче, чтобы избежать пагубного влияния на жизнеспособность клеток. В предыдущих отчетах, посвященных кишечнику личинок данио-рерио, для диссоциации клеток использовалась аккутаза или трипсин 19,20,21. Однако, в то время как оба фермента диссоциации были способны изолировать достаточное количество жизнеспособных клеток для секвенирования scRNA, аккутаза не позволяла захватывать клетки энтеральных нейронов19,20. Трипсин, однако, преимущественно захватывал эпителиальные клетки, давая лишь небольшое количество кишечных нейрональных клеток21. Папаин широко известен своей мягкостью, которая может быть особенно полезна для сохранения целостности кишечных нейронов22. Наши результаты показали, что папаин действительно эффективен в поддержании жизнеспособности нейрональных клеток, подтвердив предыдущие применения, в которых этот фермент использовался для переваривания сетчаткии мозга взрослых рыбок данио. Однако стоит отметить, что даже при использовании папаина жизнеспособность клеток после выделения и диссоциации кишечника составляла всего 6,4%. Это говорит о том, что последующий этап FACS, таким образом, имеет решающее значение для отбора жизнеспособных клеток. Такие результаты можно считать ограничением, особенно когда речь идет о редких и труднодоступных для захвата клетках, представляющих интерес.
Будущие исследования должны быть сосредоточены на новых методах диссоциации для улучшения жизнеспособности клеток во время протокола изоляции. После расширения этот метод становится возможным для сортировки репортер-положительных клеток и выполнения scRNA-seq для определенных типов клеток кишечника. Тем не менее, представленный здесь метод позволяет захватить достаточное количество жизнеспособных клеток для последующей идентификации различных типов клеток в кишечнике, таких как эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные, иммунные клетки и даже энтеральные нейроны и глия, которые ранее не были захвачены на этой клеточной стадии с использованием аналогичных подходов. Поскольку возможность изолировать и анализировать эти различные типы клеток имеет важное значение для получения более глубокого понимания развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта, мы считаем этот метод особенно ценным, поскольку он обеспечивает надежный подход к изучению состава кишечника с использованием рыбок данио-рерио в качестве модельного организма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Фондом друзей Софии (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
