Summary
Hier beschrijven we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting, voor single-cell RNA sequencing analyse.
Abstract
Het maagdarmkanaal (GI) vervult een reeks functies die essentieel zijn voor het leven. Aangeboren afwijkingen die de ontwikkeling beïnvloeden, kunnen leiden tot enterische neuromusculaire aandoeningen, wat het belang benadrukt om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal. In deze studie presenteren we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting om levende, levensvatbare cellen te verkrijgen die kunnen worden gebruikt voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse. Dit protocol is gebaseerd op de manuele dissectie van de darm van de zebravis, gevolgd door enzymatische dissociatie met papaïne. Vervolgens worden cellen onderworpen aan fluorescentie-geactiveerde celsortering en worden levensvatbare cellen verzameld voor scRNA-seq. Met deze methode waren we in staat om met succes verschillende darmceltypen te identificeren, waaronder epitheel-, stromale, bloed-, spier- en immuuncellen, evenals enterische neuronen en glia. Daarom beschouwen we het als een waardevolle bron voor het bestuderen van de samenstelling van het maagdarmkanaal in gezondheid en ziekte, met behulp van de zebravis.
Introduction
Het maagdarmkanaal (GI) is een complex systeem dat een vitale rol speelt in de algehele gezondheid en het welzijn. Het is verantwoordelijk voor de vertering en opname van voedingsstoffen, evenals de eliminatie van afvalproducten 1,2. Het maagdarmkanaal bestaat uit meerdere celtypen, waaronder epitheelcellen, gladde spiercellen, immuuncellen en het enterische zenuwstelsel (ENS), die nauw met elkaar communiceren om een goede darmfunctie te reguleren en te behouden 3,4,5. Defecten in de ontwikkeling van het maagdarmkanaal kunnen verstrekkende gevolgen hebben voor verschillende aspecten, zoals de opname van voedingsstoffen, de samenstelling van de microbiota, de darm-hersenas en het ENS, wat leidt tot verschillende enterische neuromusculaire aandoeningen, zoals de ziekte van Hirschsprung en chronische intestinale pseudo-obstructie 6,7. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door ernstige darmdysmotiliteit veroorzaakt door veranderingen in verschillende sleutelcellen, zoals de interstitiële cellen van Cajal, gladde spiercellen en de ENS 6,8,9. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal worden echter nog steeds slecht begrepen.
De zebravis is een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal vanwege de snelle embryonale ontwikkeling, transparantie tijdens embryonale en larvale stadia en genetische traceerbaarheid 10,11,12,13,14. Er zijn talrijke transgene zebravislijnen beschikbaar die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Een voorbeeld van zo'n lijn is de tg(phox2bb:GFP) zebravis, die vaak wordt gebruikt om het ENS te bestuderen, aangezien alle phox2bb+-cellen, inclusief enterische neuronen, het label15,16 hebben. Hier presenteren we, met behulp van de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, een methode voor darmisolatie van 5 dagen na bevruchting (dpf) larven voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse (Figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle zebraviskweek en experimenten zijn uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van het Erasmus MC en de wetgeving inzake dierenwelzijn. Het gebruik van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting valt onder de categorie experimenten waarvoor geen formele ethische goedkeuring vereist is, zoals uiteengezet in de Nederlandse regelgeving.
1. Het verkrijgen van 5 dagen na bevruchting (dpf) wildtype en tg (phox2bb: GFP) larven
- Kweek van wildtype zebravissen en verzamel 50 eitjes in HEPES-gebufferd E3-medium (hierna E3 genoemd) in een petrischaaltje van 15 cm. Gebruik deze vissen als negatieve controle voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FAC's).
- Kweek van tg(phox2bb:GFP) zebravissen en verzamel ongeveer 300 eitjes in E3 in een petrischaaltje van 15 cm.
- Bewaar bevruchte eicellen in E3 (maximaal 50 eieren/schaaltje) in een licht/donkercyclus van 14 uur/10 uur, in een broedmachine bij 28,5 °C.
- Verwijder bij 1 dpf onbevruchte eieren en laat de bevruchte eieren zich ontwikkelen tot 5 dpf.
- Selecteer tg(phox2bb:GFP) larven bij 1 dpf.
2. Dissociatie van hele larven van wildtype
- Verdoof 5 dpf-larven met 0,016% tricaïne.
- Snijd 30 zebravissen in kleine stukjes met behulp van een scheermesje in een petrischaal met 1 ml 10x trypsine-EDTA-oplossing.
- Breng de gehakte zebravis over in een microcentrifugebuis met een totaal volume van 2 ml 10x trypsine-EDTA-oplossing en laat 3 uur op ijs staan. Pipeteer elk uur op en neer met een P1000-pipet om dissociatie te stimuleren.
3. Isolatie van de darmen
- Plaats 6-10 larven van 5 dpf, verdoofd met 0,016% tricaïne op een rij, op een 1,8% agaroseplaat (0,45 g agarose in 25 ml E3), onder een dissectiemicroscoop
- Zet een insectenspeld in de kop van de zebravis.
- Verwijder alle resterende E3 met behulp van een tissue.
- Isoleer de darm met behulp van een andere insectenpin, zonder andere organen te verstoren. Zorg ervoor dat de dooier is verwijderd (aanvullende afbeelding S1A).
- Eenmaal geïsoleerd, inspecteert u de darm en verwijdert u indien nodig al het niet-intestinale materiaal (bijv. huid, vet, lever).
- Verzamel de darm met een pincet en plaats deze in een microcentrifugebuis, met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 10% foetaal kalfsserum (FCS), op ijs.
OPMERKING: Er moeten minimaal 244 darmen worden geïsoleerd, waarbij de totale dissectietijd op 3 uur wordt gehouden. Dit is haalbaar met twee mensen die parallel werken.
4. Darm dissociatie
- Centrifugeer onmiddellijk na de dissectie van alle darmen de microcentrifugebuis op volle snelheid (13.800 × g) gedurende 30 s.
- Verwijder de PBS/10% FCS maar laat een kleine hoeveelheid (~100 μL) achter om uitdroging van de darmen te voorkomen. Voeg 500 μL 2,17 mg/ml papaïne toe aan HBSS met CaCl2 en MgCl2 om de cellen te dissociëren.
- Activeer papaïne met 2,5 μL cysteïne (1 M).
- Incubeer de ingewanden in een waterbad van 37 °C gedurende 10 min. Pipetteer halverwege (na 5 min) op en neer om de vertering van enzymatisch weefsel te stimuleren.
- Breng cellen over in een FACS-buis met behulp van een celzeef van 35 μm, vooraf bevochtigd met 0,5 ml PBS/10% FCS.
- Was de zeef door in totaal 2 ml PBS/10% FCS toe te voegen in stappen van 0.5 ml.
- Centrifugeer bij 700 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 300 μL PBS/10% FCS.
- Voeg 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe om dode cellen te labelen (1:1,000) en incubeer gedurende 5 minuten om hun uitsluiting tijdens FACS mogelijk te maken.
5. FACS-verrijking
- Gebruik het wildtypemonster om de poorten van de gesorteerde celpopulatie in te stellen door 3.000 cellen op de flowcytometer te registreren (aanvullende figuur S1B-E).
- Gebruik een mondstuk van 100 μm, stel de sorteerprecisie in op zuiverheid en plaats de opvangbuis met 200 μL PBS/5% FCS in de FACS-machine.
- Laad de celsuspensie van de ingewanden en sorteer levende (DAPI-negatieve), enkele cellen in de verzamelbuis (Figuur 2C), door doubletten (Figuur 2B) en dode cellen (Figuur 2C) uit te sluiten.
OPMERKING: Voor de tg(phox2bb) zebravis wordt het aandeel GFP+- cellen alleen ter referentie gecontroleerd, aangezien alle afzonderlijke levende cellen worden gesorteerd. - Bewaar de opvangbuis op ijs na het sorteren van de cellen.
- Tel de celsuspensie met een hemocytometer, inclusief een levensvatbaarheidscontrole met trypanblauw. Als de levensvatbaarheid minimaal 80% is, ga dan verder met de volgende stap.
- Cellen zijn nu klaar om te verwerken voor scRNAseq (d.w.z. 10x Genomics Chromium-platform). Gebruik ongeveer 20.000 cellen per monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met dit protocol bereikten we succesvolle isolatie en dissociatie van hele darmen van 5 dpf-larven. Door papaïne als dissociatie-enzym te gebruiken, hebben we de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk verbeterd, waardoor 46.139 gebeurtenissen met enkele, levensvatbare cellen (6,4% van alle cellen) uit 244 geïsoleerde darmen konden worden vastgelegd (Figuur 2A). Wildtype hele larven werden gebruikt als controle om ervoor te zorgen dat het sorteerproces werd geoptimaliseerd, waardoor effectieve celidentificatie en sortering mogelijk werd. Hele larven kunnen worden gebruikt omdat we alleen sorteren op levende, enkele cellen (aanvullende figuur S1B-E). Alle gesorteerde darmcellen werden vervolgens voorgelegd aan het scRNA seq-platform. In totaal werden 9.858 cellen gesequenced met een gemiddelde lezingen per cel van 21.106. Voor scRNA-seq analyse gebruikten we Seurat V317. In totaal werden 48 clusters geïdentificeerd die 12 verschillende celtypen vertegenwoordigen, waaronder epitheel-, stromale, bloed-, spier- en immuuncellen, evenals enterische neuronen en glia18.
Figuur 1: Experimenteel ontwerp voor single-cell RNA sequencing van geïsoleerde zebravisdarmen. Afkortingen: FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; scRNA-seq = eencellige RNA-sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Poortstrategie om levende, afzonderlijke cellen uit de darm van de zebravis te sorteren. (A) Analyse na sortering met FCS/SSC-groottegating. (B) Doublet-discriminatie. (C) Levende/dode cellen gating en gesorteerde populatie. (D) Phox2bb:GFP+-cellen die aanwezig zijn in de gesorteerde levende populatie. In elk paneel wordt het percentage gated cells weergegeven. Afkortingen: FCS-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts verstrooiingspiekgebied; FSC-H = voorwaartse strooipiekhoogte; GFP = groen fluorescerend eiwit; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Darmisolatie en poortstrategie om levende, enkele cellen te sorteren van hele wildtype zebravislarven. (A) Brightfield-opname van darmisolatie van 5 dagen na bevruchting zebravislarven. De rode lijn geeft de dissectielijn aan. (B) Post-sort analyse, waarbij alle cellen met FCS/SSC size gating worden getoond. (C) Singlet selectie. (D) DAPI gating. (E) Phox2bb:GFP+ gating. Het percentage gated cells wordt in elk paneel weergegeven. Afkortingen: FCS-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts verstrooiingspiekgebied; FSC-H = voorwaartse strooipiekhoogte; GFP = groen fluorescerend eiwit; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een methode voor isolatie en dissociatie van de darm van 5 dpf zebravislarven met behulp van FACS. Met deze methode werden verschillende darmceltypen met succes verzameld en geanalyseerd door scRNA-seq, met behulp van het 10x Genomics Chromium-platform. We selecteerden de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, omdat we een indicatie wilden dat levensvatbare ENS-cellen ook geïsoleerd zouden worden (Figuur 2D). Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode gemakkelijk kan worden uitgebreid naar andere zebravislijnen die van belang zijn, aangezien we de phox2bb-gating alleen hebben gebruikt om de neuronale levensvatbaarheid te beoordelen en niet om te selecteren op een specifieke celpopulatie. Aangezien we hebben besloten om een onbevooroordeelde benadering te gebruiken om alle darmcellen te verzamelen die aanwezig zijn bij 5 dpf, hangt het sorteercriterium voornamelijk af van het identificeren van levende, individuele cellen. Dit is ook de reden achter het gebruik van hele larven om een betrouwbare en consistente poortstrategie vast te stellen. Gezien de arbeid die gepaard gaat met het isoleren van individuele darmen, wordt het onpraktisch om meer darmen te isoleren om als negatieve controle te dienen, binnen het gegeven tijdsbestek van dit experiment. Daarom, hoewel we erkennen dat celtypen van de hele larven verschillen van die in de darm, en zelfs verschillende dissociatiemethoden werden gebruikt, is het opmerkelijk dat de poortstrategie die wordt toegepast om darmcellen te sorteren in eerste instantie kan worden gevalideerd met behulp van hele larven, omdat we alleen geïnteresseerd waren in het beoordelen van de levensvatbaarheid van cellen.
Om scRNA-seq uit te voeren, zou een cruciale stap in dit protocol zijn om een voldoende aantal levensvatbare cellen (~20.000 cellen) te isoleren. Tegelijkertijd moet de tijd die wordt besteed aan darmisolatie zo kort mogelijk worden gehouden om een nadelig effect op de levensvatbaarheid van de cellen te voorkomen. Eerdere rapporten die zich richtten op de darmen van zebravislarven gebruikten accutase of trypsine voor celdissociatie 19,20,21. Hoewel beide dissociatie-enzymen in staat waren om voldoende levensvatbare cellen te isoleren voor scRNA-seq, stond accutase de vangst van enterische neuronale cellen niet toe19,20. Trypsine ving echter voornamelijk epitheelcellen op, wat slechts een klein aantal enterische neuronale cellenopleverde21. Papaïne staat algemeen bekend om zijn zachtheid, wat bijzonder gunstig kan zijn voor het behoud van de integriteit van enterischeneuronen22. Onze resultaten toonden aan dat papaïne inderdaad effectief is in het handhaven van de levensvatbaarheid van neuronale cellen, wat eerdere toepassingen bevestigt waarin dit enzym werd gebruikt om het volwassen netvliesen de hersenen van zebravissen te verteren. Het is echter opmerkelijk om te vermelden dat zelfs met papaïne de levensvatbaarheid van de cellen na darmisolatie en dissociatie slechts 6,4% was. Dit suggereert dat de volgende FACS-stap dus cruciaal is om te selecteren op levensvatbare cellen. Dergelijke resultaten kunnen als een beperking worden beschouwd, vooral wanneer het gaat om schaarse en moeilijk te vangen cellen van belang.
Toekomstige studies moeten zich richten op nieuwe dissociatiemethoden om de levensvatbaarheid van cellen tijdens het isolatieprotocol te verbeteren. Eenmaal verhoogd, wordt deze methode haalbaar om reporter-positieve cellen uit te zoeken en scRNA-seq uit te voeren op specifieke darmceltypen. Desalniettemin maakt de hier gepresenteerde methode het mogelijk om voldoende levensvatbare cellen te vangen voor latere identificatie van verschillende celtypen in de darm, zoals epitheel-, stromale, bloed-, spier-, immuuncellen en zelfs enterische neuronen en glia, die nog niet eerder zijn vastgelegd in dit celstadium met behulp van vergelijkbare benaderingen. Aangezien het vermogen om deze verschillende celtypen te isoleren en te analyseren essentieel is om meer inzicht te krijgen in de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal, beschouwen we deze methode als bijzonder waardevol, omdat het een betrouwbare benadering biedt om de darmsamenstelling te bestuderen met behulp van de zebravis, als modelorganisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Vrienden van de Sophia Stichting (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
