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Genetics

CRISPR-Cas9 एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (AAV) और 2-सेल भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके चूहा भ्रूण का जीनोम संपादन

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66069
Automatic Translation
1,2,4, 2, 3, 3, 3, 1,2,3,4
1Animal Modeling Core, University of Missouri, 2Comparative Medicine Program, University of Missouri, 3Rat Resource and Research Center, University of Missouri, 4Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri

Summary

इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहा मॉडल के उत्पादन के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) का उपयोग डीएनए मरम्मत टेम्पलेट देने के लिए किया जाता है, और 2-सेल भ्रूण में जीनोम संपादन प्रक्रिया को पूरा करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 अभिकर्मकों को वितरित करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग किया जाता है।

Abstract

जीनोम संपादन तकनीक का व्यापक रूप से चूहों सहित आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है। डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स और सीआरआईएसपीआर-सीएएस अभिकर्मकों के साइटोप्लाज्मिक या प्रोन्यूक्लियर इंजेक्शन भ्रूण में सबसे आम वितरण विधि है। हालांकि, इस प्रकार के माइक्रोमैनिपुलेशन के लिए विशेष उपकरणों तक पहुंच की आवश्यकता होती है, श्रमसाध्य है, और इसके लिए एक निश्चित स्तर के तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, माइक्रोइंजेक्शन तकनीक अक्सर भ्रूण पर यांत्रिक तनाव के कारण कम भ्रूण अस्तित्व में परिणाम देती है। इस प्रोटोकॉल में, हमने माइक्रोइंजेक्शन की आवश्यकता के बिना सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन के साथ संयोजन के रूप में काम करने के लिए बड़े डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स देने के लिए एक अनुकूलित विधि विकसित की। यह प्रोटोकॉल 2-सेल भ्रूण को संशोधित करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा CRISPR-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) की डिलीवरी के साथ एकल-फंसे डीएनए दाता टेम्पलेट्स के AAV-मध्यस्थता डीएनए वितरण को जोड़ती है। इस उपन्यास रणनीति का उपयोग करते हुए, हमने सफलतापूर्वक लक्षित नॉक-इन चूहे मॉडल का उत्पादन किया है, जिसमें 42% और 90% के बीच क्षमता के साथ आकार में 1.2 से 3.0 केबी तक डीएनए अनुक्रमों का सम्मिलन होता है।

Introduction

सीआरआईएसपीआर-आधारित जीनोम संपादन उपकरणों के विकास ने नए और अधिक परिष्कृत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे मॉडल को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने की हमारी क्षमता को तेज कर दिया है। सिंगल-गाइड आरएनए, कैस 9 न्यूक्लियस के साथ, राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए संयुक्त होता है जो जीनोम के भीतर ब्याज के डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करता है और परिणामस्वरूप डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टूट जाता है। क्योंकि सेलुलर डीएनए मरम्मत तंत्र त्रुटि-प्रवण हैं, मरम्मत प्रक्रिया के दौरान सम्मिलन और विलोपन (INDELs) पेश किए जाते हैं जो लक्ष्य जीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं। जब जीनोम संपादन अभिकर्मकों के साथ एक वांछित इंजीनियर डीएनए अनुक्रम (मरम्मत टेम्पलेट) का सह-वितरण होता है, तो डबल-फंसे डीएनए ब्रेक वाले क्षेत्र में मरम्मत टेम्पलेट का सम्मिलन होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) नामक प्रक्रिया के माध्यम से होता है। यह लक्षित डीएनए सम्मिलन/प्रतिस्थापन (नॉक-इन) के साथ पशु मॉडल बनाने के लिए एक प्रभावी रणनीति है। एक सीमा यह है कि नॉक-इन अनुक्रम अक्सर आकार में बड़े होते हैं, जो जीन संपादन दक्षता को कम करने के लिए दिखाए गए हैं, इस प्रकार वांछित मॉडल को और अधिक कठिन बनाते हैं1. नॉक-इन क्षमता बढ़ाने के लिए रणनीतियों में डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) और एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) मरम्मत टेम्पलेट्स और डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स 2,3,4 के रासायनिक संशोधन दोनों के रैखिककरण शामिल हैं। इसके अलावा, एचडीआर उत्तेजक यौगिकों के साथ प्रोन्यूक्लियर माइक्रोइंजेक्शन, माइक्रोइंजेक्शन के साथ संयोजन के रूप में विद्युत दालों के आवेदन, और 2-सेल भ्रूण में समयबद्ध माइक्रोइंजेक्शन सभी का प्रयास 5,6,7 किया गया है। इनमें से कुछ दृष्टिकोणों की सफलता के बावजूद, 1.0 केबी से बड़े डीएनए अनुक्रमों का समावेश तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।

इलेक्ट्रोपोरेशन, जो सुसंस्कृत सेल लाइनों में अभिकर्मकों को पेश करने के लिए एक सामान्य तरीका है, भ्रूण में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 घटकों को वितरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का विकल्प प्रदान करता है। भ्रूण electroporation, पहले चूहे भ्रूण8 में प्रदर्शित, के बाद से सफलतापूर्वक चूहों 9,10,11,12,13, सूअरों14,15, और अन्य पशु मॉडल जीवों 16,17,18 में एक वितरण विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया है . भ्रूण, CRISPR-Cas9 अभिकर्मकों युक्त माध्यम में निलंबित, एक क्युवेट में या दो इलेक्ट्रोड के बीच एक ग्लास स्लाइड पर रखा जाता है और विद्युत धाराओं के प्रत्यक्ष दालों के अधीन होता है। यह ज़ोना पेलुसीडा और भ्रूण प्लाज्मा झिल्ली में क्षणिक उद्घाटन बनाता है जिसके माध्यम से CRISPR-Cas9 घटक भ्रूण में प्रवेश करते हैं। आमतौर पर, मध्य-स्तरीय विद्युत "पोरिंग" दालों का उपयोग अस्थायी उद्घाटन बनाने के लिए किया जाता है, जिसके बाद निचले स्तर के विद्युत "ट्रांसफर पल्स" होते हैं जो नकारात्मक चार्ज किए गए जीनोम संपादन घटकों के आंदोलन की सुविधा प्रदान करते हैं। भ्रूण electroporation कुशल है, एक उच्च throughput है, और प्रदर्शन करने के लिए आसान है. हालांकि, जबकि भ्रूण electroporation छोटे (<200 बीपी) ssDNA मरम्मत टेम्पलेट्स की शुरूआत के लिए अत्यधिक सफल होने के लिए दिखाया गया है, वहाँ बड़ा (>1.0 केबी) मरम्मत टेम्पलेट्स13,19 के सफल electroporation की कुछ रिपोर्ट कर रहे हैं. यह आकार प्रतिबंध बड़े सम्मिलन की आवश्यकता वाले नॉक-इन पशु मॉडल उत्पन्न करने के लिए भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन की एक प्रमुख सीमा का प्रतिनिधित्व करता है।

जीन थेरेपी के संदर्भ में, एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) लंबे समय से वाहनों के रूप में उपयोग किए जाते हैं ताकि वे विभाजित और गैर-विभाजित कोशिकाओं दोनों की विवो संक्रामकता में अपने कुशल होने के कारण आनुवंशिक सामग्री वितरित कर सकें, रोगजनकता की कमी और दुर्लभ जीनोमिक एकीकरण20,21। हाल ही में, अधिक अध्ययनों ने डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स और सीआरआईएसपीआर अभिकर्मकों 22,23,24को पेश करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 तकनीक के साथ एएवी को जोड़ा है। यह दृष्टिकोण माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों की आवश्यकता के बिना बड़े डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स के वितरण की अनुमति देता है।

एचडीआर मार्ग सेल चक्र25,26 के देर से एस और जी 2 चरणों में अधिक सक्रिय है। इन विट्रो में किए गए अध्ययनों में, नॉक-इन दक्षता में महत्वपूर्ण वृद्धि CRISPR-Cas9 RNPs और डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स को G2-सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं में या Cas9-Geminin संलयन प्रोटीन2 का उपयोग करके देर से S और G2 चरणों में Cas9 प्रोटीन की उपस्थिति के प्रतिबंध द्वारा प्राप्त की गई थी। इसके अलावा, एक प्रमुख युग्मनज जीनोम सक्रियण (ZGA) घटना है जो 2-कोशिका चरण भ्रूण के विस्तारित G2 चरण के दौरान होती है, और यह एक खुले क्रोमैटिन अवस्था से जुड़ी होती है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह CRISPR-Cas9 RNPs प्रदान करता है और जीनोमिक डीएनए तक अधिक पहुंच के साथ टेम्पलेट्स की मरम्मत करता है।

हमारा लक्ष्य भ्रूण के विकास के 2-सेल चरण में CRISPR-Cas9 RNPs को पेश करने के लिए भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ AAV दृष्टिकोण को जोड़कर इन सभी टिप्पणियों पर निर्माण करना था। यह रणनीति एएवी की बड़ी डीएनए मरम्मत टेम्पलेट वितरण क्षमता, इलेक्ट्रोपोरेशन की तकनीकी आसानी और भ्रूण के विकास के दौरान जीनोमिक पहुंच के लिए अधिक इष्टतम 2-सेल समय बिंदु का लाभ उठाती है ताकि डीएनए सम्मिलन के लक्षित आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक कुशल विधि बनाई जा सके। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में हाइलाइट किया गया है, हमारी अनुकूलित विधि लक्षित नॉक-इन चूहे मॉडल के उत्पादन के लिए अनुमति देती है जो माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों की आवश्यकता के बिना आकार में 1.2 से 3.0 केबी तक डीएनए अनुक्रमों के सम्मिलन को ले जाती है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं मिसौरी के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया (ACUC प्रोटोकॉल #25580) और उपयोग और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल के लिए गाइड में निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.

1. एएवी-मध्यस्थता डीएनए मरम्मत टेम्पलेट वितरण

  1. दो होमोलॉजी हथियारों के बीच वांछित नॉक-इन अनुक्रम को शामिल करने के लिए डीएनए निर्माण को डिज़ाइन करें। विशिष्ट होमोलॉजी हाथ की लंबाई लंबाई में 300-500 बीपी है। सुनिश्चित करें कि संपूर्ण डीएनए मरम्मत टेम्पलेट (होमोलॉजी हथियार + वांछित नॉक-इन अनुक्रम) एक उपयुक्त प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी में क्लोन करके और पुनः संयोजक ssAAV1 या ssAAV6 (सीरोटाइप 1 या 6) में पैकेजिंग करके उल्टे टर्मिनल दोहराव (आईटीआर) से घिरा हुआ है।
    नोट: यदि एसजीआरएनए लक्ष्य अनुक्रम डीएनए मरम्मत टेम्पलेट में मौजूद है, तो इस अनुक्रम को बाधित करने के लिए इंजीनियर मूक उत्परिवर्तन करना महत्वपूर्ण है और इस प्रकार सीआरआईएसपीआर-कैस 9 को सही ढंग से लक्षित एलील के मध्यस्थता संपादन को रोकता है।
    चेतावनी: पुनः संयोजक एएवी वायरल वैक्टर गैर-एकीकृत और बीएसएल-1 के रूप में वर्गीकृत हैं। मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग वायरस के संपर्क में आने वाले भ्रूणों को पाइप करने और संभालने के लिए किया जाता है।
  2. इंजीनियर ssAAV1 या ssAAV6 (डीएनए मरम्मत टेम्पलेट के साथ पैक) KSOM-R मीडिया27,28 के 30 माइक्रोन में 3 × 107 जीनोम प्रतियां (जीसी)/μL की अंतिम एकाग्रता के लिए 35 मिमी पेट्री डिश में खनिज तेल के तहत जोड़ें।
  3. इंजीनियर ssAAV युक्त KSOM-R मीडिया में दृश्यमान pronuclei के साथ युग्मनज रखें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके ज़ोना पेलुसीडा को पतला करने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि एएवी सीरोटाइप 1 और 6 कुशल डीएनए मरम्मत टेम्पलेट वितरण के लिए आसानी से गुजरने में सक्षम हैं।
  4. पर्याप्त वायरल पारगमन की अनुमति देने के लिए 5% सीओ2 और 18-20 घंटे के लिए अधिकतम आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

2. इलेक्ट्रोपोरेशन तैयारी

  1. अगले दिन, एक बाँझ RNase मुक्त ट्यूब में Opti-MEM मीडिया में पतला sgRNA के 100 ng/μL और Cas9 प्रोटीन के 100 ng/μL युक्त एक इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण बनाएं। धीरे से मिलाएं।
  2. आरएनपी गठन के लिए अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  3. इनक्यूबेशन समय के दौरान, इलेक्ट्रोपोरेटर चालू करें और कनेक्ट 1.5 मिमी गैप ग्लास स्लाइड इलेक्ट्रोड की ओर जाता है।
  4. तालिका 1 में वर्णित के रूप में electroporation मापदंडों सेट.

3. 2-सेल भ्रूण electroporation

  1. धीरे विंदुक 5 माइक्रोन ग्लास स्लाइड पर दो इलेक्ट्रोड के बीच सीआरआईएसपीआर electroporation मिश्रण समाधान के लिए हवा बुलबुले परिचय नहीं ख्याल रखना.
  2. एएवी समाधान से 2 सेल चरण भ्रूण निकालें. उन्हें इलेक्ट्रोड के किनारों को छूने की अनुमति के बिना मिश्रण में 2 सेल चरण भ्रूण लाइन. यह लसीका से बचने के लिए किया जाता है।
  3. प्रतिबाधा को मापने के लिए ओम बटन दबाएं। प्रतिबाधा 0.100 और 0.300 kΩ के बीच है सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें। प्रतिक्रिया मात्रा प्रतिबाधा को बदल देगी (प्रतिबाधा को कम करने के लिए मात्रा जोड़ें और प्रतिबाधा बढ़ाने के लिए मात्रा घटाएं)।
  4. स्टार्ट दबाएं। प्रक्रिया को पूरा होने में कुछ सेकंड लगते हैं।
  5. तुरंत electroporation के बाद भ्रूण निकालें और KSOM-R मीडिया के ताजा 30 μL बूंदों में 3 बार धो लें.
  6. खनिज तेल के तहत KSOM-R मीडिया की 500 μL बूंदों में इन विट्रो संस्कृति के लिए 5% CO2 और अधिकतम आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण वापस रखें। वैकल्पिक रूप से, शल्य चिकित्सा जीवित संतान पैदा करने के लिए भ्रूण को 1.5-दिवसीय पोस्ट कोइटम (डीपीसी) छद्म गर्भवती मादा चूहे में स्थानांतरित करें।

Figure 1
चित्रा 1: सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन के लिए एएवी-मध्यस्थता डीएनए वितरण और 2-सेल भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन पाइपलाइन का योजनाबद्ध। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

प्रोटोकॉल के बाद, डीएनए मरम्मत टेम्पलेट की प्रभावी एएवी-मध्यस्थता डिलीवरी होती है जो सीआरआईएसपीआर-कैस 9 आरएनपी के साथ 2-सेल भ्रूण के इलेक्ट्रोपोरेटेड होने के बाद अत्यधिक कुशल एचडीआर की अनुमति देती है। जैसा कि वीडियो में दिखाया गया है, एक सफल इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया के परिणामस्वरूप प्रत्येक इलेक्ट्रोड(चित्रा 2सी)पर बुलबुले बनते हैं और प्रतिबाधा 0.100 और 0.300 kΩ की सीमा के भीतर शेष रहती है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद यह भ्रूण के लिए असामान्य नहीं है कि ज़ोना पेलुसीडा (चित्रा 3) के अंदर पेरिविटेलिन स्पेस को भरना हो। यह सूजन संस्कृति में कुछ घंटों के बाद कम हो जानी चाहिए। यह भी 2 सेल भ्रूण(चित्रा 3)electroporating के बाद सेलुलर संलयन घटनाओं का एक छोटा प्रतिशत (अप करने के लिए 20%) देखने के लिए असामान्य नहीं है. सेलुलर संलयन संभावित रूप से इलेक्ट्रोड(चित्रा 2बी)के बीच ऊर्ध्वाधर अक्ष संरेखण के बजाय सावधान क्षैतिज अक्ष संरेखण से बचा जा सकता है. हालांकि, हम आम तौर पर सिर्फ electroporation प्रक्रिया के बाद किसी भी जुड़े भ्रूण त्यागने.

2-सेल भ्रूण CRISPR-Cas9 RNP इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक के साथ हमारी AAV- मध्यस्थता डीएनए डिलीवरी लक्षित सम्मिलन के साथ नॉक-इन चूहे मॉडल बनाने के लिए अत्यधिक प्रभावी साबित हुई है। चूहे के भ्रूण में हमारी विधि का परीक्षण करना और लॉक्सपी साइटों वाले एक इंजीनियर लघु कृत्रिम इंट्रॉन के सम्मिलन के लिए सुसंस्कृत ब्लास्टोसिस्ट की स्क्रीनिंग करना, हमने नोट किया कि 60% से अधिक ब्लास्टोसिस्ट में अगली पीढ़ी के अनुक्रम (एनजीएस) विश्लेषण (चित्रा 4) के आधार पर सही ढंग से लक्षित नॉक-इन एलील शामिल था। इसके अलावा, लाइव नॉक-इन चूहों का उत्पादन करने के लिए हमारी विधि का परीक्षण करते हुए, हमने चूहे डीआरडी 2 जीन के एटीजी स्टार्ट साइट पर लक्षित क्रे रीकॉम्बिनेज कोडिंग अनुक्रम को इंजीनियर करने के लिए एक परियोजना तैयार की। एएवी-पैक डीएनए डोनर टेम्पलेट में एएवी पैकेजिंग, 5 'होमोलॉजी आर्म (लंबाई में 422 बीपी), एक क्रे-पीए अनुक्रम (लंबाई में 1,339 बीपी), और एक 3 'होमोलॉजी आर्म (लंबाई में 477 बीपी) (चित्रा 5 ए) के लिए आवश्यक आईटीआर अनुक्रम शामिल थे। पैदा हुए 11 संतानों में से 10 चूहे डीआरडी2(चित्रा 5बी-डी)की एटीजी प्रारंभ साइट में सही ढंग से डाले गए क्रे-पीए अनुक्रम के लिए पीसीआर विश्लेषण द्वारा सकारात्मक थे। लक्षित सम्मिलन को बाद में डीएनए अनुक्रम विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई थी। 7 विभिन्न परियोजनाओं पर सारांश के रूप में, हमने संस्थापक जानवरों में 76% औसत नॉक-इन सफलता दर हासिल की है, जैसा कि होमोलॉजी आर्म जंक्शनों और डीएनए अनुक्रम सत्यापन(तालिका 2)में पीसीआर विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है।

वोल्टेज [वी] पल्स लंबाई [मिसे] पल्स अंतराल [msec] # दालों का क्षय दर [%] विपरीतता
पोरिंग पल्स 40 3.5 50 4 10 +
ट्रांसफर पल्स 5 50 50 5 40 +/-

तालिका 1: इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान वर्तमान सीमा चालू है।

Figure 2
चित्रा 2: 2-सेल भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया। (ए) ग्लास स्लाइड इलेक्ट्रोड। (बी)सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन अभिकर्मकों में निलंबित भ्रूण और इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले ग्लास स्लाइड इलेक्ट्रोड में लोड किया गया। (सी)electroporation के दौरान प्रत्येक इलेक्ट्रोड पर हवा बुलबुला गठन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: electroporation के बाद भ्रूण उपस्थिति. सेलुलर संलयन electroporation के बाद 20 सेल भ्रूण के 2% में उल्लेख किया है. पेरिविटेलिन स्पेस को भरने वाले ज़ोना पेलुसीडा के अंदर भ्रूण की कोशिकाएं भी सूज सकती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एएवी-मध्यस्थता डीएनए वितरण और संस्कृति चूहा ब्लास्टोसिस्ट में 2-सेल भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन नॉक-इन दक्षता। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) द्वारा सही नॉक-इन एलील का पता लगाने के लिए ब्लास्टोसिस्ट के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत डेटा। एन = 28 ब्लास्टोसिस्ट (संस्कृति-केवल नियंत्रण समूह), एन = 37 ब्लास्टोसिस्ट (इलेक्ट्रोपोरेशन (ईपी) केवल नियंत्रण समूह), और एन = 35 ब्लास्टोसिस्ट (एएवी + ईपी समूह)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक Drd2-Cre नॉक-इन चूहा मॉडल का निर्माण। (ए) चूहे Drd2 जीन का लक्ष्यीकरण। आरएनपी कॉम्प्लेक्स को एक्सॉन 2 को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जिसमें कोडिंग क्षेत्र प्रारंभ साइट शामिल है। एएवी डोनर टेम्प्लेट में वायरल इनवर्टेड टर्मिनल रिपीट सीक्वेंस (आईटीआर), 5' और 3' डीआरडी 2 जीन होमोलॉजी आर्म्स (एचए) और पॉलीए सीक्वेंस के साथ क्रे जीन शामिल थे। दाता टेम्पलेट का सफल एकीकरण क्रे जीन 3 में दस्तक देता है 'एक्सॉन 2 के भीतर प्रारंभ साइट पर। यह क्रे जीन को डीआरडी 2 प्रमोटर के नियंत्रण में रखता है जबकि एक साथ डीआरडी 2 जीन को खटखटाता है। सफल नॉक-इन की पुष्टि के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर प्राइमरों का स्थान बैंगनी तीर द्वारा इंगित किया जाता है। (बी) संभावित जीनोम संपादित जानवरों (लेन बी 10-सी 8) का पीसीआर विश्लेषण 5 'होमोलॉजी आर्म में फैले प्राइमरों के साथ। लेन C9: जंगली प्रकार (नकारात्मक नियंत्रण); लेन C10: कोई टेम्पलेट (नकारात्मक नियंत्रण) नहीं। नॉक-इन पॉजिटिव जानवरों के लिए अपेक्षित एम्प्लिकॉन आकार 601bp है। (सी) संभावित जीनोम संपादित जानवरों (लेन डी 8-ई 6) का पीसीआर विश्लेषण 3 'होमोलॉजी आर्म में फैले प्राइमरों के साथ। लेन E7: जंगली प्रकार; लेन E8: कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। नॉक-इन पॉजिटिव जानवरों के लिए अपेक्षित एम्प्लिकॉन आकार 676bp है। अपेक्षित amplicon आकार 381bp है। लेन C7-D5: संभावित संस्थापक; लेन डी 6: जंगली प्रकार; लेन D7: कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। पीसीआर प्रतिक्रियाओं 15bp-3kb संरेखण मार्करों (हरे रंग में इंगित) के साथ केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया. QX डीएनए आकार मार्कर बेस जोड़े (बीपी) में पीसीआर amplicon आकार के अनुरूप चोटी आकार के साथ प्रत्येक छवि के बाईं ओर दिखाया गया है. यह आंकड़ा संदर्भ24 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

परियोजना विवरण नॉक-इन के लिए संतान सकारात्मक (%)
Oprm1-P2A-Flp (1.7 kb सम्मिलन) 5/5 (100%)
Drd2-Cre (1.3 kb सम्मिलन) 10/11 (91%)
Triml2-P2A-Cre (1.3 kb सम्मिलन) 9/16 (56%)
Cxcl15-iCre (1.3 kb सम्मिलन) 6/6 (100%)
Opn4-P2A-Cre (1.2 kb सम्मिलन) 6/8 (75%)
Vipr1-FLEX-EGFP (1.4 kb सम्मिलन) 5/12 (42%)
Rosa26-फ्लेक्स-MTS-KillerRed (3.1 kb प्रविष्टि) 5/7 (71%)

तालिका 2: नॉक-इन मॉडल सफलता दर

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Discussion

सीआरआईएसपीआर-सीएएस जीनोम संपादन प्रणाली ने विभिन्न प्रकार की पशु प्रजातियों में सीधे और जटिल, अनुकूलित आनुवंशिक संशोधनों के कुशल उत्पादन की अनुमति देकर आनुवंशिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। जीनोम संपादन से जुड़ी तकनीकों में लगातार शोधन और सुधार इसकी बहुमुखी प्रतिभा को आगे बढ़ाते हैं। यहां हमने 2-सेल कृंतक भ्रूण में CRISPR-Cas9 अभिकर्मकों के 2-सेल भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ ssAAV-मध्यस्थता डीएनए डिलीवरी का उपयोग करके एक नए दृष्टिकोण का वर्णन किया है। हमने प्रदर्शित किया है कि यह लक्षित नॉक-इन पशु मॉडल का उत्पादन करने का एक प्रभावी तरीका है।

एएवी का उपयोग करने का एक बड़ा फायदा यह है कि यह माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों की आवश्यकता के बिना भ्रूण में बड़े डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स के वितरण को सक्षम बनाता है। एएवी-मध्यस्थता वितरण भी कुछ हद तक अकेले इलेक्ट्रोपोरेशन के डीएनए टेम्पलेट आकार प्रतिबंधों को दरकिनार करने में मदद करता है। हालांकि, एएवी का उपयोग करते समय कुछ महत्वपूर्ण विचार हैं। ज़ोना पेलुसीडा, निषेचित अंडे के आसपास कठोर ग्लाइकोप्रोटीन मैट्रिक्स एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य करता है जो अक्सर न्यूक्लिक एसिड के वितरण को जटिल बनाता है। ज़ोना पेलुसीडा का पतला होना एक सामान्य तकनीक है जिसका उपयोग भ्रूण तक बेहतर पहुंच के लिए किया जाता है। हालांकि, कुछ अध्ययनों से पता चला है कि भ्रूण के विकास में भ्रूण में उच्च खुराक (1 × 107 जीसी/μL से 1 × 109 GC/μL) AAV के संक्रमण से बाधा उत्पन्न होती है जिसमें एएवी संक्रमण22 से पहले ज़ोना पेलुसीडा पतला हो गया था। हालांकि, एएवी के कुछ सीरोटाइप हैं जो ज़ोना पेलुसीडा29 में फैल सकते हैं। हमारे प्रोटोकॉल में ज़ोना पेलुसीडा का पतला होना शामिल नहीं है और पहले प्रकाशित रिपोर्टों की तुलना में अधिक नॉक-इन दरों को प्राप्त करने के लिए 3 × 107 जीसी / μl की एकाग्रता पर सीरोटाइप 1 और 6 के साथ एएवी का उपयोग करता है। हमने इन परिस्थितियों में भ्रूण के विकास में कमी पर ध्यान नहीं दिया।

2-सेल भ्रूण के इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा प्राप्त उच्च नॉक-इन दक्षता विकास के इस चरण में भ्रूण में विस्तारित जी 2 चरण के कारण सबसे अधिक संभावना है, जिससे यह एक इष्टतम विकास चरण बन जाता है जिसमें इलेक्ट्रोपोरेशन करना है। हालांकि, एक संभावित जटिलता मनाया सेलुलर संलयन electroporation प्रक्रिया के दौरान कुछ 2 सेल भ्रूण में देखा है. यह अवलोकन आश्चर्य की बात नहीं है कि electrofusion प्रक्रियाओं आमतौर पर स्तनधारी कोशिकाओं फ्यूजिंग के लिए उपयोग किया जाता है और संलयन संभवतः इलेक्ट्रोड30,31 के बीच ऊर्ध्वाधर अक्ष संरेखण के बजाय सावधान क्षैतिज से बचा जा सकता है. इसके अलावा, जब जीनोम संपादन विकास में बाद के चरण में होता है जैसे कि 1-सेल के बजाय 2-सेल, तो मोज़ेकवाद में वृद्धि की अधिक संभावना होती है। हमारे 2-सेल इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने 1-सेल चरण में प्रोन्यूक्लियर इंजेक्शन (एएवी दृष्टिकोण के लिए 86% और पीएनआई दृष्टिकोण के लिए 67%) की तुलना में मोज़ेकवाद में मामूली वृद्धि देखी, लेकिन अभी भी सभी संस्थापक जानवरों में संशोधित एलील के जर्मलाइन ट्रांसमिशन को प्राप्त करने में सक्षम थे। एक अन्य संभावित चिंता एएवी-व्युत्पन्न डीएनए टेम्पलेट्स के अग्रानुक्रम कंटेमर एकीकरण की संभावना है। जबकि हमने इस प्रोटोकॉल में वर्णित मॉडलों के लिए लंबे समय तक पढ़े गए अनुक्रमण का प्रदर्शन नहीं किया, हमने ड्रॉपलेट-डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर) कॉपी नंबर भिन्नता का उपयोग करके सभी मॉडलों के लिए डीएनए टेम्पलेट्स के एकल एकीकरण की पुष्टि की।

अंत में, जबकि हमारी विधि में ब्याज के डीएनए अनुक्रमों की एएवी डिलीवरी शामिल थी, भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ संयोजन के रूप में अन्य वायरल और गैर-वायरल मध्यस्थता डीएनए वितरण दृष्टिकोणों का उपयोग करना संभव होना चाहिए ताकि भ्रूण को सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सके। अंत में, ssAAV-मध्यस्थता डीएनए वितरण और CRISPR-Cas9 RNPs के इलेक्ट्रोपोरेशन को 2-सेल चरण भ्रूण में संयोजित करना कुशल उत्पन्न करने वाले नॉक-इन चूहे मॉडल के लिए एक कुशल और आसानी से अनुकूलनीय तरीका है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक वीडियोग्राफी और वीडियो संपादन में सहायता के लिए नोलन डेविस को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leads with alligator clips for electrodes NepaGene C117
Mineral oil MilliporeSigma M5310
NepaGene21 Super Electroporator  NepaGene NEPA21
Platinum plate electrodes on slide glass NepaGene CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein MilliporeSigma PECAS9
sgRNA (chemically-modified) Synthego N/A
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template Vectorbuilder N/A

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इस महीने JoVE अंक 205 एडेनो-जुड़े वायरस (AAV) जीनोम संपादन CRISPR-Cas electroporation 2-सेल भ्रूण नॉक-इन चूहा पशु मॉडल
CRISPR-Cas9 एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (AAV) और 2-सेल भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके चूहा भ्रूण का जीनोम संपादन
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