Summary
このプロトコルは、遺伝子修正されたラットモデルを生成するための最適化されたアプローチを提示します。アデノ随伴ウイルス(AAV)はDNA修復テンプレートの送達に使用され、エレクトロポレーションはCRISPR-Cas9試薬の送達に使用され、2細胞胚のゲノム編集プロセスを完了します。
Abstract
ゲノム編集技術は、ラットを含む遺伝子改変動物の製造に広く利用されています。DNA修復テンプレートとCRISPR-Cas試薬の細胞質または前核注入は、胚への最も一般的な送達方法です。しかし、この種のマイクロマニピュレーションは、特殊な機器へのアクセスを必要とし、手間がかかり、ある程度の技術力が必要です。さらに、マイクロインジェクション技術は、胚に機械的ストレスがかかるため、胚の生存率が低下することがよくあります。このプロトコルでは、マイクロインジェクションを必要とせずに、CRISPR-Cas9ゲノム編集と連動する大きなDNA修復テンプレートを送達するための最適化された方法を開発しました。このプロトコルは、2細胞胚を変更するためにエレクトロポレーションによるCRISPR-Cas9リボ核タンパク質(RNP)の送達とともに、一本鎖DNAドナーテンプレートのAAV媒介DNA送達を組み合わせたものです。この斬新な戦略を用いて、1.2〜3.0kbのDNA配列を42%〜90%の効率で挿入する標的ノックインラットモデルを作製することに成功しました。
Introduction
CRISPRベースのゲノム編集ツールの開発により、より洗練された新しい遺伝子改変ラットモデルを効率的に生成する能力が加速しました。シングルガイドRNAは、Cas9ヌクレアーゼとともに結合して、ゲノム内の目的のDNA配列を標的とするリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成し、二本鎖DNA切断を引き起こします。細胞DNA修復機構はエラーが発生しやすいため、修復プロセス中に挿入および欠失(INDEL)が導入され、標的遺伝子の機能を破壊する可能性があります。ゲノム編集試薬とともに目的の改変DNA配列(修復テンプレート)が共送達されると、二本鎖DNA切断を含む領域への修復テンプレートの挿入は、相同性指向性修復(HDR)と呼ばれるプロセスを通じて行われます。これは、ターゲットDNAの挿入/置換(ノックイン)を持つ動物モデルを生成するための効果的な戦略です。1つの制限は、ノックイン配列がしばしばサイズが大きいことであり、これは遺伝子編集効率を低下させ、したがって、目的のモデルを生成することをより困難にすることが示されている1。ノックイン効率を高めるための戦略には、二本鎖DNA(dsDNA)と一本鎖DNA(ssDNA)の両方の修復テンプレートの直鎖化と、DNA修復テンプレートの化学修飾が含まれます2,3,4。さらに、HDR刺激化合物を伴う前核マイクロインジェクション、マイクロインジェクションと組み合わせた電気パルスの適用、および2細胞胚への時限マイクロインジェクションがすべて試みられています5,6,7。これらのアプローチのいくつかは成功していますが、1.0 kbを超えるDNA配列の取り込みは依然として技術的に困難です。
エレクトロポレーションは、培養細胞株に試薬を導入するための一般的な方法であり、CRISPR-Cas9成分を胚に送達するためのマイクロインジェクションの代替手段となります。胚エレクトロポレーションは、ラットの胚8で初めて実証され、その後、マウス9,10,11,12,13、ブタ14,15、その他の動物モデル生物16,17,18の送達方法として成功裏に用いられてきた.CRISPR-Cas9試薬を含む培地に懸濁した胚を、キュベットまたは2つの電極の間のスライドガラスに入れ、直接パルスの電流を流します。これにより、透明帯と胚の原形質膜に一時的な開口部が生じ、そこからCRISPR-Cas9成分が胚に入ります。典型的には、中レベルの電気的な「孔あけ」パルスを使用して一時的な開口部を作成し、その後に負に帯電したゲノム編集コンポーネントの移動を容易にする低レベルの電気的な「転送パルス」が続きます。胚エレクトロポレーションは効率的で、スループットが高く、実行が容易です。しかし、胚エレクトロポレーションは、小さな(<200 bp)のssDNA修復テンプレートの導入に非常に成功することが示されていますが、より大きな(>1.0 kb)の修復テンプレートのエレクトロポレーションが成功したという報告はほとんどありません13,19。このサイズ制限は、大きな挿入を必要とするノックイン動物モデルを生成するための胚エレクトロポレーションの大きな制限を表しています。
遺伝子治療の文脈では、アデノ随伴ウイルス(AAV)は、分裂細胞と非分裂細胞の両方の効率的なin vivo感染性、病原性の欠如、およびまれなゲノム統合により、遺伝物質を送達する媒体として長い間使用されてきました20,21。最近では、AAVとCRISPR-Cas9技術を組み合わせて、DNA修復テンプレートとCRISPR試薬を導入する研究が増えています22,23,24。このアプローチにより、マイクロインジェクション技術を必要とせずに、より大きなDNA修復テンプレートを送達することができます。
HDR経路は、細胞周期の後期S期およびG2期でより活発になります25,26。in vitroで実施された研究では、CRISPR-Cas9 RNPとDNA修復テンプレートをG2同期細胞に送達するか、Cas9-Geminin融合タンパク質を用いてCas9タンパク質の存在を後期S期およびG2期に制限することにより、ノックイン効率の大幅な向上が達成されました2。さらに、2細胞期の胚の拡張G2期に発生する主要な接合性ゲノム活性化(ZGA)イベントがあり、これはオープンクロマチン状態に関連しています。これにより、CRISPR-Cas9 RNPと修復テンプレートがゲノムDNAにアクセスしやすくなると推測されます。
私たちの目標は、AAVアプローチと胚エレクトロポレーションを組み合わせて、胚発生の2細胞段階でCRISPR-Cas9 RNPを導入することで、これらすべての観察結果に基づいて構築することでした。この戦略は、AAVのより大きなDNA修復テンプレート送達能力、エレクトロポレーションの技術的容易さ、および胚発生中のゲノムアクセスのためのより最適な2細胞時点を利用して、DNA挿入の標的遺伝子工学のための効率的な方法を作成します。このプロトコルで強調されるように、私達の最大限に活用された方法はmicroinjectionの技術の必要性なしでサイズの1.2から3.0 kbにDNAシーケンスの挿入を運ぶ目標とされたノックインラットモデルの生産を可能にする。
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Protocol
すべての実験手順は、ミズーリ大学の施設動物管理および使用委員会(ACUCプロトコル#25580)によって承認され、実験動物の使用とケアに関するガイドに記載されているガイドラインに従って実施されました。
1. AAVを介したDNA修復テンプレートの送達
- 2つの相同性アームの間に目的のノックイン配列を含むようにDNAコンストラクトを設計します。典型的な相同アームの長さは、長さが300〜500bpである。適切なプラスミドバックボーンにクローニングし、組換え ssAAV1 または ssAAV6(血清型 1 または 6)にパッケージングすることにより、DNA 修復テンプレート全体(相同アーム + 目的のノックイン配列)に逆末端反復配列(ITR)が挟まれていることを確認します。
注:sgRNAの標的配列がDNA修復テンプレートに存在する場合、この配列を破壊するサイレント変異を操作し、CRISPR-Cas9を介した正しく標的対立遺伝子の編集を防ぐことが重要です。
注意:組換えAAVウイルスベクターは非積分であり、BSL-1に分類されます。標準的な無菌技術は、ウイルスに曝露された胚のピペッティングと取り扱いに使用されます。 - 改変したssAAV1またはssAAV6(DNA修復テンプレートと同梱)を30 μLのKSOM-R培地27,28に添加し、35 mmシャーレの鉱油下で最終濃度が3 × 107ゲノムコピー(GC)/μLになるようにします。
- 目に見える前核を有する受精卵を、改変されたssAAVを含むKSOM-R培地に入れます。
注:このプロトコルを使用してAAVの血清型1および6が有効なDNA修理テンプレート配達のために容易に渡れるのでpellucida帯を薄くする必要はありません。 - 37°C、5%CO2 、最大湿度で18〜20時間インキュベートし、十分なウイルス形質導入を可能にします。
2. エレクトロポレーションの準備
- 翌日、100 ng/μL の sgRNA と 100 ng/μL の Cas9 タンパク質を含むエレクトロポレーション混合物を、滅菌 RNase フリーチューブ内の Opti-MEM 培地で希釈します。やさしく混ぜます。
- 室温で10分間インキュベートし、RNPの形成を可能にします。
- インキュベーション時間中に、エレクトロポレーターをオンにし、リード線を1.5mmギャップのスライドガラス電極に接続します。
- エレクトロポレーションパラメータを 表1に記載のとおりに設定します。
3. 2細胞胚エレクトロポレーション
- CRISPRエレクトロポレーション混合物5μLをスライドガラス上の2つの電極の間に静かにピペットで移し、溶液に気泡が入らないように注意します。
- AAV溶液から2細胞期の胚を取り除きます。2細胞期の胚を電極の側面に触れさせないように混合物に並べます。これは溶解を避けるために行われます。
- オームボタンを押してインピーダンスを測定します。インピーダンスが0.100〜0.300kΩであることを確認してください。反応体積はインピーダンスを変化させます(体積を加算してインピーダンスを減少させ、体積を減算してインピーダンスを増加させます)。
- [開始]を押します。このプロセスは完了するまでに数秒かかります。
- エレクトロポレーションの直後に胚を除去し、新鮮な30μL滴のKSOM-R培地で3回洗浄します。
- 胚を5%CO2 、最大湿度の37°Cのインキュベーターに戻し、鉱物油下で500μL滴のKSOM-R培地で in vitro 培養します。あるいは、胚を1.5日分娩後(dpc)の偽妊娠雌ラットに外科的に移植して、生きた子孫を産出します。
図1:CRISPR-Cas9ゲノム編集のためのAAVを介したDNA送達と2細胞胚エレクトロポレーションパイプラインの概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
プロトコルに続いて、2細胞胚がCRISPR-Cas9 RNPでエレクトロポレーションされた後、DNA修復テンプレートの効果的なAAV媒介送達があり、非常に効率的なHDRが可能になります。ビデオに示されているように、エレクトロポレーションプロセスが成功すると、各電極に気泡が形成され(図2C)、インピーダンスは0.100〜0.300kΩの範囲にとどまります。エレクトロポレーション後、胚が膨潤し、透明帯内のペリビテリン腔を埋めることは珍しくありません(図3)。この腫れは、培養で数時間後に治まるはずです。また、2細胞胚をエレクトロポレーションした後に細胞融合現象がごく一部(最大20%)発生することも珍しくありません(図3)。細胞融合は、電極間の垂直軸のアライメントではなく、水平軸のアライメントを慎重に行うことで回避できる可能性があります(図2B)。しかし、私たちは通常、エレクトロポレーションプロセス後に融合した胚を廃棄するだけです。
2細胞胚CRISPR-Cas9 RNPエレクトロポレーション技術を用いたAAVを介したDNA送達は、標的挿入によるノックインラットモデルの作製に非常に効果的であることが証明されています。ラット胚で本法を試験し、培養胚盤胞にloxP部位を含む人工イントロンの挿入をスクリーニングしたところ、次世代配列(NGS)解析に基づき、胚盤胞の60%以上が正しく標的とされたノックイン対立遺伝子を含むことが分かりました(図4)。さらに、生きたノックインラットを作製する方法を検証し、ラットDrd2遺伝子のATG開始部位を標的とするCreリコンビナーゼコード配列を設計するプロジェクトを設計しました。AAVパッケージ化されたDNAドナーテンプレートは、AAVパッケージングに必要なITR配列、5'ホモロジーアーム(長さ422bp)、Cre-pA配列(長さ1,339bp)、および3'ホモロジーアーム(長さ477bp)で構成されていました(図5A)。生まれた11匹の仔のうち、10匹がPCR解析により、ラットDrd2のATG開始部位に正しく挿入されたCre-pA配列が陽性であった(図5B-D)。標的挿入は、後にDNA配列解析によって確認された。7つの異なるプロジェクトの概要として、ホモロジーアームジャンクション全体のPCR解析とDNA配列検証によって決定された創始動物の平均ノックイン成功率76%を達成しました(表2)。
| 電圧 [V] | パルス長 [msec] | パルス間隔 [msec] | # パルス数 | 減衰率 [%] | 極性 | |
| ポーリングパルス | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| 転送パルス | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
表1:エレクトロポレーションパラメータ。 エレクトロポレーション中は、電流制限がオンになっていることを確認します。
図2:2細胞胚エレクトロポレーションプロセス。 (A)スライドガラス電極。(B)CRISPR-Cas9ゲノム編集試薬に懸濁した胚を、エレクトロポレーション前にスライドガラス電極にロードした。(C)エレクトロポレーション中の各電極への気泡形成。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:エレクトロポレーション後の胚の外観。 細胞融合は、エレクトロポレーション後の2細胞胚の最大20%で認められます。胚性細胞は、ペリビテリン腔を埋める透明帯の内部で膨潤することもあります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:培養ラット胚盤胞におけるAAVを介したDNA導入と2細胞胚エレクトロポレーションのノックイン効率。 データは、次世代シーケンシング(NGS)による正しいノックイン対立遺伝子検出に陽性の胚盤胞の割合として示されます。N=28 の胚盤胞 (培養のみの対照群)、N=37 の胚盤胞 (エレクトロポレーション (EP) のみの対照群)、および N=35 の胚盤胞 (AAV+EP 群)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5: Drd2-Creノックインラットモデルの作成。(A)ラット Drd2 遺伝子の標的化。RNP複合体は、コード領域の開始部位を含むエクソン2を標的とするように設計されました。AAVドナーテンプレートには、ウイルスの逆末端反復配列(ITR)、5'および3' のDrd2 遺伝子相同性アーム(HA)、およびpolyA配列を持つCre遺伝子が含まれていました。ドナーテンプレートの組み込みが成功すると、Cre遺伝子3'がエクソン2内の開始部位にノックインされます。これにより、Cre遺伝子が Drd2 プロモーターの制御下に置かれると同時に、 Drd2 遺伝子がノックアウトされます。ノックイン成功の確認に用いるPCRプライマーの位置を紫色の矢印で示しています。(B)ゲノム編集の可能性のある動物(レーンB10-C8)のPCR解析(5'相同性群にまたがるプライマーを使用)。レーンC9:野生型(ネガティブコントロール);レーンC10:テンプレートなし(ネガティブコントロール)。ノックイン陽性動物の予想されるアンプリコンサイズは601bpです。 (C)3'相同性群にプライマーを掛けたゲノム編集の可能性のある動物(レーンD8-E6)のPCR解析。レーンE7:野生型;レーンE8:テンプレートコントロールなし。ノックイン陽性動物の予想されるアンプリコンサイズは676bpです。 (D)Cre遺伝子の検出。予想されるアンプリコンサイズは381bpです。 レーンC7-D5:潜在的な創設者。レーンD6:野生型;レーン D7: テンプレート コントロールなし。PCR反応は、15bp-3kbのアライメントマーカー(緑色で表示)を用いたキャピラリー電気泳動で分析しました。QX DNAサイズマーカーは、塩基対(bp)単位のPCRアンプリコンサイズに対応するピークサイズで、各画像の左側に示されています。この図は、参考文献24の許可を得て変更しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| プロジェクトの説明 | ノックイン陽性の子孫(%) |
| Oprm1-P2A-FLP (1.7 kb 挿入) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (1.3 kb 挿入) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (1.3 kb 挿入) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (1.3 kb 挿入) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (1.2 kb 挿入) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP(1.4 kb挿入) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3.1 kb 挿入) | 5/7 (71%) |
表2:ノックインモデルの成功率
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Discussion
CRISPR-Casゲノム編集システムは、さまざまな動物種において、単純な遺伝子組み換えと複雑な遺伝子組み換えの両方を効率的に生産できるようにすることで、遺伝子工学の分野に革命をもたらしました。ゲノム編集に関連する技術の頻繁な改良と改善により、その汎用性はさらに高まっています。ここでは、ssAAVを介したDNA送達と、CRISPR-Cas9試薬の2細胞胚エレクトロポレーションを2細胞げっ歯類胚に用いる新しいアプローチについて説明しました。我々は、これが標的ノックイン動物モデルを作製する有効な方法であることを実証した。
AAVを使用する主な利点は、マイクロインジェクション技術を必要とせずに、より大きなDNA修復テンプレートを胚に送達できることです。また、AAVを介した送達は、エレクトロポレーション単独によるDNAテンプレートのサイズ制限をある程度回避するのに役立ちます。ただし、AAV を使用する際には、いくつかの重要な考慮事項があります。受精卵を取り囲む硬化した糖タンパク質マトリックスである透明帯は、核酸の送達を複雑にすることが多い物理的な障壁として機能します。透明帯の薄化は、胚へのアクセスを改善するために使用される一般的な技術です。しかし、いくつかの研究では、AAV感染前に透明帯が薄くなった胚における高用量(1 × 107 GC / μLから1 × 109 GC / μL)AAVの感染によって胚の発達が妨げられることが報告されています22。しかし、透明帯全体に拡散する可能性のあるAAVの血清型がいくつかあります29。私たちのプロトコルは、透明帯の間伐を伴わず、血清型1および6のAAVを3 × 107 GC / μlの濃度で使用して、以前に公開されたレポートよりも高いノックイン率を達成します。これらの条件下では、胚発生の減少は認められなかった。
2細胞胚のエレクトロポレーションによって達成される高いノックイン効率は、発生のこの段階で胚のG2期が延長されているためである可能性が高く、エレクトロポレーションを行うのに最適な発達段階です。しかし、潜在的な合併症の1つは、エレクトロポレーションプロセス中に一部の2細胞胚に見られる細胞融合です。この観察は、電気融合手順が哺乳類細胞の融合に一般的に使用され、融合は、電極間の垂直軸位置合わせではなく垂直軸位置合わせによって潜在的に回避され得ることを考えると、驚くべきことではない30,31。さらに、ゲノム編集が1細胞ではなく2細胞など、発生の後期に行われると、モザイク現象が増加する可能性が高くなります。2細胞エレクトロポレーション法を用いたところ、1細胞期では前核注入と比較してモザイク現象がわずかに増加した(AAVアプローチで86%、PNIアプローチで67%)が観察されましたが、それでも試験したすべての創始動物で改変対立遺伝子の生殖細胞伝達を達成することができました。もう1つの潜在的な懸念は、AAV由来のDNAテンプレートのタンデム連結統合の可能性です。このプロトコルに記載されているモデルに対してロングリードシーケンシングは行わなかったが、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)コピー数多型を用いて、すべてのモデルでDNAテンプレートの単一統合を確認した。
最後に、我々の手法では目的のDNA配列をAAVで送達しましたが、胚の遺伝子操作に成功するために、胚エレクトロポレーションと組み合わせて他のウイルスおよび非ウイルスを介したDNA送達アプローチを使用することが可能であるはずです。結論として、ssAAVを介したDNA送達とCRISPR-Cas9 RNPのエレクトロポレーションを2細胞期胚に組み合わせることは、ノックインラットモデルを効率的に作製するための効率的で適応性の高い方法です。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者は、ビデオ撮影とビデオ編集の支援をしてくれたノーラン・デイビスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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