Summary
Detta protokoll presenterar ett optimerat tillvägagångssätt för att producera genetiskt modifierade råttmodeller. Adeno-associerat virus (AAV) används för att leverera en DNA-reparationsmall, och elektroporering används för att leverera CRISPR-Cas9-reagenser för att slutföra genomredigeringsprocessen i 2-cellsembryo.
Abstract
Genomredigeringsteknik används i stor utsträckning för att producera genetiskt modifierade djur, inklusive råttor. Cytoplasmatisk eller pronukleär injektion av DNA-reparationsmallar och CRISPR-Cas-reagenser är den vanligaste leveransmetoden till embryon. Denna typ av mikromanipulation kräver dock tillgång till specialutrustning, är mödosam och kräver en viss nivå av teknisk skicklighet. Dessutom leder mikroinjektionstekniker ofta till lägre embryoöverlevnad på grund av den mekaniska påfrestningen på embryot. I detta protokoll utvecklade vi en optimerad metod för att leverera stora DNA-reparationsmallar för att fungera tillsammans med CRISPR-Cas9-genomredigering utan behov av mikroinjektion. Detta protokoll kombinerar AAV-medierad DNA-leverans av enkelsträngade DNA-donatormallar tillsammans med leverans av CRISPR-Cas9-ribonukleoprotein (RNP) genom elektroporering för att modifiera 2-cellsembryon. Med hjälp av denna nya strategi har vi framgångsrikt producerat riktade knock-in-råttmodeller som bär insättning av DNA-sekvenser från 1,2 till 3,0 kb i storlek med effektivitet mellan 42 % och 90 %.
Introduction
Utvecklingen av CRISPR-baserade genredigeringsverktyg har påskyndat vår förmåga att effektivt generera nya och mer sofistikerade genetiskt modifierade råttmodeller. Enkelstyrt RNA, tillsammans med Cas9-nukleas, kombineras för att bilda ribonukleoproteinkomplex (RNP) som riktar sig mot DNA-sekvenser av intresse inom genomet och resulterar i dubbelsträngade DNA-brott. Eftersom cellulära DNA-reparationsmekanismer är felbenägna, introduceras insättningar och deletioner (INDEL) under reparationsprocessen som kan störa en målgens funktion. När det finns samleverans av en önskad konstruerad DNA-sekvens (reparationsmall) tillsammans med genomredigeringsreagenser, sker insättning av reparationsmallen i regionen som innehåller det dubbelsträngade DNA-brottet genom en process som kallas homologiriktad reparation (HDR). Detta är en effektiv strategi för att generera djurmodeller med riktade DNA-insättningar/substitutioner (knock-ins). En begränsning är att knock-in-sekvenser ofta är stora i storlek, vilket har visat sig minska genredigeringseffektiviteten, vilket gör det svårare att generera den önskade modellen1. Strategier för att öka knock-in-effektiviteten har inkluderat linjärisering av både dubbelsträngat DNA (dsDNA) och enkelsträngat DNA (ssDNA) reparationsmallar och kemisk modifiering av DNA-reparationsmallar 2,3,4. Dessutom har pronukleär mikroinjektion tillsammans med HDR-stimulerande föreningar, applicering av elektriska pulser i samband med mikroinjektion och tidsinställd mikroinjektion i 2-cellsembryon alla försökts 5,6,7. Trots framgången med vissa av dessa metoder är det fortfarande tekniskt svårt att införliva DNA-sekvenser som är större än 1,0 kb.
Elektroporering, som är en vanlig metod för att föra in reagenser i odlade cellinjer, erbjuder ett alternativ till mikroinjektion för att leverera CRISPR-Cas9-komponenter till embryon. Embryoelektroporering, som först demonstrerades i råttembryon8, har sedan dess framgångsrikt använts som leveransmetod i möss 9,10,11,12,13, grisar 14,15 och andra djurmodellorganismer 16,17,18. Embryon, suspenderade i mediet som innehåller CRISPR-Cas9-reagenser, placeras i en kyvett eller på en glasskiva mellan två elektroder och utsätts för direkta pulser av elektrisk ström. Detta skapar övergående öppningar i zona pellucida och embryots plasmamembran genom vilka CRISPR-Cas9-komponenterna kommer in i embryona. Vanligtvis används elektriska "poring"-pulser på mellannivå för att skapa de tillfälliga öppningarna följt av elektriska "överföringspulser" på lägre nivå som underlättar rörelsen av de negativt laddade genomredigeringskomponenterna. Embryoelektroporering är effektiv, har hög genomströmning och är lätt att utföra. Men medan embryoelektroporering har visat sig vara mycket framgångsrik för införandet av små (<200 bp) ssDNA-reparationsmallar, finns det få rapporter om framgångsrik elektroporering av större (>1,0 kb) reparationsmallar13,19. Denna storleksbegränsning utgör en stor begränsning av embryoelektroporering för att generera knock-in-djurmodeller som kräver stora insättningar.
I samband med genterapi har adenoassocierade virus (AAV) länge använts som bärare av genetiskt material på grund av deras effektiva infektionsförmåga in vivo av både delande och icke-delande celler, brist på patogenicitet och sällsynt genomisk integration20,21. Nyligen har fler studier kombinerat AAVs med CRISPR-Cas9-teknik för att introducera DNA-reparationsmallar och CRISPR-reagenser 22,23,24. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att leverera större DNA-reparationsmallar utan behov av mikroinjektionstekniker.
HDR-vägen är mer aktiv i de sena S- och G2-faserna av cellcykeln25,26. I studier utförda in vitro uppnåddes signifikanta ökningar av knock-in-effektiviteten genom tillförsel av CRISPR-Cas9 RNP:er och DNA-reparationsmallar till G2-synkroniserade celler eller genom begränsning av närvaron av Cas9-protein till sena S- och G2-faser med hjälp av ett Cas9-Geminin-fusionsprotein2. Dessutom finns det en stor zygotisk genomaktivering (ZGA) som inträffar under den förlängda G2-fasen av embryot i 2-cellsstadiet, och detta är associerat med ett öppet kromatintillstånd. Det spekuleras i att detta ger CRISPR-Cas9 RNP:er och reparationsmallar större tillgänglighet till det genomiska DNA:t.
Vårt mål var att bygga vidare på alla dessa observationer genom att kombinera AAV-metoden med embryoelektroporering för att introducera CRISPR-Cas9 RNP i 2-cellsstadiet av embryoutvecklingen. Denna strategi drar nytta av den större leveranskapaciteten för DNA-reparationsmallen hos AAV, den tekniska lättheten med elektroporering och den mer optimala 2-cellstidpunkten för genomisk tillgänglighet under embryoutveckling för att skapa en effektiv metod för riktad genmodifiering av DNA-insättningar. Som framgår av detta protokoll möjliggör vår optimerade metod produktion av riktade knock-in-råttmodeller som bär insättningar av DNA-sekvenser från 1,2 till 3,0 kb i storlek utan behov av mikroinjektionstekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer godkändes av University of Missouris Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC-protokoll #25580) och utfördes enligt de riktlinjer som anges i Guide for the Use and Care of Laboratory Animals.
1. Leverans av AAV-medierad DNA-reparationsmall
- Designa DNA-konstruktionen så att den innehåller den önskade knock-in-sekvensen mellan två homologiarmar. Typiska homologiarmlängder är 300-500 bp långa. Se till att hela DNA-reparationsmallen (homologiarmar + önskad knock-in-sekvens) flankeras av inverterade terminalupprepningar (ITR) genom kloning till en lämplig plasmidryggrad och förpackning till rekombinant ssAAV1 eller ssAAV6 (serotyp 1 eller 6).
OBS: Om sgRNA-målsekvensen finns i DNA-reparationsmallen är det viktigt att konstruera tysta mutationer för att störa denna sekvens och därmed förhindra CRISPR-Cas9-medierad redigering av den korrekt riktade allelen.
VARNING: Rekombinanta AAV-virusvektorer är icke-integrerande och klassificerade som BSL-1. Aseptiska standardtekniker används för pipettering och hantering av embryon som har exponerats för virus. - Tillsätt specialtillverkad ssAAV1 eller ssAAV6 (förpackad med mall för DNA-reparation) till 30 μl KSOM-R-medium27,28 till en slutlig koncentration av 3 × 107 genomkopior (GC)/μl under mineralolja i en petriskål med 35 mm.
- Placera zygoter med synliga kärnor i KSOM-R-mediet som innehåller konstruerad ssAAV.
OBS: Med hjälp av detta protokoll finns det inget behov av att tunna ut zona pellucida eftersom AAV-serotyperna 1 och 6 lätt kan passera igenom för effektiv leverans av DNA-reparationsmallar. - Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 och maximal luftfuktighet i 18-20 timmar för att möjliggöra tillräcklig virustransduktion.
2. Förberedelse av elektroporering
- Följande dag görs en elektroporeringsblandning innehållande 100 ng/μl sgRNA och 100 ng/μl Cas9-protein utspätt i Opti-MEM-media i ett sterilt RNasfritt rör. Blanda försiktigt.
- Inkubera i rumstemperatur i 10 minuter för att möjliggöra RNP-bildning.
- Under inkubationstiden, slå på elektroporatorn och anslut ledningarna till en 1.5 mm glasglidelektrod.
- Ställ in elektroporeringsparametrar enligt beskrivningen i tabell 1.
3. Elektroporering av 2-cells embryo
- Pipettera försiktigt 5 μL av CRISPR-elektroporeringsblandningen mellan de två elektroderna på glasglaset och var noga med att inte föra in luftbubblor i lösningen.
- Ta bort embryot i 2-cellsstadiet från AAV-lösningen. Rada upp embryon i 2-cellsstadiet i blandningen utan att låta dem vidröra elektrodernas sidor. Detta görs för att undvika lys.
- Tryck på Ohm-knappen för att mäta impedansen. Kontrollera att impedansen är mellan 0.100 och 0.300 kΩ. Reaktionsvolymen kommer att ändra impedansen (lägg till volym för att minska impedansen och subtrahera volymen för att öka impedansen).
- Tryck på Start. Processen tar några sekunder att slutföra.
- Ta ut embryon omedelbart efter elektroporeringen och tvätta 3 gånger i färska 30 μL droppar KSOM-R-media.
- Placera embryona i en inkubator vid 37 °C med 5 %CO 2 och maximal luftfuktighet för in vitro-odling i 500 μL droppar KSOM-R-media under mineralolja. Alternativt kan embryon kirurgiskt överföras till en 1,5-dagars post coitum (dpc) pseudogravid honråtta för att producera levande avkomma.
Figur 1: Schematisk bild av AAV-medierad DNA-leverans och 2-cells embryoelektroporeringspipeline för CRISPR-Cas9-genomredigering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollet finns det effektiv AAV-medierad leverans av DNA-reparationsmallen, vilket möjliggör mycket effektiv HDR efter att 2-cellsembryon har elektroporerats med CRISPR-Cas9 RNP. Som visas i videon resulterar en framgångsrik elektroporeringsprocess i att bubblor bildas på varje elektrod (figur 2C) och impedansen förblir inom intervallet 0,100 och 0,300 kΩ. Efter elektroporering är det inte ovanligt att embryon sväller och fyller perivitellinutrymmet inuti zona pellucida (Figur 3). Denna svullnad bör avta efter några timmar i odling. Det är inte heller ovanligt att se en liten andel (upp till 20 %) av cellulära fusionshändelser efter elektroporering av 2-cellsembryon (Figur 3). Cellulär fusion kan potentiellt undvikas genom noggrann horisontell axelinriktning snarare än vertikal axelinriktning mellan elektroderna (figur 2B). Men vi kasserar vanligtvis bara alla sammansmälta embryon efter elektroporeringsprocessen.
Vår AAV-medierade DNA-leverans med 2-cells embryo CRISPR-Cas9 RNP-elektroporeringsteknik har visat sig vara mycket effektiv för att generera knock-in-råttmodeller med riktade insättningar. När vi testade vår metod i råttembryon och screenade odlade blastocyster för att sätta in en konstruerad kort konstgjord intron som innehåller loxP-platser, noterade vi att över 60 % av blastocysterna innehöll den korrekt riktade knock-in-allelen baserat på analys av Next Generation Sequence (NGS) (figur 4). Vidare, genom att testa vår metod för att producera levande knock-in-råttor, utformade vi ett projekt för att konstruera en Cre-rekombinaskodningssekvens riktad mot ATG-startplatsen för råttans Drd2-gen. Den AAV-förpackade DNA-donatormallen bestod av ITR-sekvenser som krävs för AAV-paketering, en 5'-homologiarm (422 bp lång), en Cre-pA-sekvens (1 339 bp lång) och en 3'-homologiarm (477 bp lång) (figur 5A). Av de 11 avkommor som föddes var 10 positiva vid PCR-analys för den korrekt insatta Cre-pA-sekvensen i ATG-startstället för råtta Drd2 (Figur 5B-D). Den riktade insättningen bekräftades senare genom DNA-sekvensanalys. Som en sammanfattning över 7 olika projekt har vi uppnått en genomsnittlig knock-in-framgångsfrekvens på 76 % hos grundardjur, vilket bestäms av PCR-analys över homologiarmkorsningar och DNA-sekvensverifiering (tabell 2).
| Spänning [V] | Pulslängd [msek] | Pulsintervall [msek] | # av baljväxter | Förfallshastighet [%] | Polaritet | |
| Poring Puls | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| Överför puls | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
Tabell 1: Parametrar för elektroporering. Se till att strömgränsen är PÅ under elektroporationen.
Figur 2: Elektroporering av 2-celligt embryo. (A) Glaselektrod. B) Embryon suspenderade i CRISPR-Cas9-reagenser för genomredigering och laddade i glasslideelektroden före elektroporering. (C) Luftbubbelbildning på varje elektrod under elektroporering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Embryots utseende efter elektroporering. Cellulär fusion noteras i upp till 20 % av 2-cellsembryon efter elektroporering. Embryonala celler kan också svälla inuti zona pellucida och fylla perivitellinutrymmet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: AAV-medierad DNA-leverans och 2-cells embryoelektroporering knock-in-effektivitet i blastocyster från odlingsråttor. Data presenteras som procentandel blastocyster som är positiva för korrekt knock-in-alleldetektion med Next Generation Sequencing (NGS). N=28 blastocyster (kontrollgrupp med enbart odling), N=37 blastocyster (kontrollgrupp med elektroporering (EP)) och N=35 blastocyster (AAV+EP-grupp). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Skapande av en Drd2-Cre knock-in råttmodell. (A) Inriktning på Drd2-genen hos råtta. RNP-komplexet utformades för att rikta in sig på Exon 2 som innehåller kodningsregionens startplats. AAV-donatormallen innehöll virala inverterade terminala upprepningssekvenser (ITR), 5'- och 3'Drd2-genhomologiarmar (HA) och Cre-genen med en polyA-sekvens. Framgångsrik integration av donatormallen knackar i Cre-genen 3' till startplatsen i Exon 2. Detta sätter Cre-genen under kontroll av Drd2-promotorn samtidigt som Drd2-genen slås ut. Placeringen av PCR-primers som används för att bekräfta framgångsrik knock-in indikeras med lila pilar. (B) PCR-analys av potentiellt genomredigerade djur (banorna B10-C8) med primers som spänner över 5'-homologiarmen. Körfält C9: vildtyp (negativ kontroll). Körfält C10: ingen mall (negativ kontroll). Förväntad amplikonstorlek för knock-in-positiva djur är 601bp. (C) PCR-analys av potentiellt genomredigerade djur (Lanes D8-E6) med primers som spänner över 3'-homologiarmen. Körfält E7: vildtyp; Körfält E8: ingen mallkontroll. Förväntad amplikonstorlek för knock-in-positiva djur är 676 bp. (D) Påvisande av Cre-genen. Förväntad ampliconstorlek är 381 bp. Lanes C7-D5: potentiella grundare; Körfält D6: vildtyp; Körfält D7: ingen mallkontroll. PCR-reaktioner analyserades med kapillärelektrofores med 15bp-3kb inriktningsmarkörer (indikerade i grönt). QX DNA-storleksmarkören visas till vänster om varje bild med toppstorlek som motsvarar PCR-amplikonstorleken i baspar (bp). Denna siffra är modifierad med tillstånd från referens24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Beskrivning av projektet | Avkomman positiv för knock-in (%) |
| Oprm1-P2A-Flp (1,7 kb insättning) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (1,3 kb införande) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (1,3 kb insättning) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (1,3 kb införande) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (1,2 kb insättning) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP (1,4 kb insättning) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3.1 kb insättning) | 5/7 (71%) |
Tabell 2: Framgångsfrekvens för knock-in-modeller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas-systemet för genredigering har revolutionerat gentekniken genom att möjliggöra effektiv produktion av både enkla och komplexa, skräddarsydda genetiska modifieringar i en mängd olika djurarter. Frekventa förfiningar och förbättringar av tekniker i samband med genomredigering ytterligare gör den mångsidigare. Här har vi beskrivit ett nytt tillvägagångssätt som använder ssAAV-medierad DNA-leverans tillsammans med 2-cells embryoelektroporering av CRISPR-Cas9-reagenser till 2-cells gnagarembryon. Vi har visat att detta är ett effektivt sätt att ta fram riktade knock-in-djurmodeller.
En stor fördel med att använda AAV är att det möjliggör leverans av större DNA-reparationsmallar till embryon utan behov av mikroinjektionstekniker. AAV-medierad leverans hjälper också till att i viss mån kringgå DNA-mallens storleksbegränsningar för enbart elektroporering. Det finns dock några viktiga överväganden när du använder AAV. Zona pellucida, den härdade glykoproteinmatrisen som omger det befruktade ägget, fungerar som en fysisk barriär som ofta komplicerar leveransen av nukleinsyror. Gallring av zona pellucida är en vanlig teknik som används för att bättre komma åt embryot. Vissa studier har dock rapporterat att embryoutvecklingen hindras av infektion med högre doser (1 × 107 GC/μL till 1 ×10 9 GC/μL) AAV hos embryon där zona pellucida tunnades ut före AAV-infektion22. Det finns dock vissa serotyper av AAV som kan diffundera över zona pellucida29. Vårt protokoll innebär inte förtunning av zona pellucida och använder AAV med serotyperna 1 och 6 i en koncentration på 3 ×10 7 GC/μl för att uppnå knock-in-frekvenser som är högre än tidigare publicerade rapporter. Vi noterade inte minskad embryoutveckling under dessa förhållanden.
Den höga knock-in-effektiviteten som uppnås genom elektroporering av 2-cellsembryon beror sannolikt på den förlängda G2-fasen i embryon i detta utvecklingsstadium, vilket gör detta till ett optimalt utvecklingsstadium för att utföra elektroporering. En potentiell komplikation är dock den observerade cellulära fusionen som ses i vissa 2-cellsembryon under elektroporeringsprocessen. Denna observation är inte förvånande med tanke på att elektrofusionsprocedurer ofta används för att smälta samman däggdjursceller och fusion potentiellt kan undvikas genom noggrann horisontell snarare än vertikal axelinriktning mellan elektroderna30,31. Dessutom, när genomredigering sker i ett senare skede av utvecklingen, såsom 2-cell snarare än 1-cell, finns det större potential för ökad mosaicism. Med hjälp av vår 2-cellselektroporeringsmetod observerade vi en liten ökning av mosaicism jämfört med pronukleär injektion (86 % för AAV-metoden och 67 % för PNI-metoden) i ett 1-cellsstadium, men kunde fortfarande uppnå överföring av den modifierade allelen i alla testade grundardjur. Ett annat potentiellt problem är möjligheten till tandemkonkatemintegration av AAV-härledda DNA-mallar. Även om vi inte utförde long-read-sekvensering för de modeller som beskrivs i detta protokoll, bekräftade vi enkel integration av DNA-mallarna för alla modeller med hjälp av droplet-digital PCR (ddPCR) kopienummervariation.
Slutligen, även om vår metod involverade AAV-leverans av DNA-sekvenser av intresse, bör det vara möjligt att använda andra virala och icke-virala medierade DNA-leveransmetoder i kombination med embryoelektroporering för att framgångsrikt genetiskt manipulera embryon. Sammanfattningsvis är kombinationen av ssAAV-medierad DNA-leverans och elektroporering av CRISPR-Cas9 RNP:er till embryon i 2-cellsstadiet en effektiv och lätt anpassningsbar metod för att effektivt generera knock-in råttmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Nolan Davis för hjälp med videografi och videoredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
